抽象的
气道树突状细胞(DCs)在吸烟相关肺部疾病中起关键作用;然而,烟草烟雾对人体气道dc的急性影响体内不明。
共有16名吸烟者接受了两次支气管肺泡灌洗:直接在4-H的非莫宫(无烟暴露)之后;直接在4小时后烟熏(急性烟雾暴露)。在支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中,使用流式细胞术,髓样DC(MDCs)和血浆谱DC(PDC)以及MDC上的功能相关表面分子。
与没有烟雾暴露相比,巨噬细胞,淋巴细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞和PDC的数量不变。相比之下,BALF中的MDC数量强烈增加,急性烟雾暴露后血液中MDC数的伴随减少。此外,急性烟雾暴露导致表面分子血液树突细胞抗原1和4的表达的增加,以及肺归巢受体,CC趋化因子受体5的表达的降低,CC趋化因子5,BALF中的MDC。
急性烟草吸入导致立即和选择性地招募MDC进入人类气道,这可能反映了自适应免疫系统对烟雾暴露的早期反应。
吸烟是发炎肺病如慢性阻塞性肺病(COPD)的主要风险因素1,2或肺朗格汉斯的细胞组织细胞菌(PLCH)3.,4.导致这些疾病的机制仍然不完全清楚5.然而,树突细胞(DCS)和淋巴细胞在肺部内的积累,以及它们与疾病严重程度的关系,表明适应性免疫反应在这些疾病中起着作用4- - - - - -9.Airway DCS在肺中启动和控制适应性免疫应答10..在气道中抗原吸收11.,DCS迁移到排出的淋巴结,以将抗原信息呈现给专用淋巴细胞,其组织对遇到的抗原的炎症反应10..此外,DC也可以在肺部局部局部局部呈现抗原淋巴细胞9,12..
慢性卷烟吸烟者在航空公司中显示朗格汉斯的细胞数量,粘粒剂(MDCS)的亚型,13.- - - - - -15..在患有慢性阻塞性肺病的吸烟者的气道中发现了更多的朗格汉斯细胞6或犁3.,16..然而,朗格汉斯细胞表型在这些疾病发病机制中的意义尚不清楚。使用最近描述的流式细胞术分析人支气管肺泡灌洗液(BALF)中的DCs17.,18.,在慢性卷烟吸烟者中表征了气道MDC上的功能相关表面分子的表达15..吸烟者气道mDCs的共刺激分子CD80和CD86表达增加,但淋巴结归巢受体CC趋化因子受体(CCR) 7表达减少15..这些发现导致了吸烟者MDC的假设可能表现出诱导T细胞反应的能力增加,而是降低迁移到排水淋巴结的能力15..
与长期接触烟草烟雾的影响相比,目前还没有关于烟草烟雾对气道树突状细胞的急性影响的信息体内.探索气道dc的动物模型使用了暴露烟草烟雾≥1天的方案19..人类研究探索肺免疫细胞吸烟的急性作用并未调查气道DCS20.,21..因此,本研究的目的是研究急性烟草烟雾暴露对人气道DCs数量和表面分子表达的影响体内.使用上述流式细胞术方法17.,18.在分析4小时急性烟雾暴露的4小时后,BALF中的MDC和血浆谱系DCS(PDC)直接在急性烟雾暴露之后,并将结果与在吸烟禁欲4-H期间直接获得的参数进行了分别的参数。选择这种早期分析以测试适应性免疫系统在气道中的可能快速反应。该决定是基于来自McWilliam的先前数据et al。22.他描述了树突状细胞迅速流入大鼠气道,在抗原暴露2小时后达到峰值。
方法
参与者
参与者在罗斯托克(德国)招募,使用下列纳入标准:1)岁20-50岁,2)当前吸烟者≥10卷烟·日−1.排除标准如下:1)任何慢性疾病的历史,2)任何正规用药,3)在支气管镜检查前2周内呼吸道感染的任何迹象。该研究得到了梅克伦堡 - 沃尔波姆普通医疗委员会(德国罗斯托克)的伦理委员会批准。该研究在Clinicaltrials.gov注册(试验号码nct00740896.)。所有参与者都提供了书面知情同意书。
学习规划
所有参与者在两个时间点(A和B)的气候(罗斯托克,罗斯托克,德国罗斯托克大学)中审查了所有参与者,其中两者间隔为3周。在时间点,参与者被允许吸烟自由直到07:00 h(图1⇓).在时间点A(没有烟雾曝光),参与者在07:00至11:00之间没有吸烟。在时间点B(急性烟雾曝光),参与者在07:00至11:00之间熏制了八支香烟。在时间点,参与者在11:00至12:00之间接受支气管镜检查(带支气管肺泡灌洗)。为了排除支气管镜序列将影响BALF中测量的任何参数的可能性,选择了交叉设计。在第一组(八个参与者)中的时间点A跟随时间点B,而该序列在第二组(八名参与者)中颠倒(图1⇓).参与者随机分为两组研究。直接在每种支气管镜手术前,使用体液描绘评估肺功能(Masterscreen; Jaeger,Viasys,Hoechberg,德国)。然后,将静脉套管置于储存和10ml血液中进行实验室分析,并用于定量血液中的DC。然后,在手术前15分钟进行支气管镜检查,吸入(Pari Boy; Pari,Starnberg,德国)4%Lidocaine。流式细胞术数据(K.Barrke)的分析师对参与者的曝光分配蒙蔽了。监督参与者并进行血液收集和支气管镜检查程序的临床调查人员获悉干预。
学习规划。参与者被允许吸烟自由直到第一次点07:00 h,在时间点之间的3周间隔期间。在第一组(n = 8名参与者)中,时间点A(4小时的烟雾暴露4小时)之后(急性烟雾暴露4小时),而该序列在第二组中反转(n = 8 participants). At both time-points, participants underwent body plethysmography, blood collection and bronchoscopy (with bronchoalveolar lavage) between 11:00 and 12:00 h.
支气管肺泡灌洗,流式细胞术和ELISA
采用柔性支气管镜(Olympus, Hamburg, Germany)进行支气管肺泡灌洗。将支气管镜卡入右中叶亚段,共灌注100ml预温无菌生理盐水。液体经轻轻地抽吸取出。如前所述分离BALF细胞并计数17.,18..使用四色流式细胞术分析BALF中的DCS,如前所述17.,18.和表1中详述的抗体面板⇓.使用类似的方法在新鲜收集的EDTA-血液中分析血液DC17.,18..从DC分析中排除死细胞,因为初始门控步骤(排除高度荧光谱系阳性细胞)排除高度自过荧光细胞,例如死细胞17.,18..使用如前所述的直方图量化MDC上的表面分子表达17.,18..通过根据制造商的说明书(Duoset; R&D Systems,Minneapolis,Minneapolis,Minneapolis,Minneapolis,Mn,USA)。
统计分析
数据使用SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)进行分析。大多数参数不是正态分布的。因此,以中位数(范围)计算。采用相关样本的Wilcoxon检验比较A(戒烟)和B(急性烟雾暴露)时间点之间的参数。p<0.05的概率为显著性。
结果
参与者的特征
本研究共有16个当前吸烟者(11名男性和五名女性),基于包含和排除标准。中位数(范围)年龄为27(23-49)YRS,身体质量指数23.5(18.6-29.8)kg·m−2.参与者每天抽13(10-30)支烟−1,吸烟的持续时间为12(4-33)。这导致吸烟历史7(2-35)包。参与者(前支气管扩张剂值)的肺功能参数在表2中给出⇓.两个时间点之间的任何肺功能参数都没有显着差异(表2⇓).16名参与者中的三(19%)有预先核糖剂强迫呼气量,急性呼气量<70%(两次)(两次),但没有报告COPD的迹象或症状。
血液和BALF细胞计数差异
表2中详述了血液和BALF中的总和差异白细胞计数⇑.总白细胞计数或巨噬细胞,淋巴细胞,中性粒细胞和两次时间点之间的嗜纤溶细胞百分比没有显着差异(表2⇑).在血液中,淋巴细胞的总白细胞计数和淋巴细胞和中性粒细胞的百分比在时间点之间没有区别。相比之下,在急性烟雾暴露后外周血单核细胞和嗜酸性粒细胞的百分比显着降低(表2⇑).
直流计数血液和巴尔夫
表3详述了BALF和血液中MDC和PDC的百分比和总数⇓.与无烟雾暴露相比,急性烟雾暴露后BALF中mdc的数量增加,而非pDCs的数量减少(表3)⇓;无花果。 2⇓).应该指出的是,两位参与者在BALF中具有最多的MDC(> 4,000 MDCs·ML BALF−1在急性烟雾暴露后,BALF mDC的数量没有进一步增加(图2)⇓).
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/1130/F2.medium.gif)
总骨髓树突树突细胞(MDC)计数:a)支气管肺泡灌洗液;b)外周血后4小时,急性烟雾暴露4小时。显示各个参与者(n = 16)。水平杆代表中位数。*:P <0.05。
趋化因子在BALF
为了确定在烟雾暴露后导致直流电吸收进入气道的潜在机制,BALF分析了已知参与直流电吸引的趋化因子。在A和B时间点之间,BALF中CCL20(巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-3α)和CXCL10(干扰素-γ-诱导蛋白10)的浓度没有显著差异(表3)⇑).在大多数样本中,BALF中的趋化因子CCL2(单核细胞趋化蛋白-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL5(激活调节、正常t细胞表达和分泌(RANTES))和CXCL12的浓度均低于各自的检测限,因此不能进行评估(数据未显示)。
BALF MDC上的功能相关表面分子
低中位pDCs数(42-100 cells·mL BALF)−1)(表2⇑)在BALF中排除了统计上可靠的流动细胞杂细量化的PDC表面分子,因此不进行。相反,可以在两个时间点的所有参与者中的MDC上分析功能相关表面分子的面板(表4⇓).血液树突细胞抗原(BDCA)1(CD1C)和BDCA-4(Neuropilin-1)的表达显着增加,但在急性烟雾暴露后CD1a和Langerin的表达没有显着变化,如急性烟雾暴露与没有烟雾暴露相比(表4⇓).急性烟雾暴露后BALF mDCs上肺归巢受体CCR5的表达显著降低。巨噬细胞甘露糖受体(MMR;急性烟雾暴露后BALF mDCs的CD206)。共刺激分子CD80和CD86、淋巴结归巢受体CCR7和成熟度标记物CD83的表达在时间点之间没有显著差异(表4)⇓).
讨论
本研究是第一个识别烟草烟雾暴露对人类气道自适应免疫系统的急性作用体内.研究表明,在急性烟草烟雾暴露后的数小时内,mDCs会立即选择性地进入呼吸道,而非pDCs。此外,在急性烟草烟雾暴露后,气道mDCs的功能相关表面分子的表达发生了特定的变化。因此,目前体内研究提供了有关烟草吸入对人肺自适应免疫系统影响的重要新信息。
动物研究表明,MDC的增加19.随着Langerhans的细胞表型23.在慢性烟草烟雾曝光后的气道。慢性卷烟吸烟者的人类研究证实了这些发现13.- - - - - -15..具有朗格汉斯的细胞表型的最高MDC数量在吸烟者的气道中找到了COPD的气道6或犁16..本研究是第一个证明急性烟草烟雾暴露导致立即招募MDC进入人类航空公司体内.这种募集是选择性的,因为在烟草烟雾暴露之后,BALF中没有增加PDC或其他免疫细胞(如淋巴细胞,粒细胞或巨噬细胞)。应该注意的是,其他颗粒(例如过敏原或传染性药剂)不会导致将该直流群的选择性募集到人类气道中17.,18..因此,烟草烟雾似乎是mDC招募的一种独特刺激。
值得注意的是,在接触烟草烟雾4小时后的1小时内,已经可以识别出mDCs进入呼吸道。这一发现与McWilliam的数据一致et al。22.他描述了树突状细胞迅速流入大鼠气道,在抗原激发后2小时达到峰值。树突状细胞的内流先于中性粒细胞的内流,从而挑战了中性粒细胞在抗原暴露后的适应性免疫系统细胞出现在呼吸道之前的经典概念22..因此,McWilliam的研究et al。22.表明,DC招募是气道免疫应答早期阶段的一个组成部分。但是,缺乏证实人类气道此类早期直流招募的研究。通过展示急性烟雾暴露之后立即和选择性地招募MDC进入航空公司,本研究证实了McWilliam的假设et al。22.在人类中第一次。
导致烟草烟雾暴露后招募MDC的机制仍不清楚。应该指出的是,既定的MDC也没有增加吸引趋化因子CCL206在急性烟雾暴露之后,在Balf中。这一发现表明,在急性烟雾暴露后,其他机制可能导致MDC招募到航空公司。然而,应该强调的是,急性烟雾暴露后不变的CCL20浓度不排除这种趋化因子在烟草烟雾诱导的炎症和MDC招生中的任何累容。一方面,由于参与者的潜在的慢性烟雾暴露,Balf CCl20浓度可能已经增加。另一方面,这种趋化因子的BALF浓度可以在急性烟雾暴露后增加几小时或数天。因此,所选择的时间点(直接烟雾暴露后)可能为时尚早观察到这种趋化因子的烟雾诱导的增加。
在先前的研究中,在慢性卷烟吸烟者的气道MDC上表达了表面分子BDCA-1(CD1C)和BDCA-4(Neuropilin-1)的表达强烈增加15..在本研究中,确认了这些表面分子对吸烟者MDC的强烈表达。此外,表明急性烟雾暴露与在气道MDCs上的BDCA-1和BDCA-4表达的进一步增加有关。因此,先前和目前研究的发现是一致的,并指向烟草烟雾对人气道MDC的BDCA表达谱的特定作用。这些发现的功能意义目前未知,需要进一步研究,以便在烟雾相关肺病中定义BDCA-1和BDCA-4的特定作用。
应注意,急性烟草烟雾暴露不会导致成熟标记CD83对气道MDC的表达增加。在以前的一项研究中,将慢性吸烟者与从不吸烟者进行比较,甚至患有慢性吸烟者气道MDC的CD83表达减少的趋势15..这些发现符合最近的报道,显示吸烟者气道中的CD83表达细胞数量减少24.或copd.25..有两种可能的场景可能解释这些观察。一方面,减少气道MDC上的CD83表达可能简单地将未成熟MDC的涌入到气道中。这一点在一项研究中提出探索过敏原挑战对哮喘患者的气道DCS的影响17..另一方面,有人假设,烟草烟雾可能特别减弱DC的成熟26..实际上,香烟烟雾提取物27.,以及慢性阻塞性肺病患者的痰28.已被证明抑制直流成熟在体外.气道MDC数量的增加和外周血MDC号码的平行减少可能支持第一个假设(不成熟DC的流入)。然而,急性烟雾暴露后MDC上的肺归巢受体CCR5的下调与更成熟的MDC表型相容。此外,急性烟雾暴露导致BDCA-4表达的增加,表面分子完全不存在于未成熟的血液MDC上,在气道MDC上15..最后,对MMR的表达增加的趋势不一定指向烟雾暴露后DC的更不成熟的表型,因为MMR和CD83对人BALF MDC的表达无关15..因此,关于烟草烟雾暴露后的气道MDC上的CD83表达是否存在的问题反映了未成熟DC的流入或MDC成熟的部分抑制仍然是开放的。
肺归疗中趋化因子受体CCR5的下调29.在急性烟雾暴露之后,这在之前的一项对慢性吸烟者的研究中也发现了15.,与MDC在渗透后和抗原吸收后的思想中兼容。相反,趋化因子受体CCR7,对于迁移MDC对排水淋巴结至关重要30.- - - - - -32.,没有上调。在以前的研究中,比较慢性吸烟者的慢性吸烟者,在慢性吸烟者中的气道MDC上甚至减少了CCR7的表达15..因此,香烟烟雾似乎抑制了MDC上CCR7的上调,这将在抗原摄取后的正常成熟过程中预期33..在A.在体外他的研究et al。27.使用人机衍生的DCS,香烟烟雾提取物(但单独的尼古丁)抑制了CCR7的成熟相关表达。应该注意的是,香烟烟雾提取物没有改变CCR7对未成熟DC的低水平表达,但抑制了以剂量依赖的方式抑制脂多糖诱导的CCR7的上调27..因此,鉴于CCR7对MDC迁移到纵隔淋巴结的基本作用30.- - - - - -32.,香烟烟雾可以降低成熟MDC的迁移潜力。这可能对诸如COPD等疾病的致病意义6和犁16.,34..
然而,这需要进一步研究,因此应该谨慎讨论。例如,在先前测量不同水平的CCR7表达15.和目前的研究,虽然使用来自相同制造商(R&D Systems,Minneapolis,Mn,USA)的相同抗体克隆(克隆150503),但是具有相同标签(联素体粘蛋白)。研究的唯一区别是使用这种抗体的不同批次。因此,可以推测,两种批次之间抗体的联素键素标记不同。由于在一项研究中的所有患者用相同的抗体分析了所有患者,所以关于CCR7的研究的一般性结论不受这种方法问题的影响。然而,通用CCR7表达水平的差异显示,目前在人类BALF中目前没有CCR7的表达水平。此外,已知CCR7对MDC的表达是强烈的依赖性研究(BALF,肺实质或纵隔淋巴结)的舱室。因此,需要进一步研究CCR7对人类气道中DCS的表达和功能作用,以达到更明确的结论。
本研究有两个主要的局限性。首先,在慢性吸烟者中研究了急性烟草烟雾暴露对气道树突状细胞的影响,但不研究从不吸烟者。因此,这些结果与先前吸烟引起的气道变化相混淆。为了充分了解烟草烟雾对人体气道树突状细胞的影响,有必要测试急性烟雾暴露对烟草烟雾无症状气道气道树突状细胞的影响。然而,非吸烟个体的急性烟雾暴露被认为是不道德的,因此被拒绝。其次,没有研究急性烟雾暴露后气道DCs到纵隔淋巴结的传输。这对于阐明气道mdc数量和表面分子表达变化的功能后果是有意义的。然而,为了研究气道树突状细胞在人体中的传输到纵隔淋巴结,不仅需要在暴露于烟雾前对气道树突状细胞进行标记,还需要在暴露于烟雾后手术获取纵隔淋巴结。这些程序被认为在道德上是不可接受的。
总之,本研究表明,首次,立即和选择性地招募MDC,并在急性烟草烟雾暴露后对MDC上的几种功能相关表面分子的特异性调节体内.这些数据构成了未来研究自适应免疫系统在烟草烟草相关肺病中的作用的基础。
支持声明
本研究得到了德国研究基金会(德国波恩; Grant Lo 1145 / 2-2)的支持。
临床试验
本研究在ClinCOLICLTIALS.GOV注册(试验号码nct00740896.)。
感兴趣的语句
没有宣布。
致谢
我们感谢P. Thamm, J. Brandt, G. Fastnacht和C. Beil(所有系的气体,罗斯托克大学,罗斯托克,德国)卓越的技术援助。
- 已收到2009年6月7日。
- 接受2009年9月1日。
- ©ers Journals Ltd