文摘
Ebastine是一个著名的选择性代组胺H1受体拮抗剂,用于季节性和常年性过敏性鼻炎和慢性荨麻疹。血管生成中起着至关重要的作用在气道炎症的发展和改造在过敏性鼻炎和哮喘病人,在他,事实上,粘膜显示增加多血管和超表达血管内皮生长因子(VEGF)。本研究的目的是评估抗血管生成的属性carebastine, ebastine的活性代谢物。
carebastine的影响对人类脐静脉内皮细胞(EC) (HUVEC)和人类肺动脉EC (HPAEC)增殖、迁移和capillary-like管形成在体外,在鸡胚绒毛膜尿囊的膜(CAM)实验在活的有机体内。此外,carebastine的影响胎儿肝细胞VEGF受体磷酸化的激酶1,或VEGF受体2 (VEGFR-2),一种蛋白激酶激酶(激酶)被西方墨点法评估。
Carebastine抑制VEGF-induced HUVEC HPAEC扩散、迁移和血管生成在剂量依赖性的方式在体外。细胞增殖抑制了42和HUVECs和62年64%和75%在HPAECs暴露48和72 h,分别为20μM carebastine (p≤0.03),甚至更有30μM carebastine。细胞迁移是由37 70%,抑制HUVECs (p≤0.03)和60 78%,HPAECs (p≤0.01)在10到30μM carebastine,分别。Carebastine(20μM)引起显著减少(70−86%;p < 0.01)的毛细管网的拓扑参数生产在体外由EC基底膜提取行。Carebastine(30 - 50μM)抑制了VEGF-induced凸轮检测血管生成在活的有机体内分别2 -和3倍(p < 0.001)。最后,EC线,在10和20日μM carebastine,显示四到六倍的减少(p≤0.01) VEGF -和H1receptor-induced VEGFR-2和一种蛋白激酶磷酸化。
总的来说,这些数据提供了第一个证据关于ebastine的抗血管生成活动,并建议其潜在作为抗血管生成分子,除了其抗组胺剂活性治疗过敏性疾病的血管生成。
组胺H1受体拮抗剂通常用于缓解症状的治疗过敏的反应,如过敏性鼻炎、rhinoconjunctivitis和荨麻疹。抗组胺药的抑制肥大细胞组胺释放是众所周知的,而他们的附加属性,这有助于他们的临床疗效,是不完全的理解。据报道,一些抗组胺药规范表达和/或释放细胞因子,趋化因子、黏附分子和其他炎症介质,因此,抑制炎症细胞的招募1。
的抗炎效果1受体拮抗剂可能涉及receptor-dependent机制通过分泌的抑制核factor-κB (NF-κB)端依赖细胞因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF) 2、肝细胞生长因子和粘附分子的抑制2- - - - - -4。其他人描述receptor-independent机制涉及预制的释放介质,如组胺和嗜酸性粒细胞蛋白,以及生产类二十烷酸和氧自由基5- - - - - -7。
Ebastine (4-diphenylmethoxy-1 [3 - (4-terbutyl-benzoyl)丙基]哌啶)是第二代选择性和有效的H1无抗胆碱能受体拮抗剂或镇静效果,用于季节性和常年性过敏性鼻炎和慢性荨麻疹。口服后,迅速转化为其活性代谢物,carebastine。它能抑制的分泌白介素(IL) 4, IL-5,白介素和肿瘤坏死factor-α炎症细胞8。
最近的研究表明,血管生成(新血管的形成)参与气道炎症和气道重塑的病理生理学的发展过程中过敏性鼻炎和哮喘9,10。的确,气道微循环的主要结构和功能的变化包括血管生成、血流量和微血管通透性增加,气道壁和水肿形成11。增加血管生成分子的表达,VEGF等FGF-2和血管生成素及其受体,一直与疾病严重程度和加速肺功能下降12- - - - - -20.。其他显示支气管肺泡灌洗液(BALF)哮喘病人展品增强在体外血管生成活性和FGF-2增加21和VEGF水平22;BALF血管生成活动被一个抗vegf抗体22。此外,哮喘患者BALF中VEGF含量增加支气管黏膜的血管数量比例,,的确,显示强烈的VEGF, VEGF受体(VEGFR) 1和VEGFR-2(或胎儿肝脏激酶1 /插入域受体激酶)染色20.。
VEGF的直接贡献提出了哮喘的过敏反应et al。23生成的lung-targeted VEGF165年转基因小鼠和评估中VEGF的作用antigen-induced 2型T-helper-cell-mediated炎症。超表达的VEGF诱导血管生成,水肿,血管重塑,白细胞渗透到肺部,胶原蛋白沉积,过度的IL-13(促进胶原蛋白沉积到基底膜),粘液增加生产和平滑肌细胞增生。
本研究的目的是调查carebastine使用的抗血管生成活性在体外和在活的有机体内化验。前者包括人类脐静脉内皮细胞(EC) (HUVEC)和人类肺动脉EC (HPAEC)增殖、迁移和capillary-like管形成;后者是小鸡胚胎绒毛膜尿囊的膜(CAM)实验。此外,VEGFR-2 carebastine的影响的细胞和一种蛋白激酶激酶(激酶)磷酸化被西方墨点法评估。
材料和方法
细胞培养和在体外功能分析
HUVECs从美国购买类型文化收集(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯),HPAECs来自Lonza (Walkersville,医学博士,美国)。两个细胞系在欧共体基础培养基培养EBM-2®补充了SingleQuots®(Lonza)和10%胎牛血清(Gibco®,英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)在37°C(完全培养基)5%的股份有限公司2的气氛。
HUVEC HPAEC扩散评估如前所述24;5×104细胞·好−1在96 -孔板培养24、48和72 h饥饿无血清培养基(SFM;负控制)或完全培养基混10 ng·毫升−1VEGF165年(人类VEGF重组165年;美国密尔沃基,Sigma-Aldrich WI;积极控制)或补充5 - 30μM carebastine(请提供Almirall,巴塞罗那,西班牙)在五个独立实验一式三份。使用3 -细胞数(4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2-5-diphenyl溴化四唑(MTT)细胞增殖测定(写明ATCC),和表达为意味着±sd的比例控制。EC号也估计使用稍微修改24结晶紫比色法25。没有非特异性的细胞毒性效应(核固缩、胞质vescicles和颗粒,细胞形状或细胞分离从支持)被认为与carebastine HUVECs或HPAECs,即使在30μM。
Boyden microchambers执行趋化现象的分析,如前所述26,仅对SFM(负控制)或混有10 ng·毫升−1VEGF165年单独(积极控制)或一起carebastine剂量在五个独立实验一式三份。4 h后,迁移的细胞数在1000年5×放大·膜油浸字段−1,意味着±sd百分比。
在体外血管生成试验
HUVECs和HPAECs (1×105细胞)被放置在与Cultrex 24-well板板®基底膜提取(美国马里兰州盖瑟斯堡Trevigen, Inc .,;400μL·−1)在1毫升·−1仅SFM(负控制)或完全培养基补充10 ng·毫升−1VEGF165年一起孤独(积极控制)或carebastine剂量在五个独立实验重复进行,在37°C和孵化有限公司5%2的气氛。一个18-h孵化后,管使用恢复相差显微镜检查和网格形成(Leitz则DM IRB;位于德国徕卡微系统公司)。的skeletonisation网之后,其拓扑参数测量,即。1)数量的地区,2)船长度,和3)数量的分支点,利用计算机图像分析(如前所述)27,意味着±sd抑制百分比与积极的控制。代表字段使用徕卡D-Lux3数码相机拍摄(徕卡相机,德国索姆)。
绒毛膜尿囊的膜试验
凸轮检测进行受精白来航鸡鸡蛋孵化在37°C在恒定的湿度(如前所述)28。孵化第三天,一个方形窗口中打开壳2 - 3毫升蛋白被为了分离凸轮。8天,摄像头被植入1毫米3消毒明胶海绵(美国明胶海绵Upjohn,卡拉马祖,MI)装载1μL介质(负控制)或增加250 ng VEGF165年(积极控制)单独或结合30到50μM carebastine五个独立为每个剂量和控制执行重复实验。没有见过胚胎死亡,即使50μM carebastine。血管生成反应是评估在12天随着船舶数量的汇聚成的海绵50×放大,和拍照蛋中蛋使用一个奥林巴斯立体显微镜(奥林巴斯、Rozzano、意大利)。
西方墨点法
HUVECs和HPAECs six-well板培养皿中的SFM中含0.1%牛血清白蛋白为18 - 20 h。然后细胞暴露在10 ng·毫升−1VEGF165年单独或结合30μM组胺(Sigma-Aldrich)其次是10和20μM carebastine,然后细胞溶解在一个缓冲区包含25毫米三(羟甲基)氨基甲烷(三)/盐酸、氯化钠150毫米,1毫米EDTA,特里同x - 100 1%, 0.1%钠dodecylsulfate (SDS),氟化钠1毫米,1毫米Na3签证官4和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。由布拉德福德总蛋白浓度测定方法使用Bio-Rad蛋白质化验(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。整除(30μg蛋白质)的细胞溶解产物被分离SDS-polyacrylamide凝胶电泳(PAGE) NuPAGE使用预制的4 - 12%®Novex®Bis-Tris凝胶(英杰公司公司)在减少情况下,electrotransferred一聚乙二烯二氟化物膜(PerkinElmer生命科学公司,波士顿,MA,美国)和孵化主要和次要抗体(抗体针对VEGFR-2, Akt phospho-Akt(丝氨酸473)是细胞信号技术(丹弗斯、马、美国),对phospho-VEGFR-2(酪氨酸1054)来自Abcam(英国剑桥),反对β-actin,和山羊免疫球蛋白(Ig) G(辣根peroxidase-conjugated)从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国),和老鼠和兔子免疫球蛋白(辣根peroxidase-conjugated)来自Bio-Rad)。然后乐队被增强化学发光(SuperSignal形象化®西方Pico衬底;热科学公司,沃尔瑟姆,妈,美国)使用凝胶逻辑1500成像系统(美国纽约罗切斯特伊士曼柯达有限公司)及其强度量化使用柯达分子成像软件,并表示为±sd任意光密度单位基于五个独立的实验。
为抑制实验,ECs服用5μg·毫升−1反VEGFR-2中和单克隆抗体(mAb)(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)24 h,然后按顺序暴露30μM组胺10分钟和10μM carebastine 1 h。在不同的实验中,ECs处理20μM mepyramine (H1受体抑制剂;西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h,然后按顺序暴露10 ng·毫升−1VEGF165年10分钟和carebastine如上所述。mepyramine的剂量的基础上选择一个摩尔过剩与carebastine。细胞被免疫印迹细胞溶解和加工。
结果
carebastine影响在体外HUVEC HPAEC扩散,趋化性和血管生成
VEGF的HUVEC和HPAEC增生性反应165年显著减少carebastine剂量依赖性的方式,在最大72 h后接触到30μM carebastine两HUVECs(下降65%)和HPAECs(减少80%)(无花果。1⇓和b)。显著降低细胞增殖也达到20μM carebastine后48 h (HUVECs减少42%和HPAECs减少62%;p≤0.03(双向方差分析)和72 h (HUVECs减少64%和减少HPAECs 75%;p≤0.01),抑制浓度中位数为28.7±6.9,16.5±4.7μM,分别。这些结果使用MTT法和确认与结晶紫比色法(图1所示⇓在线补充材料)。Carebastine施加一个抑制VEGF的影响165年全身的HUVEC和HPAEC迁移趋化性试验(图1 c⇓和d)。细胞迁移是由12个和45%,抑制37 (p < 0.03 (ANOVA))和60% (p < 0.01), 46和68% (p < 0.01), 70年,78%的5、10、20和30μM carebastine,分别。
Carebastine显著抑制HUVEC, HPAEC血管生成在体外基底膜提取。如图2所示⇓之后,一个18-h孵化VEGF165年暴露HUVECs产生与薄,紧密编织毛细管网分支和交织通过众多的连接管连接;网格区域数量31.2±7,船长度6814±618μm和分支点计数37±5。接触carebastine 1μM,更在20μM,给上升,在剂量依赖性的方式,一个组织不善丛很少有直接且混乱的和稀缺的连接管;减少网格面积数分别为19.6±4.2(37%)和6.3±2.8(减少79%)、船长度为4225±313(下降38%)和1135±126μm(减少83%),和分支点数量24±4(减少37%)和11±3(减少70%)分别(p≤0.01(配对t检验)。重叠的变化被观察到在HPAEC毛细管网后暴露在20μM carebastine(网格区域,减少82%减少86%船长度和分支点减少75%;数据未显示)。
carebastine对VEGF-induced VEGFR-2和一种蛋白激酶的磷酸化
在活的有机体内实验证明,carebastine施加VEGF-induced血管生成的抑制作用的反应。为了确定carebastine是否能够抑制VEGFR-2和一种蛋白激酶磷酸化,VEGF蛋白免疫印迹实验进行165年对待HUVECs。如图4所示⇓10μM carebastine明显阻塞VEGFR-2 VEGF-dependent磷酸化的酪氨酸(1054)在治疗后30分钟,和抑制作用后仍可检测24小时接触毒品。此外,抑制受体磷酸化与显著降低VEGF诱导的能力在相同的实验条件下一种蛋白激酶磷酸化。如图4所示⇓和c, 10和20μM carebastine显著抑制VEGF-induced VEGFR-2和一种蛋白激酶的磷酸化剂量依赖性的方式,因此阻塞HUVEC的生存。
carebastine对组胺信号通路介导的H1受体在HUVECs和HPAECs
为了验证是否H1受体的激活参与VEGFR-2 Akt,组胺治疗蛋白磷酸化的影响进行了研究。免疫印迹分析表明,ECs与VEGF的刺激165年其次是组胺产生快速(10分钟后暴露)和可观的增加VEGFR-2和一种蛋白激酶的磷酸化。当10和20μM carebastine补充说,它明显阻塞histamine-stimulated VEGFR-2和一种蛋白激酶的磷酸化HUVECs(图5⇓,c和e)和HPAECs(图5 b⇓d和f),证明VEGFR-2和Akt通路的抑制carebastine在EC类型由H的阻塞1受体的活动。
为了调查carebastine是否能够抑制VEGFR-2磷酸化通过同时干扰H1受体和VEGFR-2,抑制实验进行中和anti-VEGFR-2马伯,另外,mepyramine H的抑制剂1受体。如图6所示⇓,封锁VEGFR-2产生显著抑制VEGFR-2磷酸化histamine-stimulated HUVECs HPAECs。此外,轻微抑制VEGF165年刺激细胞阻塞在H1受体与mepyramine carebastine。数据显示,直接抑制活动carebastine大都是介导的H1受体,在较小程度上,VEGFR-2。
讨论
增强血管生成参与组织炎症和重塑的许多方面,并导致气道功能异常,包括增加粘膜反应在过敏性鼻炎和固定代理气流阻塞与进步的哮喘肺功能下降9,10。过敏性炎症和血管生成之间的复杂网络和经典的治疗方法有限的好处在气道重构的气道炎症性疾病,如过敏性鼻炎和哮喘,导致的血管生成抑制剂的使用控制炎症,血管生成和改造过敏性疾病。
首次,它已被证实ebastine,著名的有选择性的和强有力的H1受体拮抗剂广泛用于季节性和常年性过敏性鼻炎和慢性荨麻疹,有力的抗血管生成活性,证明了在体外和在活的有机体内化验。实验使用的执行在活的有机体内凸轮检测提供了证据表明carebastine(活性代谢物)施加一个VEGF-induced血管生成反应的抑制作用。这些结果证实了免疫印迹,这表明VEGFR-2磷酸化的抑制carebastine干扰VEGF引发的信号通路。此外,抑制受体磷酸化与显著降低VEGF诱导的能力在相同的实验条件下Akt激活。最后,carebastine也能够大大块histamine-stimulated VEGFR-2和下游的一种蛋白激酶的磷酸化,表明VEGFR-2和Akt通路的抑制是通过阻止H介导的1受体的活动。在不同的抑制实验涉及VEGFR-2和H1受体,发现carebastine抑制VEGFR-2磷酸化通过干扰H1受体。因此很可能是信号下游的H1也许,受体和VEGFR-2密切相关通过一种蛋白激酶。此外,发现carebastine抑制,尽管在较小程度上,VEGFR-2磷酸化后H1受体的封锁。因此VEGFR-2 carebastine干涉,也许通过非特异性的机制,可以提出。总的来说,数据显示,抗血管生成活性carebastine介导通过H1receptor-dependent和独立的机制,但前者是普遍的。
此外,它是可能的假设,H1受体信号受到carebastine激活蛋白激酶C (PK)而不是PKA,自从PKC激活(phorbol-12-myristate-13-acetate)提高H1受体激活,而PKA不的活化剂29日。此外,histamine-induced激活的H1受体完全抑制PKC抑制剂ro - 31 - 822030.。Downregulation NF-κB可能也参与了carebastine的作用机制。确实,低浓度的H1受体拮抗剂(西替利嗪和azelastine)已经证明表达下调NF-κB并行表达抑制促炎细胞因子7。
VEGF似乎是最重要的因素参与血管生成过程发生在过敏性鼻炎9和哮喘10,在疾病的发展中起着重要的作用和持久性。事实上,VEGF及其受体的表达增加VEGFR-2过敏性鼻炎患者的鼻粘膜相比nonallergic控制12。此外,在哮喘患者的支气管粘膜,VEGF-positive细胞的数量明显增加,与船舶数量和血管区域,和表达VEGFR-1 VEGFR-2反向与气道功能16- - - - - -20.,23。BALF中VEGF水平在哮喘多血管成正比增加19,20.。此外,通过其渗透活动,VEGF导致水肿,因为它支持微血管渗漏。VEGF分泌一些炎性细胞,如巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞炎性浸润的干预成分过敏性鼻炎和哮喘12,31日- - - - - -34。它已被证实35从患者气道平滑肌细胞轻度或中度哮喘,但不是从健康(控制)主题,促进血管生成在体外。这种pro-angiogenic能力驻留在升高VEGF释放和表明,气道平滑肌细胞在哮喘气道neovascularisation进行监管。
针对目前发现,新的临床策略VEGF及其受体和信号的差别,旨在对这些可能的变应性疾病的治疗中获益。暂时,目前的数据提供了第一个证据ebastine建议其潜在的抗血管生成活性作为抗血管生成分子,除了其抗组胺剂活性血管生成的治疗过敏性疾病的发生。
支持声明
这项研究是由意大利支持癌症研究协会(意大利米兰),与教育部、大学和研究(2007年国家利益的项目)和卫生部(肿瘤项目2006)(两个意大利罗马)。支持机构没有参与收集、分析和解释数据。
感兴趣的语句
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脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年11月3日。
- 接受2009年3月10日。
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