抽象的
吸烟的儿童因原因很大程度上未知,母亲的风险增加了发展哮喘的风险。实验性哮喘模型研究了妊娠期妊娠期间孕产妇吸烟,过敏气道炎症和后代过敏性。
在概念前3周暴露于新鲜空气或香烟烟雾直至出生。后代在出生后5至第10周,每周4次暴露于房屋粉尘(HDM)或PBS,每周四次。
母亲吸烟增加了气道平滑肌层,胶原III沉积和HDM诱导的后代狗丝细胞数。它还增加了甲素响应性,随着气道平滑肌层和胶原沉积而显着相关。母亲吸烟增加了HDM诱导的肺组织中嗜中性粒细胞和肥大细胞数。没有观察到进一步的效果。
妊娠期间吸烟会在小鼠后代进行气道重塑,这可能有助于增加甲素反应性。这种情况发生,无论过敏原暴露如何,但可能会使过敏刺激的结果恶化,导致房屋粉尘螨虫在吸烟母亲的粉尘中较高的甲素反应性,当与非莫斯莫斯母亲相比。结果提供了母亲吸烟和哮喘之间的关联之后的可能机制。
妊娠期间的孕产妇吸烟已被证明可以增加医生诊断的哮喘和童年期间喘息,并且一些研究报告称这是独立于产后烟雾暴露的1那2.此外,北美和几个欧洲国家的两项大型研究表明,妊娠期间的母亲吸烟与肺功能降低有关3.那4.,母亲在怀孕期间吸烟是16岁时哮鸣的一个强有力和显著的独立预测因子5..这些研究主要报告0-18年代的儿童和青少年的影响。怀孕期间的孕产妇吸烟也会影响成年期内的哮喘的发展并不肯定,但它增加了吸烟青少年的这种风险6..
婴儿哮喘发育风险增加的机制,暴露于妇幼的烟草吸烟在子宫内在很大程度上是未知的。几项研究表明,妊娠期间的母亲吸烟对免疫系统开发产生影响7.-9.,肺部发育和后代肺功能。
关于肺的发育,在子宫内大鼠的烟雾暴露减少了数量并增加了后代肺泡的大小10而在恒河猴身上在子宫内接触尼古丁增加了大气道和血管周围的胶原沉积11.在胎儿寿命的最后三个月暴露于母亲尼古丁的羊羔以暗示较小的气道和/或更小或更静肺的方式发育肺功能12.此外,吸烟儿童的内气道壁厚较高相对来自患有婴儿死亡综合症的儿童的非莫斯莫氏母亲;由于肺重塑的证据在子宫内人类暴露在烟雾中也得到了证实13.
目前的作者出发了进一步解开的后果在子宫内通过研究屋尘螨(HDM)诱导的气道重塑(平滑肌层厚度、III型胶原沉积和杯状细胞增生),研究卷烟烟雾暴露对过敏性气道炎症发展的易感性。(T-helper type 2 (Th2) cytokine和炎性细胞)和methachine (MCh)对吸烟母亲的成年后代的反应。
方法
动物
8-10周龄的女性和雄性Balb / c小鼠是从Harlan(Horst,荷兰)获得的。提供标准的食物和水自由,灯设置为12/12 H光/暗循环。所有动物议定书都由当地动物实验委员会(格罗宁根大学,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学)批准,并在严格的政府和国际动物实验指导下进行。
香烟烟雾曝光
主流卷烟烟雾是由肯塔基州大学烟草和卫生研究所的烟雾曝光系统产生的,如前所述类似于活跃的吸烟,如前所述14.每周5天,每天暴露于新鲜空气或仅婴儿吸烟会的雌性小鼠。吸烟课程从2R1参考卷烟(肯塔基州大学)开始了两次困境,每天增加,直到3周后达到每次24次泡芙。然后女性被成对地引入一个男性以引起概念。烟雾暴露在妊娠总期间保持不变。在后代出生后,母亲及其后代没有暴露在香烟烟雾中。选择2R1参考香烟是因为高焦油和尼古丁含量选择,因为可以使用这些香烟诱导肺气肿14.
后代抗原给药
幼崽与母崽同窝,直到断奶期结束(3周)。然后将雄性和雌性幼鼠分开(每笼8只)。后代(每组8只母犬和8只公犬)轻度麻醉(氧吸入异氟醚)并暴露于PBS或纯化的全身HDM提取物(Dermatophagoides Pteronyssinus.;Greer Laboratories,Lenoir,NC,USA)鼻内(10μlPBS中的25μg)诱导过敏气道炎症,每周从第5周下的四次,出生后10周。
评估MCH响应性
通过使用全身体积描记法(Buxco Electronics,Petersfield,UK)在目前的作者组(Buxco Electronics,Petersfield,UK)中的增强暂停(PENH)在最后一次过敏原暴露后24小时评估24小时后的响应性24小时。15.使用这项技术的一个优点是,它允许在同一只老鼠的肺组织经过这个程序后进行详细的免疫组化。
组织和血液采集
在10周龄在麻醉下在麻醉下处死小鼠。心脏穿刺血液拍摄。两种最小的右肺裂片被捕获冷冻,为多重ELISA进行冷冻,两个最大的右肺裂片被免疫组化冷冻,左肺叶片固定并嵌入石蜡中,用于免疫组化。
细胞因子
在均化中测量白细胞介素(IL)-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)的浓度使用星座软件(Applied Cytorm Systems,Sheffielm,英国)的Luminex 100系统,用多路复用ELISA系统(Lincoplex Systems,ST Charles,Mo,USA)的肺组织在Luminex 100系统上。
Eotaxin的测定采用ELISA试剂盒(R&D, Minneapolis, MN, USA),按制造商描述的方法进行。
组织学
将冷冻肺切片从副腔和膈肌的腹端(凸侧)沿尾部颅轴进行(图1⇓).切片时,小/中间气道存在,而大软骨气道在断面上完全或大部分缺失。石蜡包埋的肺切片沿左肺叶中段,距背腹轴45度(排除靠近肺门的大软骨支气管)。当小/中间气道存在,大软骨气道完全或大部分缺失时,切片。
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/5/1133/F1.medium.gif)
肺叶抽样。1:气管;2:hylus;3:顶点;4:心脏叶;5:难谷;6:隔膜叶;7:左叶。·················平面。
用二氨基联苯胺(Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands)或大鼠抗GR1单克隆抗体(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)分别对4 μm肺组织冷冻切片中的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞进行染色,以检测其抗氰化物内源性过氧化物酶活性。使用Leica Qwin图像分析软件(Leica Microsystems, Rijswijk, Netherlands)进行形态学分析,计算嗜酸性粒细胞的体积百分比。
3 μm石蜡包埋的肺组织切片用甲苯胺蓝染色检测肥大细胞。在全肺切片中手工计数肥大细胞和中性粒细胞。组织面积通过形态学分析进行量化,每mm表达细胞数2肺组织。
用周期酸席夫(PAS)在3μm石蜡包埋的切片中染色脚卵细胞,并且手动计算截面中的所有PAS阳性细胞。确定截面中的所有气道(在气道上皮的基底)的长度,并且每MM气道表示PAS阳性细胞的总数。
胶原蛋白III和气道平滑肌层染成4μm冷冻肺部,用多克隆山羊抗型-III胶原蛋白抗体(SBA,伯明翰,AL,USA)和单克隆小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(抗α-SMA)分别为SMA)抗体(Progen Biotechnik,Heidelberg,德国)。通过形态学分析在总肺部分析中量化胶原III和α-SMA存在于总肺部的情况下量化。阳性染色组织的表面表示为mm2每个MM气道在总肺部。在实质中染色并直接与血管相邻的血管被排除在测量之外。
如果存在软骨性气道,则从所有分析中排除。每个分析都是由同一个观察者盲法进行的。
hdm特异性血清免疫球蛋白E的测定
使用ELISA测量HDM特异性血清免疫球蛋白(Ig)E.用大鼠抗小鼠IGE(BD Biosciences)涂覆平底96孔板过夜。加入血清样品(稀释1:10)并孵育2小时。加入了生物素化的HDM,并加入辣根过氧化物酶 - 缀合的链霉抗生物素蛋白(DAKO,Glostrup,丹麦)加入30分钟。使用四甲基苯胺基底物(Sigma Aldrich),停止,用VarioScan ELISA读取器(Thermo Scientific,Breda,Netherlands),在450nm中读取光密度。通过校正血清样品的稀释因子的光密度,HDM特异性IgE水平被表达为任意ELISA单元。
统计分析
当残差不是正态分布时,适当的对数10或1 /X执行数据的转换。用多元线性回归模型研究了妊娠期间吸烟效果的相互作用及HDM暴露的影响。多元线性回归分析可以区分正相互作用和负相互作用。显着的阳性相互作用(分析中发现的唯一相互作用类型)意味着HDM暴露的效果在吸烟母亲的后代越来越大。
没有发现任何相互作用时,用线性回归分析分别评估怀孕期间吸烟的影响和HDM的效果。为了评估子组之间的差异,用Kolmogorov-Smirnov和数据常规测试数据进行亚组中数据的正常分布。当根据这些测试通常分布数据时,用双面独立样品(未配对)T检验测试子组之间的差异。当数据不是通常分布时,使用双面曼诺 - 惠特尼U-Tests。
使用Spearman的Rho建立参数之间的相关性。为了进一步评估MCH响应性的预测因素,与MCH的浓度独立相关的参数,诱导PENH(PC300)被识别,随后用于解释PC中的变异性的逐步线性回归模型300.值p<0.05被认为是显著的。
结果
母亲在怀孕期间吸烟会导致后代气道重塑
妊娠期间的孕产妇吸烟和HDM曝光独立增加了气道平滑肌层的厚度(图2A⇓;无花果。 3a⇓和b)以及来自后代的气道周围胶原的沉积(图2b⇓).
PBS或尘螨(HDM)暴露的后代、非吸烟母亲(NSM)和吸烟母亲(SM)对肺组织的重塑表现为:a)气道周围平滑肌层厚度;b)气道周围胶原III沉积;c)气道杯状细胞增生。*:P <0.05;Arunachal Pradesh,: p < 0.01;***: p < 0.001;从子群分析。#: p < 0.01;(SM效应);从线性回归分析。a) HDM效应(NSM组和SM组):线性回归分析p<0.001。b) HDM效应(NSM组和SM组):线性回归分析p = 0.002。c) SM和HDM效应的交互作用:线性回归分析p = 0.038。“HDM效应”表明两个pbs暴露组之间存在差异相对HDM暴露的群体。“SM效果”表示NSM组之间的差异相对两个SM组。“相互作用”表明HDM的效果在SM的后代中更大。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/5/1133/F3.medium.gif)
免疫组化染色显示a)不吸烟母亲和b)吸烟母亲的后代肺组织中气道周围的气道平滑肌(红色)。比例尺= 100 μm。
分析了杯状细胞的数量作为气道重塑的附加特征。HDM曝光增加了气道中的脚杯细胞的数量(图2C⇑),吸烟母亲在吸烟母亲的后代更强壮的效果(在怀孕期间吸烟的影响与HDM暴露之间的显着相互作用)。
妊娠期间的孕产妇吸烟会增加后代的母亲响应性
HDM暴露在吸烟和非莫斯莫氏母亲的后代诱导PENH的大幅增加,由PENH(气道高光反应性的无单位指数)曲线计算(图4A⇓).
从非莫斯母亲(NSM;开放符号)或吸烟母亲(SM;封闭符号)或吸烟的后代暴露于PBS(圆圈)或房屋粉尘(HDM;三角形)的后代的反应性。表达为:a)增强暂停(PENH);b)浓度的MCH诱导PENH(PC)增加300%300).c) PC的相关性300有气道平滑肌层。*:P <0.05;Arunachal Pradesh,: p < 0.01;***: p < 0.001;从子群分析。#:P <0.001(SM效应)从线性回归分析。a)HDM效应(NSM和SM组):P <0.05来自线性回归分析。b)HDM效应(NSM和SM组):P <0.001来自线性回归分析。c)rho -0.62,p <0.001。“HDM效应”表明两个pbs暴露组之间存在差异相对HDM暴露的群体。“SM效果”表示NSM组之间的差异相对两个SM组。
怀孕期间的孕产妇吸烟会增加后代的母亲响应性,如下降的PC所示300(图4B⇑).这种增加的MCH响应性与HDM暴露无关。暴露于HDM的后代有一个较低的PC300比暴露在PBS环境下的后代的PC产量最低300在吸烟母亲接触hdm的后代中个人电脑300与气道平滑肌层厚度相反(图4C⇑)和胶原III沉积(rho -0.62,p <0.001和rho -0.41,p = 0.001)。
母亲妊娠期间吸烟对后代hdm诱导的炎症细胞和细胞因子的影响
HDM暴露增加了吸烟母亲的后代肺组织中中性粒细胞和肥大细胞的数量,但不吸烟母亲的没有增加。HDM暴露增加了肺组织中的嗜酸性粒细胞,与母亲吸烟无关(表1)⇓).
通过线性回归研究,孕期吸烟对肺细胞因子没有影响(表2)⇓).HDM暴露在肺匀浆中提高IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-13,IL-17和TNF的水平,而IFN-γ和IL-10水平降低。特别地,HDM暴露后强烈上调IL-17,其与肺组织中的中性粒细胞(RHO 0.51,P = 0.003)和嗜酸性粒细胞数(RHO 0.75,P <0.001)和嗜酸性素水平(RHO 0.61,P <0.001)相关。
HDM暴露后血清的HDM特异性IgE水平增加,没有母体吸烟状态的显着影响(数据未显示)。
解释后代MCH响应性变异性的参数
为了进一步评估观察到的增加的重塑是否可以提高MCH响应性增加,首先确定是否与PC独立相关的平滑肌层厚度,胶原III沉积和脚杯细胞增生300.它们都是独立相关的(P <0.05)。这三个重塑参数解释了40%(r2)PC中的可变性300在一个线性回归模型中。只有平滑肌肉层厚度的模型占PC中可变性的39%300.有趣的是,肺组织中的嗜酸性粒细胞也与PC显着相关300并将嗜酸性粒细胞添加到第一个模型增加了PC中的解释变异性300在怀孕期间添加吸烟时,进一步增加到59%的46%。
讨论
本研究有三个重要观察。首先,怀孕期间的母亲吸烟增加了气道平滑肌层厚度和胶原III沉积在后代的气道周围,增加了HDM诱导的狗丝细胞增生。其次,妊娠期间的孕产妇吸烟增加了HDM诱导的中性粒细胞和肥大细胞数,第三,母亲吸烟增加了10周龄后代的母亲反应性。
本研究是第一个显示怀孕期间吸烟,而无需随后出生于烟草烟雾,增加和维持10周龄后代的重塑。另外的新发现是增加平滑肌层厚度是吸烟母亲后代的气道反应性增加的最佳预测因子。由于抗原刺激后气道平滑肌的收缩导致气道缩小,因此吸烟母亲的后代发现的平滑肌增加可能会占所观察到的母乳响应性的增加。发现MCH响应能力与Southam支持的气道平滑肌肉增厚相关联等等。16凡发现(在不引入怀孕期间的母亲吸烟)持续的气道高反应性与暴露于HDM的小鼠的平滑肌面积增加有关。在艾略特的一项研究中等等。17然而,从吸烟豚鼠母亲的后代乙酰胆碱反应性增加与增加的平滑肌面积没有相关,可能是因为出生后21天尚不明显,平滑肌层厚度的变化尚不明显。
在鼠标后代暴露于母亲吸烟在子宫内据报道,MCh响应性与肺组织中环状AMP的存在减少有关18.这是有趣的,因为环状AMP参与气道平滑肌的松弛。因此,除了平滑肌面积增加外,在怀孕期间暴露于母亲吸烟的后代的其他平滑肌特征可能是气道高反应的主要贡献者。
效果在子宫内在本研究中观察到,MCh激发后烟雾诱导的气道平滑肌收缩增加甚至可以通过增加III型胶原沉积导致的气道壁适应能力下降而增强。胶原蛋白负责肺的顺应性和结构完整性,而胶原蛋白沉积的增加,如在重塑的气道中看到的,被认为是造成更硬的气道。有趣的是,Sekhon等等。19以前发现母亲尼古丁暴露增加了胎儿III mRNA水平和胎儿猴血糖蛋白表达,这确实与肺抗性增加和呼气流量减少,可能是由于气道的刚度。然而,后一项研究没有揭示这些变化是否仍然存在于成年生命中,或由于出生后进一步的肺部发育和/或成熟而可逆。本研究表明,即使在没有烟雾暴露的长期之后,母亲吸烟对胶原III沉积的影响仍然存在。
因此,平滑肌面积的增加和III型胶原沉积都可能导致暴露于烟雾的成年后代MCh反应性的增加在子宫内。
本研究发现从吸烟的后代的HDM诱导的狗丝细胞增加了比不吸烟的母亲更大增加。在响应于动物模型和COPD患者中的主动烟雾暴露之前已经显示了脚杯细胞增生。本报告是第一个响应母体烟雾暴露而逐步证明戈尔特细胞增生的增加。到目前为止,在哮喘中报告了血红素细胞数增加20.;杯状细胞增生的主要后果是粘蛋白糖蛋白分泌过多,导致黏膜堵塞堵塞气道,导致气道高反应性增加。
除了在怀孕期间吸烟的影响外,在空道道的重塑中,从吸烟的母亲的后代而且没有从非莫斯母亲的后代的后代增加了HDM诱导的中性粒细胞和肥大细胞的数量。几项研究表明,中性粒细胞能够有助于气道平滑肌细胞生长通过弹性蛋白酶的生产21.存在的肥大细胞也可以在气道平滑肌细胞,胶原素合成和超反应性中发挥重要作用22,介导的通过释放例如胰蛋白酶,组胺和活素A.虽然本研究中的肥大细胞数增加是有限的,但这些细胞主要位于气道壁中。因此,HDM诱导的肥大细胞和中性粒细胞的组合增加可以在吸烟母亲的HDM暴露后代的HDM中的气道重塑中变化。中性粒细胞和肥大细胞增加背后的机制,但在嗜酸性粒细胞,IgE和Th2细胞因子中,与妊娠期间的母亲吸烟有关仍然未知。
为了进一步评估重塑是否可以预测MCH响应性,使用线性回归模型来表明平滑的肌肉层厚度解释了相当一部分的MCH响应性,与妊娠期间吸烟无关。有趣的是,增加了模型的肺组织嗜酸性粒细胞的数量基本上增加了模型的解释可变性。因此,增加平滑肌面积和过敏性嗜酸性炎症的源于成年小鼠中的MCH反应性的严重程度。这可能表明减少气道高反应性的干预措施需要评估哮喘的两种特征。最后,怀孕期间的吸烟也大大提高了解释的可变性,表明在妊娠期间吸烟的独立效果对气道高反应性的严重性。这表明受孕期间吸烟影响的其他因素在肺部发育的变化导致的气道几何形状或气道大小起作用。在子宫内,或先天免疫反应的变化,诺克斯提出等等。9..鼻内HDM暴露引起的鼻梗阻也可能是诱导PENH的因素,从而影响PC中的变异性300由线性回归模型中的不同因素解释。然而,这一效应并不能完全解释,因为鼻塞不会影响母亲在怀孕期间吸烟对PBS暴露后代Penh的影响。
除了孕期吸烟对子代肺功能和结构的严重影响外,本研究还为HDM暴露对参与炎症反应的细胞因子和细胞类型的影响提供了新的见解。结果表明,IL-17水平显著升高,与中性粒细胞和嗜酸性粒细胞内流和eotaxin的产生相关。这与文献中IL-17诱导中性粒细胞募集相一致23并参与嗜酸性粒细胞发展24和eotaxin生产25.此外,发现HDM暴露的一些已知效果的载体,例如肺组织中的嗜酸性粒细胞和脚蛋白细胞增加,IL-4,IL-5,IL-13增加(先前在支气管肺泡灌洗液和mRNA水平上进行研究)和肺组织中的肠蛋白,以及增加(特异性的HDM)血清IgE水平和肺的重塑26-28.细胞因子水平的变化是由肺部特定舱室中水平的变化引起的(例如使用全肺组织的当前方法无法回答航空公司和薄营。
总之,这些数据表明,在小鼠怀孕期间吸烟会使成年小鼠后代的气道重塑的几个方面,即使在没有烟雾暴露的长时间之后,也可能有助于增加MCH响应性。怀孕期间吸烟会诱导重塑,无论过敏原暴露,但恶化过敏刺激的结果,导致吸烟母亲的HDM暴露后代的最高态度反应性。本研究提供了解锁妊娠期间孕产妇吸烟的相对贡献的机会,从产后被动烟雾暴露的贡献显示对肺部结构的延续效果和小鼠后代的功能。
结果支持流行病学研究关于母亲吸烟和儿童或青春期哮喘之间的关联的数据。此外,数据提供了暗示性证据,特别是嗜酸性气道炎症和增加的气道平滑肌区域,独立地促进了哮喘中气道高反应性的严重程度。
支持声明
这项工作得到了欧盟委员会的资助,作为GABRIEL的一部分(一项确定欧洲共同体哮喘的遗传和环境原因的多学科研究,合同编号018996)。
兴趣表
没有宣布。
致谢
作者感谢P.A. Klok, C.A. Brandsma, M. Versluis, J.M. Vonk(荷兰格罗宁根大学格罗宁根大学格罗宁根大学医学中心)和中央动物设施(格罗宁根大学)的同事们的帮助。
- 收到了2008年8月22日。
- 公认2008年12月1日。
- ©ers Journals Ltd