摘要
肺实质的淋巴滤泡是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征性表现。有报道称COPD肺中CD4 t调节细胞数量改变,但这些细胞在COPD肺组织特异性滤泡中的位置尚未被研究。
CD4的存在+FOXP3+采用免疫荧光和免疫组化联合方法检测了12例手术切除的COPD患者、11例肺功能正常的吸烟者和7例非吸烟者的肺组织中的t调节细胞。
在所有三组患者中都观察到有组织的淋巴滤泡,以及缺乏组织的淋巴簇。与吸烟者(10%)和非吸烟者(8%)相比,COPD滤泡中t调节细胞CD4细胞的百分比显著增加(p = 0.02)。相比之下,组间t调节性细胞或上皮下细胞的百分比没有变化(p>0.05)。
慢性阻塞性肺病患者的淋巴滤泡增加了t调节性细胞。因此,慢性阻塞性肺病淋巴滤泡内的t调节活性可能被改变。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)以进行性气道炎症为特征。适应性免疫改变被认为在这种疾病的病理生理学中发挥作用,如增加CD8+与对照组相比,COPD患者气道中发现了t细胞和B淋巴细胞的数量1- - - - - -3.,这些细胞的数量也随着疾病的严重程度而增加1,4.有人提出慢性阻塞性肺病有自身免疫成分5,6,但引起淋巴细胞活化的抗原刺激尚不清楚。可能包括呼吸道中的病原体,如病毒或细菌,或吸烟改变自身抗原(包括弹性蛋白)的表现4,6.COPD患者肺淋巴细胞活性的调节机制尚不完全清楚。
调节性t细胞是CD4细胞的一个子集,通过释放抑制分子,如白介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β,或通过细胞间接触机制,抑制活化的淋巴细胞7,8.FOXP3是forkhead或翼螺旋转录因子家族,被认为对t调节细胞的发育和功能至关重要9,10,被认为是t调节细胞最特异的可用标记物11,12.
包括FOXP3在内的t调节标记物已被用于表明吸烟者支气管肺泡灌洗液中t调节细胞的数量增加13,14与非吸烟者相比。其中一项研究还表明,与肺功能正常的吸烟者相比,慢性阻塞性肺病患者的t调节数量减少,表明慢性阻塞性肺病患者的t调节功能下降。据报道,与对照组相比,肺气肿患者分散的肺组织淋巴细胞中t调节细胞数量减少,与全组织FOXP3 mRNA水平和IL-10的产生减少相关,进一步支持了t调节功能在COPD患者中降低的概念6.
被炎症组织部位吸引的淋巴细胞可以形成称为三级淋巴滤泡的有组织结构。据报道,这些病变存在于肠道和关节等组织中15,16,也在COPD患者的肺实质中观察到4,17.这些滤泡有一个b细胞核心,周围是t细胞17.树突状细胞也存在于这些滤泡中,提示这些结构是向淋巴细胞提交慢性抗原的场所17.有人认为,树突状细胞参与了慢性阻塞性肺疾病滤泡内的异常免疫反应18.据我们所知,COPD患者肺淋巴滤泡中t调节性细胞的研究尚未见报道。
我们研究了中度COPD患者肺实质中的t调节细胞数量,重点是淋巴滤泡。我们假设,与正常对照组相比,慢性阻塞性肺病患者的实质t调节细胞数量会发生改变。我们使用双荧光免疫细胞化学描述了CD4的具体位置+FOXP3+COPD患者肺实质中的t调节性细胞。
材料和方法
研究对象
共有30例患者因疑似或确诊为肺癌而接受手术切除(表1)⇓)招募了。COPD的诊断依据是吸烟史≥10包年、典型症状(咳痰、呼吸困难或喘息)和气流阻塞,定义为1秒内用力呼气量(FEV)1) <80%预测,FEV1/强迫肺活量(FVC)比值<0.7。这些患者均为中度COPD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) stage 2)。非COPD患者分为吸烟者和非吸烟者,其中包括有≤1年吸烟史的前吸烟者。所有受试者均给予书面知情同意。该研究得到了当地研究伦理委员会(南曼彻斯特研究伦理委员会)的批准。
组织取样和处理
两个组织块取自同一肺的相邻区域,尽可能远的远的肿瘤,然后福尔马林固定和石蜡包埋。对每个患者,两个组织块都进行了免疫组化染色分析。使用的主要抗体有:CD3(克隆PS1, Novocastra, Newcastle Upon Tyne, UK)、CD4(克隆IF6, Novocastra)、CD8(克隆C8/144B, Dako, Glostrup, Germany)、CD20(克隆L26, Vector Labs)、CD62L(克隆9H6, Novocastra)和FOXP3 (Ab10563, Abcam, Cambridge, UK)。
肺组织切成4µm切片,放到聚醣涂层玻片上。在Tris-EDTA缓冲液pH 8 (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20)中提取热诱导表位后,将肺切片在800 W下微波20分钟。一抗稀释于1.5%的正常血清(Vector Labs, Peterborough, UK),在4°C下过夜。内源性过氧化物酶用3% H孵育2O2室温甲醇中30分钟。FOXP3的检测使用生物素化山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(Vector Labs),结合亲和素-生物素过氧化物酶复合物(Vector Labs)和二氨基联苯胺底物。切片用Meyer氏苏木精染色(Sigma, Poole, UK)。在染色方案中省略一抗和用同型对照抗体替代一抗(Vector Labs)作为阴性对照。
免疫荧光联合免疫组化
切片用如上所述的pH为8的Tris-EDTA缓冲液预处理,用正常山羊血清阻断,然后在小鼠抗人CD4 (1:10;或小鼠抗人CD62L (1:50;Novocastra)在4°C过夜。使用Alexa 568标记的山羊抗小鼠IgG (1:200;Invitrogen公司,佩斯利,英国)的切片在兔抗人FOXP3 (1:800;Abcam)在4°C下过夜,并检测如所述。切片随后在4 ',6-二氨基-2-苯基吲哚(Invitrogen)中培养,作为荧光核反染剂。在平行切片上遗漏一种或其他一种抗体,或两种抗体,以提供对照。
图像分析
CD4的数量+FOXP3+在炎性滤泡和簇内以及小气道的上皮下层内计算t调节细胞;无软骨和腺组织的气道,内部周长< 6mm。为了获得双标记图像,从同一个区域捕获亮场和荧光图像并进行数字合并以确定CD4+FOXP3+细胞。数码显微照片使用尼康Eclipse 80i显微镜(尼康英国有限公司,英国萨里),配备QImaging数码相机(Media Cybernetics, Marlow英国)和ImagePro Plus 5.1软件(Media Cybernetics)。使用ImagePro Plus 5.1软件对单个细胞计数、滤泡大小和气道管腔周长进行定量。在100µm上皮下计数与小气道相关的CD4细胞。计算细胞计数并将其标准化为阳性细胞数·mm−2感兴趣区(簇、滤泡或上皮下)。
统计分析
数据不是正态分布的,因此使用非参数方差分析进行组间的三方比较。当方差分析发现显著差异时,定义为p<0.05,随后进行Mann-Whitney u检验进行双向比较。使用GraphPad InStat 3.06版本(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)进行分析。
结果
三级淋巴结构的分布
在每个患者组的样本中观察到三级淋巴滤泡。检测到滤泡与气道壁相关(图1a)⇓)和肺实质内的孤立结构(图1b)⇓),如前所述4,17.这些有组织的滤泡由密集的细胞群组成,这些细胞呈同心层排列(图1c-f)⇓).卵泡的CD20较大+外层为CD3的b细胞核心+t细胞,包括两种CD4+和CD8+细胞。也观察到无组织结构的炎性团簇(图1g)⇓h)。在集群中,t细胞群不再仅仅与外层有关,而是分布或分散在整个区域。大部分卵泡(89.4%;85名中有76名)和集群(86.4%;44例中38例在肺实质中,其余38例在气道中(表2)⇓).
在30名受试者的60个样本中(即。COPD,吸烟者和非吸烟者的结合)在COPD患者中观察到每个样本的滤泡数量增加,并有显著性趋势(p = 0.068)。组间聚类数无显著差异(p = 0.11)。
CD4细胞分布
方差分析显示COPD、吸烟者和不吸烟者CD4的数量有显著差异+卵泡内的细胞(p = 0.004)。曼-惠特尼u测试显示CD4+COPD滤泡细胞增多(中位4,390个细胞·mm)−2)相比吸烟者(中位3,370个细胞·mm−2;p = 0.0009)。虽然CD4的数量也有差异+慢性阻塞性肺疾病和非吸烟者滤泡内的t细胞,这些没有统计学意义(p = 0.1)。
方差分析显示COPD、吸烟者和不吸烟者CD4的数量有显著差异+上皮下细胞(p = 0.02;表3⇓).随后的Mann-Whitney U-test分析显示CD4增加+COPD上皮下t细胞(中位448个细胞·mm)−2)(中位200细胞·mm−2;P = 0.015)和非吸烟者(中位260细胞·mm)−2;P = 0.04),但吸烟者与不吸烟者之间无差异(P >0.05)。
ANOVA分析显示COPD、吸烟者和不吸烟者之间CD4的数量没有差异+细胞集群。
CD4+FOXP3+t调节细胞
CD4+FOXP3+t调节细胞主要分布在炎症滤泡周围(图2a)⇓),而在集群中观察到t调节细胞分散在各处。CD4的绝对值+FOXP3+小气道上皮下细胞较低(图2a-c)⇓和表3⇑).FOXP3的免疫反应性与细胞核相关。所有FOXP3+被鉴定的细胞也是CD4+.CD8+FOXP3+细胞未被识别(图2f)⇓).在相邻的连续切片上,当协议中省略FOXP3一抗或用同型对照抗体替换时,未观察到免疫反应产物(图2g)⇓和h)。
与吸烟者和非吸烟者相比,COPD患者的卵泡中t调节细胞数量增加,无论是以CD4细胞总数还是百分比表示(表3)⇑).曼-惠特尼u测试显示CD4+FOXP3+COPD滤泡内细胞(中位160个细胞·mm)−2)显著增加(中位100个细胞·mm−2;P = 0.032)和非吸烟者(中位80个细胞·mm−2;p = 0.027)。吸烟者和非吸烟者的卵泡没有差异(p = 0.36)。
无论CD4细胞的总数还是百分比,组间t调节细胞的数量在集群或上皮下均无显著差异(表3)⇑).
在COPD患者中,CD4人群中FOXP3细胞的比例+与簇状或上皮下相比,滤泡中明显增加(表3⇑).在吸烟者和非吸烟者中,FOXP3在总CD4人群中的百分比没有差异+在滤泡、簇和上皮下之间(表3)⇑).
t调节性细胞表达CD62L
来确定CD4是否+FOXP3+t调节性细胞表达次级淋巴组织归巢受体CD62L,每个患者在一个区进行CD62L和FOXP3的双重标记表达(图2e)⇑).CD62L的百分比差异无统计学意义+FOXP3+组间细胞数(p = 0.68)。COPD、吸烟者和非吸烟者的中位(范围)分别为47(6 - 75%)%、42(22 - 50%)%和46(4 - 75%)%。
讨论
这是第一个量化和描述CD4定位的研究+FOXP3+慢性阻塞性肺病患者肺实质中的t调节性细胞。以前的研究已经描述了来自支气管肺泡灌洗液(BALF)、分散的肺细胞和外周血的t调节细胞6,13,14.主要的发现是CD4+FOXP3+与吸烟者和肺功能正常的非吸烟者相比,中度COPD患者炎症滤泡内t调节细胞显著增加。
我们观察到在COPD肺组织中以无组织结构(称为簇状)出现的炎性淋巴聚集。类似地,组织松散的肠道炎症团簇可能代表未成熟的滤泡19.我们假设在我们的研究中观察到的炎性簇也可能反映了不成熟或早期三级淋巴滤泡。
与吸烟者和非吸烟者相比,COPD患者滤泡内t调节细胞的比例增加。然而,在细胞簇和上皮下,两组之间t调节细胞的比例没有差异。据推测,COPD滤泡内的树突状细胞不能诱导适当的t细胞应答,而是主要诱导CD8+t细胞增殖18.这些CD8细胞离开滤泡,在气道和实质内聚集18.因此,COPD滤泡内的局部免疫微环境似乎涉及多种细胞类型,我们的观察也提示了t调节性细胞在该微环境中的作用。我们推测,COPD滤泡中t调节细胞数量的增加,抑制了树突状细胞和t细胞之间导致CD8增殖的相互作用。这一假设有待进一步研究。
最近的研究也描述了类风湿性关节炎患者三级淋巴滤泡内的t调节细胞15,以及炎症性肠病患者的粘膜活检16.由于卵泡有一个b细胞核心,因此有人认为FOXP3+t调节性细胞可以直接介导b细胞的活性20..我们推测t调节细胞在COPD淋巴滤泡中的另一个可能作用是抑制b细胞的激活。
我们调查了肺组织中t调节性细胞的数量,需要进一步研究这些细胞的功能,如调节性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。据报道,COPD患者肺组织中IL-10的生成减少,提示t调节活性降低6.尽管我们观察到COPD淋巴滤泡中t调节性细胞增多,但它们的功能是否得到保留是一个关键问题。
先前的研究表明,在BALF中,吸烟者与不吸烟者相比,t调节细胞的数量增加。有一项研究的证据表明,与肺功能正常的吸烟者相比,慢性阻塞性肺病患者的t调节细胞数量减少,但这不是我们自己进行的研究。在另一项使用分散肺淋巴细胞的研究中,与吸烟和不吸烟的混合对照组相比,肺气肿患者的t调节细胞数量减少。相比之下,我们目前的观察表明,COPD患者中t调节细胞数量增加。不同研究之间的差异可能是由于我们专门研究淋巴滤泡,而不是通过灌洗对气道腔取样的研究。在这些不同的间隔内的细胞可能有不同的特征。以往的研究以流式细胞术cd4cd25高表达作为评估t调节细胞数量的主要方法。然而,我们知道,一些cd4cd25高细胞被激活,而不是调节性淋巴细胞,而调节性t细胞的最佳标记物就是目前研究中使用的FOXP3。
FOXP3+t调节细胞被分为次级淋巴细胞和非淋巴组织FOXP3+t细胞20.,21.转运受体(包括CD62L)的差异表达已被用于区分淋巴归巢t调节性细胞21.在目前的研究中,在滤泡和簇中发现的t调节性细胞表达CD62L,表明t调节性细胞募集类似于次级淋巴结21,22.COPD的存在并没有改变CD62L的表达,这表明COPD滤泡内t调节细胞数量的增加并非由于这种转运受体的过度表达。
只有约50%的FOXP3+t调节性细胞为CD62L+,可能是由于淋巴细胞向淋巴器官迁移时发生的趋化因子受体转换21.滤泡内抗原呈递可能引起次级趋化因子受体转换,使淋巴细胞有效迁移到非淋巴组织23.我们发现只有50%表达CD62L的调节性t细胞可能是由于趋化因子受体转换。
本研究的主要目的是分析卵泡内t调节细胞的数量。我们还收集了COPD患者和对照组样本中卵泡数量的数据。如前所述,我们发现了与小气道相关的滤泡4,17,以及如前所述肺实质内的滤泡17.然而,我们的目的并不是进一步研究组间卵泡数量的差异,因为这在其他地方已经被广泛报道,使用的样本量比目前的研究更大4,17.此外,我们只纳入了中度COPD患者,而以往的研究已经纳入了更大范围的患者,包括重度(GOLD阶段3)和非常重度(GOLD阶段4)患者。这一点和霍格一样重要et al。4显示重度和极重度COPD患者的滤泡数量急剧增加。考虑到目前的研究在疾病范围方面的局限性,很明显,我们的研究没有告诉我们任何关于卵泡流行率的新情况。我们要强调的是,我们并没有着手调查这个问题。
先前的研究表明,吸烟者的卵泡数量比不吸烟者多24,但吸烟者与轻度至中度COPD患者之间无差异4,25.我们的研究显示,与吸烟者相比,中度COPD患者卵泡内t调节细胞数量增加。我们推测这是中度COPD患者的卵泡内含有抗原呈递树突状细胞、CD8细胞和大量b细胞的免疫活性增加的一个指标。据推测,慢性阻塞性肺病与自身免疫有关5,6因此,中度慢性阻塞性肺病患者t调节活性的增加可能是控制自身免疫的一种尝试。慢性阻塞性肺病由中度发展到重度,与滤泡数量的急剧增加有关4,可能是由于调节机制未能抑制自身免疫。
参与本研究的受试者正在接受疑似肺癌的调查。我们不能完全排除肺癌对我们的研究结果可能有任何影响。然而,我们观察到>80%的三级淋巴滤泡分布在肺实质中,而不是支气管相关淋巴组织,这与最近一项使用肺缩小手术和肺移植患者的非癌性肺组织的研究相一致17.
总之,我们观察到在中度COPD患者实质滤泡中t调节细胞的比例增加。正常情况下,t调节性细胞调节持续的免疫反应并防止自身免疫。这些T调节细胞的功能或数量的改变可能与免疫调节的变化有关。t调节性细胞在COPD淋巴滤泡中的确切作用需要进一步关注。
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没有宣布。
- 收到了2008年7月3日。
- 接受2009年1月20日。
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