文摘
多元蛋白质技术有可能识别生物标志物的分化、分类和改善间质性肺疾病的发病机制的理解。本研究的目的是确定30-inflammatory生物标志物面板是否可以区分健康对照组,结节病和系统性硬化症(SSc)患者独立于其他临床指标。我们也评估小组生物标志物是否可以区分肺纤维化的存在与否SSc的病人。
我们测量30个循环生物标志物在20 SSc患者,21个结节病病人和20名健康对照组使用Luminex珠技术和使用费舍尔判别函数分析建立组分类介质。
有显著差异的学习小组之间的平均浓度测量20组之间的介质,但相当大的重叠范围,限制组分化由单一的分析物的测量。然而,17-analyte生物标志物模型正确分类研究个人各自集团90%的股权,另一个14-biomarker面板正确识别SSc患者出现肺纤维化。
这些发现,如果他们被独立研究证实了在其他中心,有潜在的临床应用和可能产生新颖的见解进化免疫档案在疾病的调制。
结节病,多系统肉芽肿疾病来历不明的典型影响肺部,与upregulation单核细胞/ macrophage-T细胞辅助(Th) 1型细胞轴和多克隆B细胞活化1。系统性硬化症(SSc)是一种系统性自身免疫性疾病的特点是组织纤维化(特别是皮肤和肺),内皮细胞损伤和持久的细胞免疫激活(Th1、Th2和B细胞)2- - - - - -4。目前,SSc通常分类根据皮肤的参与程度和SSc-related的存在自身抗体,与临床表型相关。多项研究表明,血清水平的细胞因子和趋化因子是——或者在结节病和系统性硬化症患者表达下调。其中一些有潜力作为标记的疾病发展因为他们也与疾病状态和器官的参与5,6。肺纤维化,两种情况下的一个重要的并发症,目前治疗反应不佳。因此,有相当大的兴趣在生物学标志物,可能支持早期治疗干预和描绘有利的反应7。
分析平台的使用能够同时分析大量的蛋白质(蛋白质微阵列)可以改善我们的理解的机械基础免疫疾病,还可以为临床诊断识别有用的生物标志物,子分类的疾病或对治疗的反应8。蛋白质微阵列的使用在免疫学主要集中在分析分泌蛋白(细胞因子、趋化因子或生长因子)或自身抗体9。多元分析或分泌蛋白自身抗体已经报道了许多炎性疾病;然而,很少有报道使用这项技术的呼吸道疾病患者、特别是间质性肺病8,10。血清蛋白微阵列有巨大的潜在危险分层和代理标记对治疗的反应,难接近的肺定期采样。然而,这种炎症生物标记物的水平变化并非个人独有的临床条件和倾向于大幅重叠之间的条件。此外,通常很少有介质与此同时研究此类调查,随后只有介质可论证的重要值变化是用于建立临床分化切断通过应用一个阈值方法外正常的极限。这会产生严格的截止条件,只能满足一小部分的主题。然而,与个人测量相比,可能更大的特异性和包容性可能通过介质的结合。
在这项研究中,我们描述了使用蛋白质微阵列板区分健康对照组和两个不同的患者免疫驱动条件:肺结节病或系统性硬化症(条件免疫激活可能会先于肺纤维化的发病)。本研究的主要目的是研究炎症概要文件使用multibiomarkers组成的细胞因子,趋化因子,生长因子和评估个体介质或介质板是否可以将研究参与者为他们的三个不同的组(健康对照组、结节病和系统性硬化症)生物测量的基础上。其次,我们试图探索multibiomarker面板是否可以区分SSc的存在和缺乏肺纤维化。第三,我们评估了介质在健康和疾病之间的相关性的复杂性。我们发现一个multibiomarker面板的17个分析物分类对象各自的临床组。我们建议独立验证这些发现和进一步发展的蛋白质微阵列可以提供洞察肺纤维化疾病的发病机理和临床发展的生物标志物面板。
材料和方法
病人招聘
从结节病和SSc病人血清得到。所有患者满意接受国际诊断标准的条件11,12。人口统计信息表1中给出⇓。鉴于这两种疾病的流行病学是不可能满足患者组年龄或性别。患者被排除在外,如果他们服用皮质类固醇治疗> 10毫克每天强的松或等价的,或如果他们任何强大的二线免疫抑制剂,如环磷酰胺、硫唑嘌呤或甲氨蝶呤。生物标志物结果分析后,对任何混杂性的影响,年龄或治疗。从健康对照组血清是来自一个匿名研究血清银行在肯尼迪学院举行,查林十字医院,帝国理工学院医疗NHS信托(英国伦敦)和期间收集的这些都是本研究中所占的比例。样品处理和存储在相同的历史和最近的控制和患者团体。道德许可,本研究从普顿获得Harefield和NHLI伦理委员会(REC 02 - 002 - 01 - 257)。
实验方法
30蛋白质测定血清中使用荧光bead-based技术(Luminex®公司,TX,美国)。的分析进行了符合设备制造商。总之,antibody-conjugated珠子也准备和整除为96 - pre-wetted滤板,之前的100μL标准解决方案在指定井或100μL血清,测定稀释剂稀释1:2。添加生物素化的后续步骤洗点缀的探测器抗体,后来Streptavidin-RPE解决方案。最后,板放置于100年的XY平台Luminex仪器进行分析。STarStation软件被用于数据采集和分析。标准曲线是为每个分析物生成,每个分析物的平均荧光强度值在每个被转化成一种浓度使用标准的线性部分的所有检测到的值。这个值被乘以稀释系数2给原始血清中的分析物的浓度。
荧光珠(FIDISTM),本研究从生物医学诊断(BMD,波布尔Croissy,法国)。生物标志物化验是分类根据其主要免疫功能如下:先天免疫(白介素(IL) 1、6、8, -12 p40, -15年,干扰素(IFN) -α,肿瘤坏死因子(TNF) -αTNF-RI和TNF-RII),适应性免疫(2、4、5,-10,-13,-17和IFN-γ),趋化因子interferon-inducible蛋白质(IP-10)引起的monokine IFN-γ(MIG)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α,MIP-1β,激活规范,正常T细胞表达和分泌(咆哮)、单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1和eotaxin,生长因子(粒细胞集落刺激因子(g - csf)集落刺激因子(gm - csf)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF),纤维母细胞生长因子基本(FGFb)和血管内皮生长因子(VEGF)),和死亡受体5(博士)。
数据分析
为个体血清介质,利用克鲁斯卡尔-沃利斯发现了学习小组之间的差异测试。假定值< 0.05时Mann-Whitney测试是用来比较对来自这三个地方。斯皮尔曼等级相关的用于建立分析物的水平在每个学习小组之间的相互关系。这里我们报告所有的相关性和突出“强相关性”生存Bonferroni调整为多个比较(p < 0.001)。
费雪的判别函数分析用于多组分类。一个变量是输入到“模型”如果f值的显著性水平是< 0.05,删除如果显著性水平> 0.1。模型被用来分类每个案例诊断组。交叉验证也包含在每种情况下的表型分类的功能源于以外的所有情况。我们测量了比例模型的准确性,即。正确预测的百分比由模型,和接收方运营商曲线(ROC)了解模型的决策能力,即。怎么可能是准确的模型分配一个个人正确的组中其他两组。概率判别分析的一个案例属于一个特定的诊断类别是用来构建中华民国的模型。判别函数分析也用于确定哪些变量可以区分硬皮病患者和肺纤维化。所有的分析是使用SPSS进行发掘软件包(美国SPSS,芝加哥,IL)。
结果
分析个体的血清蛋白质
20血清蛋白质被升高的一个或两个病人组与控制(表2⇓)。先天免疫系统细胞因子il - 1、6、8, TNF-RI TNF-RII和生长因子EGF和HGF在这两种疾病的上升。在硬皮病有海拔Th1趋化因子(IP-10,米格,MIP-1αMIP-1β),Th2趋化因子(MCP-1和eotaxin), Th17细胞因子IL-17。在结节病有海拔Th1趋化因子(IP-10、米格MIP-1α,MIP-1β和咆哮)(表3所示⇓)。有相当大的重叠,两疾病组之间血清细胞因子水平,这样是不可能单独分类的病人使用个别蛋白质含量(见图1⇓)。
选择健康对照组血清蛋白水平,结节病和系统性硬化症(SSc)的病人。-10年)Interferon-inducible蛋白质(IP)。增加水平与结节病的健康控制人口和SSc相比(p < 0.001)。b)单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1。水平与健康相比,SSc控制人口增加(p < 0.001),结节病(p = 0.005)。c)肝细胞生长因子(HGF)。增加水平与结节病的健康控制人口和SSc相比(p < 0.001)。测量检测阈值有以下任意值的0.1 pg毫升−1。单杠每组代表该组的中值。健康控制人口的第95个百分位表示(·····)。#:p = 0.005。* * *:p < 0.001。
我们确实发现了一些细胞因子水平差异组根据并发症。当结节病病人分类根据肺浸润、纤维化的存在与否,只有il - 6显著增加(p = 0.026)患者肺浸润、纤维化(胸片II-IV阶段),而与患者没有肺浸润/纤维化(0我阶段)。在硬皮病,我们观察到显著增加的EGF (p = 0.027)为反- sci - 70自身抗体阳性与反sci - 70年-团体。我们寻找治疗的任何干扰。在结节病,il - 6显著提高患者治疗与不治疗(平均44.2 pg·毫升−1与9.0 pg·毫升−1;p = 0.036)表明它可能是更严重疾病的标志。在硬皮病,FGFb未经治疗的患者明显高于治疗(平均31.0与0.1 pg·毫升−1;p = 0.032)和eotaxin未经治疗的患者与健康对照组相比升高(p = 0.002),这表明血清水平可能减少糖皮质激素治疗。然而,这些分析的初始利用克鲁斯卡尔-沃利斯表示事后方法当纠正为多个比较这些协会不生存修正。然而,这里报道倾向的意义,因为它可以形成独立的验证性研究的基础。
血清生物标志物水平之间的相关性
我们进行了相关分析建立底层蛋白质网络在每个学习小组。想象这些相关性的节点/顶点格式我们使用血清蛋白质视为节点和重要相关性的线/顶点图显示(见图2⇓)。在健康对照组有很强的正相关性之间IL-17 Bonferroni调整后(p < 0.001)和TNF-αIFN-α和粒细胞集落刺激因子之间的负相关性(包含和MIP1β和EGF(图2⇓)。在结节病炎症蛋白质网络的拓扑结构是不同的,似乎有积极的引发和表皮生长因子之间的相关性,TNF-α和il - 1(图2 b⇓)。il - 1水平与il - 6水平还强烈相关。最复杂的炎症网络硬皮病患者的观察(图2摄氏度⇓),有三个重要的关系;gm - csf和il - 1之间的正向关系,MIP1-αIL-15,之间的正相关性TNF-αIL-15和IL12p40和消极的咆哮和IL-15之间的相关性,2、il - 4和IFN-α。
图形表示的)健康对照组血清中介水平之间的相关性,b)结节病病人和c)系统性硬化症患者,使用节点/顶点格式与重大相关性的强度由连接器线厚度。博士:死亡受体;EGF:表皮生长因子;HGF:肝细胞生长因子;IL:白介素;知识产权:interferon-inducible蛋白质;米格:monokine IFN-γ引起的;MIP:巨噬细胞炎症蛋白;咆哮:调节激活正常T细胞表达和分泌;肿瘤坏死因子:肿瘤坏死因子; NEG: negative; IFN: interferon; GCSF: granulocyte colony-stimulating factor; MCP: monocyte chemoattractant protein; FGF: fibrobiast growth factor; GMCSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; VEGF: vascular endothelial growth factor.
介质的学习小组的分化组合
我们使用判别分析建立一个“模式”,可以最佳预测哪一组(健康对照组,结节病,SSc)所属。使用所有病例在这项研究中我们发现了一个17介质(il - 1、TNF-αIL-15, TNF-RI, TNF-RII, IFN-γ,- 2、VEGF, IP-10, FGFb, MCP1, MIP1α,咆哮,g - csf, eotaxin, HGF, MIG),可用于组例健康对照组,结节病或SSc。17-cytokine概要文件正确分类89.5%的病例。限制这种类型的分析是细胞因子可能是偏见来自少数患者的结果。我们然后旨在发现通过构造一个新的分析模型,每个病人反过来从原始数据集和17-cytokine概要文件中删除从其余病例获得被用来确定省略的情况下可以被正确地分类属于健康控制、结节病或SSc病人组。这种分析正确分类省略了病例的84.2%。我们也随机分配原始情况下到训练队列(原始病例的60%),以获得新的分类函数系数的17个分析物,然后应用新获得的参数测试队列由剩余的病例。正确训练队列正确分类94.2%的病例和75.6%的情况下测试队列被正确分类。总的来说,观察,分类精度比例最高的为健康对照组和SSc健康对照组患者显示最好的分类精度。的比例算法分类精度的三组如表4所示⇓。ROC曲线下的面积根据判别函数分析案例属于一个特定的诊断类别的概率是健康对照组= 0.97;结节病= 0.96;SSc = 0.98。
我们也评估的准确性的贡献最多的分析物生成的预测算法。IFN-γ,我们确定了六个分析物,TNF-RII IP-10,咆哮,HGF和米格,主要贡献者的分类模型与原始分组病例的78.9%被正确分类相应的组仅在这些分析物。这个模型的ROC曲线下面积为健康对照组= 0.97,结节病= 0.90,SSc = 0.93。
我们也想探究是否证明原则由于小数量的情况下,这种方法也可以应用于区分肺纤维化的存在与否SSc的病人。14个变量,il - 6, TNF-α、IFN-αIL-17, IP-10,米格,HGF, VEGF, TNF-RII, g - csf, IFN-γ,MCP-1,咆哮和IL-5,分类准确率达到了100%患者有或没有肺纤维化,以90%的情况下正确地分类交叉验证,虽然患者不允许任何进一步的验证。
讨论
这项研究表明,血清蛋白微阵列有能力区分健康个体和病人两个条件:结节病和系统性硬化症。在这两种疾病,呼吸道并发症的发病率和死亡率的主要原因。然而,参与的程度是可变的和标记分类情况下可能进展或可能的候选免疫导向治疗是必要的。
中等水平的个体细胞因子分析证实了先前发表的研究显示upregulation IL-1β,il - 6,引发,il - 10, IL-12p40, IL-15, IL-17, TNF-RI, TNF-RII, MIP-1α,MIP-1β,MCP-1, HGF和IP-10 SSc的病人13- - - - - -23和引发upregulation TNF-RI、TNF-RII IL-12p40, MIP-1α,MIP-1β,米格和IP-10结节病24- - - - - -27。新奇的发现,据我们所知,为其他个体生物标志物包括增加血清IFN-α,米格,IP-10, DR5 SSc病人eotaxin水平和升高的血清水平的咆哮,DR5, EGF和HGF与健康对照组相比,结节病。对于某些蛋白质(尤其是VEGF在两种疾病)和MCP-1结节病,我们无法复制先前的报道26,28和这些矛盾的结果可能的原因包括测定灵敏度和/或患者人群的选择。另一个有趣的观察是变量之间的相关性的复杂性介质的三组。从节点/顶点表示,很明显,在SSc介质之间有更复杂的相关配置文件比其他两组。
结节病和SSc共享功能的免疫激活和肺纤维化的发展。尽管增加识别炎性介质水平在结节病和SSc,没有单一的蛋白质被证明能够控制之间的歧视,结节病和SSc,类似的观察是一致的其他间质性肺疾病的研究强调了在最近的一次审查29日。这主要是由于这一事实,甚至对于那些介质中多数患者超过第95百分位的正常范围,疾病组之间有相当大的重叠。因此,我们研究超出了个人分析物水平,探索结合介质是否更丰富的临床组织分化。为此,我们构建了一个使用ROC 17-analyte分化模型来洞察模型的决策能力和检查正确预测的准确性由模型自AUC和准确性提供不同的信息30.。我们观察到的结合17-multimarker面板能够区分,有89.5%的准确度,三个临床不同组之间血清炎症介质水平的基础上。这个小组的鲁棒性分析物被交叉验证和验证,另外,随机选择的子集的病人。即使减少到六个“核心”分析物,一个模型临床集团建立了分类精度为78.9%。有趣的是,许多分析物导致模型没有调节特定疾病的方式。这就提出了一个问题的常见做法是否限制分析物只选择那些显而易见的中值水平差异是合理的,特别是小额外的歧视性的信息获得通过选择介质,或一起表达下调。我们也想探索,证明的原则,是否同样的方法可以用来区分SSc组之间患者有无肺参与子集。然而初步观察,生物测量区分肺纤维化的存在和缺乏SSc表明炎症生物标记可能是有用的在评估肺纤维化的发展这种疾病。这些数据,虽然诱人,但需要确认需要连续测量在一个大群体,它可以猜测,结合了其他蛋白质(例如,改变增长factor-β1,结缔组织生长因子和血小板源生长因子),与这种疾病的病理。
总之,我们表明,血清蛋白概要文件可以区分结节病,SSc和健康对照组。此外,多元蛋白质技术可以区分的存在和缺乏肺纤维化患者SSc。虽然这个工具是更复杂的比通常的指标用于制造一个明确的诊断,确定针对疾病的中介配置文件携带不同的可能性,这些资料可以探索在未来变化的跟踪疾病的演变,对治疗的反应或分化表型不寻常的或重叠模式。这些发现,如果他们被独立证实,从其他中心前瞻性验证群组,有潜在的临床应用和可能产生新颖的见解免疫呼吸道疾病的基础。在未来的工作中,能被探测到的蛋白质的范围可能扩大,研究是必要的评估变化的预后价值在特定疾病概要文件。
支持声明
这项工作由慷慨的资金支持来自英国雷诺氏和硬皮病协会,关节炎研究运动和Asmarley慈善信托。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2009年2月17日。
- 接受2009年5月28日。
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