抽象
这很可能是多基因有助于免疫球蛋白(Ig)电子生产。共刺激分子是抗原呈递细胞和T淋巴细胞,其驱动IgE应答之间的串扰是至关重要的。
我们评估单倍型标记多态性的基因 - 基因相互作用的24共同刺激基因有关血清IgE水平的途径。We assessed this at ages 1–2 yrs and 6–8 yrs in 3,062 Dutch children from a pooled data set of three birth cohorts: PIAMA (Prevention and Incidence Asthma and Mite Allergy), PREVASC (Prevention of Asthma in Children) and KOALA (Child, parents and health: lifestyle and genetic constitution).
与血清IgE水平单和多轨迹关联(第三与采用卡方检验和多因素降维(MDR)方法对下列共刺激基因进行评价:VTCN1,TNFRSF4,TNFRSF18,TNFRSF14,TNFSF18,TNFSF4,CD28,CTLA4,国际安全和发展理事会,PDCD1,BTLA,CD80,CD86,HLA-G,CD274,PDCD1LG2,CD276,LILRA4,LILRB1,LILRB2,LILRB4,CD40,ICOSLG和CD40LG。我们发现多个有统计学意义的单基因座(年代)和多位点(M)基因关联VTCN1SM,TNFSF18SM,TNFSF4年代,CD28年代,CTLA4米,国际安全和发展理事会年代,BTLA米,CD80米,CD86SM,CD274SM,PDCD1LG2米,LILRA4SM,LILRB4米和CD40SM与血清IgE。两座位互动CD86与VTCN1和CD274与LILRA4通过回归得到了证实。
综上所述,血清IgE水平在共刺激通路中受到多种基因-基因相互作用的调节。我们建议在遗传研究中采用多基因-基因相互作用的研究策略。
特应性疾病如哮喘、花粉热和特应性皮炎起源复杂,即。这些疾病的发展是由于遗传变异体和环境因素之间的相互作用。这是越来越明显,基因发挥只有一小,甚至没有对过敏体质的自身发展的影响,以及它们可协同作用1。为了通过关联分析确定哪些基因有助于特应性疾病的发生,应该采用一种能够将多个基因中的单核苷酸多态性(SNPs)结合起来的研究策略。多因素降维(MDR)方法是一种很有前途的多因素疾病计算方法2。
特应性反应的一个核心特征是血清总免疫球蛋白(Ig)E的增加。IgE合成和调控的一个关键控制点是共刺激激活t淋巴细胞的必要性。t淋巴细胞通过与抗原呈递主组织相容性复合体(MHC) II类分子结合的t细胞受体识别抗原呈递细胞(APCs)。随后通过共刺激分子整合各种阳性和阴性信号是分化和激活t淋巴细胞的必要条件。激活的t淋巴细胞可以引导免疫反应,当被引导到T-helper-2反应时,它们会诱导b淋巴细胞产生IgE。由于编码共刺激受体和配体的基因在t淋巴细胞的分化和激活中起着关键作用,因此它们是极有希望的特应性疾病候选基因。事实上,以前的单候选基因研究结果表明,共刺激基因的多态性,例如CD863.,CD404,CTLA45,HLA-G6,ICOS7和PDCD18,可能影响对特应性疾病的易感性。
我们假设编码共刺激受体和配体的基因多态性影响对IgE水平升高的易感性。我们评估了共刺激通路基因的单倍型标记单核苷酸多态性与血清IgE水平的关系,这些数据来自参与荷兰三个出生队列的3062名儿童9at ages 1–2 yrs and 6–8 yrs. In addition to studying the main effects of these genes, we investigated two-, three- and four-locus gene–gene interaction with respect to serum IgE levels using MDR.
对象和方法
研究人群
致敏研究9包括三个未来的荷兰出生队列相似的设计,即。预防和发生哮喘和螨虫过敏10,PREVASC(哮喘的预防儿童)11,12和考拉(孩子、父母和健康:生活方式和遗传结构)13。遗传研究是由参与机构的当地医学伦理委员会的批准。所有的家长签署知情同意书。
IgE的测定
Total IgE levels were determined in capillary or venous blood collected at age 1 and 8 yrs in PIAMA, age 1, 2, and 6 yrs in PREVASC, and age 1 and 2 yrs in KOALA (Sanquin Research, Amsterdam, the Netherlands). Total IgE levels were measured by radioimmunoassay as described previously14- - - - - -16并表示为IU·毫升−1(1 IU = 2.4 ng of IgE). Total IgE measurements were clustered at age 1–2 yrs and 6–8 yrs and analysed in tertiles (see supplementary material).
SNP选择和基因分型
单体型标记单核苷酸多态性是从人类基因组单体型图数据库中选择的17或先天免疫网站18根据SNP的具有> 0.1在每个数据库中可用的次要等位基因频率的数量最多。另外,生物医学文献中筛选已知具有功能性影响或与哮喘或特应性相关的候选基因的SNP内。基因组DNA从使用标准方法口腔拭子或血液中提取19。DNA通过使用REPLI-克超快技术扩增(Qiagen公司TM;芬洛,比荷卢BV,荷兰)。基因分型是通过使用卡斯帕竞争等位基因特异性PCR进行TM化学基因分型,通过K-生物科学(赫特福德郡,UK)按照合同执行。基因型数据的质量通过K-Biosciences公司的标准保证和验证的为基因组比较基因分型结果与在孩子们的一个子集扩增的DNA。
统计方法
所有snp采用卡方统计分析哈迪-温伯格平衡(p>0.01)。我们使用卡方检验来分析该通路中的基因型是否与1-2年和6-8年血清IgE水平升高相关(最高)与通过使用一个共显性模型。对于p值<0.10的SNPs,采用Akaike信息准则确定最佳拟合遗传模型(加性、显性或隐性)。优势比和95%置信区间采用logistic回归分析。x染色体上的snp分别在男性和女性中进行分析。采用SPSS 14.0统计软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行计算,p<0.05(双侧)为显著性。
单倍型在病例和对照中的每个基因和频率分布可用由最大期望算法估计的SNP构成。在这些频率分布的差异通过对数似然比检验(在内部软件)来评价。由于单倍型SNP标记选择使用多标志物预测捕获基因的全部信息(即。激进的标记),我们也分析了由多个单核苷酸多态性通过构建单倍型捕获的SNP。
使用MDR(1.0.0版本)基因与基因的相互作用进行了分析。该MDR的方法前面已经描述20.(在线看补充材料)。平均预测误差的显着性使用MDR置换检验和p值<0.05被认为显著计算。进行Logistic回归分析,以确认显著双向互动的结果,从MDR分析,如果交互项是显著(在乘法模型)的最佳拟合遗传模型,例如显性或隐性,进行了分析。
结果
研究人群
In total, 3,062 children were genotyped and 2,927 Dutch children were selected for genetic analyses (table 1⇓)。非荷兰血统的儿童(5.7%)被排除在进一步的分析之外,因为纳入非白种人可能由于人口分层而导致虚假的遗传效应。血清IgE tertiles测定的临界值(见网上补充资料)确定了1-2岁的503例和541例对照,6-8岁的307例和308例对照。
SNP选择和基因分型
145年代NPs of the following 24 genes relevant to co-stimulation were selected for genotyping (fig. 1⇓;表E2在补充材料):VTCN1(也叫B7-H4/B7x);TNFRSF4(OX40);TNFRSF18(GITR);TNFRSF14(HVEM);TNFSF18(GITRL);TNFSF4(OX40L);CD28;CTLA4;国际安全和发展理事会;PDCD1(PD-1);BTLA;CD80(B7-1);CD86(B7-2);HLA-G;CD274(B7-H1/PD-L1);PDCD1LG2(PD2L);CD276(B7-H3);LILRA4(ILT7);LILRB1(ILT2);LILRB2(ILT4);LILRB4(ILT3);CD40;ICOSLG;和CD40LG(CD40L)。5个SNP未能放大;一个SNP是单态(rs7602383,国际安全和发展理事会)。基因型为三个位,rs1181390(CD28),rs9848900(CD86)和rs7565639(PDCD1), deviated from Hardy–Weinberg equilibrium in controls (at 1–2 yrs and/or at 6–8 yrs of age) and were not considered for further analyses leaving 136 SNPs for SNP and haplotype analysis. MDR analyses were performed with all 136 SNPs and a selection of 54 SNPs, after exclusion of 80 SNPs that were in linkage disequilibrium (LD; D'>0.8) with one or more SNPs (table E2 in the supplementary material).
SNP分析
A total of eight SNPs in four genes were significantly associated with serum IgE at age 1–2 yrs at either the allele or genotype level, and 13 SNPs in seven genes at age 6–8 yrs (p<0.05; table 2⇓和3⇓)。单核苷酸多态性在CD40和LILRA4在两个年龄组中都与IgE有关,但在不同的snp中,即。1-2岁时为rs3746821和rs3745419, 6-8岁时为rs3765459和rs2241384。有趣的是,两个基因的相关snp均显示高LD (D' = 0.8和r2 = 0.03 for both SNP combinations). None of the single SNP associations remained significant when corrected for multiple comparisons using false discovery rate (data not shown).
单倍型分析
我们构建了单元型组合所有标签SNP为所捕获的非基因分型的SNP(表E3中的补充材料),每个基因和单体型。一CD86在1-2岁的病例中,单倍体明显比对照组更普遍(10%)与6% p = 0.01)。这CD86单倍型包含由rs2681415和rs2681411构建的标记非基因型SNPs rs9872438和rs2681408的单倍型。与1-2岁的对照组相比,这些snp组合的小等位基因在病例中明显更为普遍(12%)与7%, p = 0.0002). Another haplotype, consisting of two minor alleles forICOSLGrs2070561 and rs3746963, was less prevalent among cases compared with controls at age 6–8 yrs (16%与22% p = 0.04)。
MDR分析
表4⇓显示出最佳的多基因座模型升高血清IgE考虑一个,两个,三个和四个位点中的所有共刺激基因时检测由MDR。At age 1–2 yrs, the prediction error of each model was statistically significant (p = 0.03, p = 0.02, p = 0.02, and p = 0.02, respectively) based on 1,000 permutations. At 6–8 yrs, the two-, three-, and four-locus models showed statistical significance (p = 0.04, p = 0.02 and p = 0.01, respectively). At both ages, multiple synergistic interactions between SNPs were observed, as indicated by the red and orange colour in the dendrograms (fig. 2⇓)。
通过常规逻辑回归分析,确定了最佳双基因座模型的基因-基因互作效应。在1-2岁时,最好的双位点模型即。rs10804556(CD86)和rs12030415(VTCN1),表现为没有协同效应的树状图(图2a)⇑)。对于这对SNP的计算的信息增益(基于熵)指示冗余,这可以被解释为在并联冗余方式来增加IgE的作用在两个SNP。Logistic回归分析揭示了与每个SNP的次要等位基因,个人有增加的风险形成升高的血清IgE水平,并且这种风险并没有同时具有SNP的次要等位基因的个体进一步增加。A borderline statistically significant interaction existed between the SNPs in logistic regression analysis (p-value for interaction 0.058; fig. 3a⇓)。At age 6–8 yrs, the dendrogram showing the relationship between rs4143815 (CD274)和rs2241384(LILRA4) indicated synergistic interaction (fig. 2b⇑)。Logistic回归分析显示,携带任何SNP的一个或两个小的等位基因的个体有风险降低开发血清IgE升高。In contrast, this decreased risk was not observed in individuals having one or two minor alleles of both SNPs, as indicated by a statistically significant interaction (p = 0.004 for interaction; fig. 3b⇓)。
整合分析策略
表5⇓显示1-2岁和6-8岁共刺激通路与IgE的单SNP、多位点和单倍型关联。在考虑基因层面的关联时,有三个基因,即。CD86,CD274和LILRA4,在1-2岁和6-8岁时均与血清IgE显著相关。三个基因,即BTLA,CTLA4和VTCN1,在1-2岁时表现出相关性,而在6-8岁时没有。另外五个基因,即CD276,国际安全和发展理事会,LILRB4,TNFSF4和TNFSF18,showed association at 6–8 yrs, but not at 1–2 yrs.
有趣的是,基因中有12个snpBTLA,CD40,CD80、CD86 CD274,CD276,CTLA4,LILRA4,LILRB4和VTCN1多基因模型相关联,并在单SNP或单倍型分析没有关联与IgE。因此,通过鉴定MDR基因变异的多基因座的分析,与升高的血清IgE相关联,而无需主效应。
讨论
这study evaluated single SNPs, haplotypes and multi-locus associations of haplotype tagging SNPs in a pathway of co-stimulatory genes and their association with the predisposition to elevated serum IgE levels at ages 1–2 and 6–8 yrs. We expand current knowledge by showing that within a biological pathway multiple gene combinations contribute to serum IgE levels. We found multiple multi-locus associations which showed statistical significance. One-, two-, three- and four-loci models were found to better predict the presence of elevated serum IgE than would be expected by chance. Some polymorphisms were not significantly associated when tested in a single SNP analysis, yet they were significantly associated in the multi-locus models. This stresses the importance of applying research strategies that model multiple interactions in genetic association studies.
已经证实,多个基因参与了血清IgE升高的易感性1,23- - - - - -25。相较于用于过敏性疾病的MDR方法等的研究,我们发现了许多统计学显著多座车型23- - - - - -25。这是最有可能的,因为我们评估基因的生物途径,而以往的研究选择基因的基础上,早期报告的联系与特应性疾病。
一些评估基因以前被描述为联想在单基因的关联研究特应性表型,例如CD863.,CD404,CTLA45,26,HLA-G6,ICOS7和PDCD18,但也发现其他基因与特异反应无关,如CD285和LILRB427。A summary of these association studies is presented in table E4 of the supplementary material. Herein, we confirm the main effects of the genesCD86,CD40和国际安全和发展理事会相对于血清IgE水平。此外,我们发现,LILRB4,这似乎没有对单一基因的关联研究IgE水平主要作用5,27,影响IgE水平与其他基因多态性的相互作用。虽然我们没有找到主要的影响CTLA4,HLA-G和PDCD1,我们的结果不符合先前的研究矛盾,因为相关的特应性表型是不同的,例如草花粉特异IgE (PDCD1)或哮喘和气道高反应性(HLA-G),或者研究评估个体的不同的子组,例如女性(CTLA4)或成人哮喘患者(CTLA4)。
IgE的产生被称为儿童期增加,某些基因的影响可能是特定年龄28。因此,我们在两个不同年龄组与IgE测试协会。The single- and multi-locus models were different between the age groups 1–2 and 6–8 yrs, suggesting that genes in this pathway indeed have age-specific effects on IgE development. However, in our unbiased approach, by applying MDR analysis, only the best models for each data set are given by MDR. Since multiple loci in this pathway may be associated with IgE development, these loci may compete with each other causing different results in each age group. Therefore, we conclude that MDR is not suitable for comparison between data sets in different age groups.
在确定的相互作用中,MDR表明大多数模型中的相互作用类型是协同的。两位点模型的logistic回归中负向的基因-基因相互作用表明,这些基因的多态性相互抵消。这在生物学上似乎是合理的,因为通过抵消小的基因变异的影响,免疫系统将防止自身因小的基因变化而脱轨。此外,对多位点模型的生物学解释是相当推测性的,但目前的数据提供了一个初步的建议,即通过改变共刺激信号可以激活过敏原特异性t淋巴细胞的反应。因此,被研究的基因可能是t淋巴细胞激活和随后IgE产生的重要的稳态调节因子。
我们的结果支持了多种基因-基因相互作用通过微调淋巴细胞反应参与IgE调节的假说。t淋巴细胞的激活除了需要t细胞受体- mhcii /peptide复合物识别外,还需要APCs上共刺激分子提供的额外二级信号。t淋巴细胞上的CD28与其两种配体B7-1 (CD80)和APCs上的B7-2 (CD86)的相互作用被认为是最佳t细胞反应的主共刺激通路29。CD86在APCs上以低水平构成性表达,受到刺激后迅速上调,而CD80是诱导的,比CD86晚表达。与CD28提供的刺激信号不同,CD80或CD86与CD28同源CTLA-4的相互作用诱导信号下调t细胞的激活。CTLA-4只在CD4上表达+CD25+调节性T淋巴细胞和被诱导在活化的T淋巴细胞,和CTLA-4信号传导在调节过敏性疾病的强度的重要的作用30.。
我们研究的优势在于样本量大,前瞻性随访,这使我们能够评估共刺激通路多态性在两个年龄组的影响,这两个年龄组代表了不同的免疫系统发展阶段的早期儿童和小学年龄。在儿童期特应性发展的重要遗传机制的成功鉴定之前已在致敏队列中发表9,显示其在遗传研究方面的巨大潜力。此外,单倍型标记SNPs的选择使得我们不太可能错过来自基因的重要信号。
为了充分理解我们的结果,我们也应该考虑到我们的研究提供一些潜在的局限性。首先,环境影响并没有在我们的分析中考虑。一些研究表明,环境影响,可在特应性疾病的发展是非常重要的,我们建议在今后的研究考虑这些。作为招聘战略的结果,我们的研究是具有相对较高的数量与特应性父母和我们的研究结果孩子的选定群体可能不能完全代表普通人群的。其次,同伙是参加各年龄组所占比例是可变的,即。in age group 1–2 yrs all cohorts contributed to the IgE measurements whereas at age 6–8 yrs only IgE measurements of PREVASC and PIAMA could be evaluated. As a result, age groups may have been subject to different selection effects or variable environmental exposures and may, therefore, not be completely comparable. Therefore, it is important to note that several genes were associated with IgE at 1–2 yrs as well as 6–8 yrs, internally replicating our results.
当使用虚假发现率多重比较校正单SNP协会没有保持显著。然而,由于所评估的SNP单之间的连锁不平衡,执行统计测试并不是完全独立的,并校正可能过于保守。我们基于1000个测试排列从MDR分析的意义得到最好的榜样。To assess if our results in the pooled cohorts at age 1–2 and 6–8 yrs were valid, we investigated whether we could replicate the observed two-way interaction in our separate cohorts. Indeed, we found a similar and significant interaction in two different cohorts at age 1–2 yrs in logistic regression analyses, with p-values for interaction being 0.008 and 0.03 for the PREVASC and KOALA cohort, respectively. We were unable to replicate the borderline significant interaction we observed in the full cohort at age 6–8yrs in the two separate cohorts. This interaction was observed in the PIAMA (n = 437) but not the PREVASC cohort that contained lower numbers of individuals (n = 130).
本研究中发现的相关snp是基于单倍型选择的;因此,它们的功能作用并不明确。此外,MDR是一种新的技术,可以认为是一种无偏的数据挖掘方法。因此,本研究可以看作是假设的产生。在共刺激途径中选择的重要基因现在可以指导复制研究和功能分析。这可能最终导致早期预防特异反应性发展的新目标。
总之,血清IgE水平由共刺激途径的许多基因的多个基因 - 基因互作效应调节。我们观察到发生在生物学上可行办法的遗传相互作用。我们的研究结果牵连而没有考虑一个基因以及多个基因的多个交互的基因位点的影响分析方法,将复杂性状的遗传贡献的已完成调查工作将是不可能的。
支持声明
本研究由Zon-MW资助(资助号912-03-031;海牙,荷兰)。G.H. Koppelman由Zon-Mw VENI资助(编号91656091)。
感兴趣的语句
无声明。
致谢
笔者想感谢PIAMA,PREVASC和KOALA研究的儿童和家长的参与。此外,我们承认现场工作人员,秘书和科学合作者致力于PIAMA,PREVASC和KOALA同伙,M. Bruinrnberg(遗传学系,格罗宁根大学医学中心,格罗宁根,Gronigen,荷兰的大学),他对DNA的意见隔离,处理和基因分型,I诺尔特(流行病学系,格罗宁根大学医学中心,格罗宁根大学)为她的单倍型分析建议,并A.面包车奥斯特豪特(变态反应和医学生物学肺病,部门和病理学,大学实验室医疗中心格罗宁根,格罗宁根大学)为他的基因选择建议。我们感谢J.H.穆尔(达特茅斯医学院,汉诺威,NH,USA),他有帮助的评论对我们相对于MDR分析问题。
脚注
该制品具有访问辅助材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到2009年2月4日。
- 接受2009年6月11日。
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