摘要
磷酸肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)是细胞定向运动的关键介质。在这里,我们试图描述的角色PI3Kγ介导多形核白细胞(PMN)在肺中运输的不同步骤。
在脂多糖(LPS)诱导的肺损伤小鼠模型中,PMN在不同的肺室中迁移PI3Kγgene-deficient (PI3Kγ-/-)和野生型小鼠。骨髓嵌合体的产生是为了描述骨髓嵌合体的作用PI3Kγ在造血的与nonhaematopoietic细胞。一个小分子PI3Kγ测试抑制剂在体外和在活的有机体内。
PMN与肺内皮的粘附和经内皮细胞向肺间质的迁移增强PI3Kγ-/-老鼠。然而,在这些小鼠中,经上皮向肺泡间隙的迁移减少了。当辐照PI3Kγ-/-用野生型小鼠骨髓重建小鼠,可部分恢复向牙槽间隙的迁移活动。一个小分子PI3Kγ抑制剂减少趋化因子诱导的PMN迁移在体外当pmn或上皮细胞被处理时,而内皮细胞则不被处理。抑制剂还减少了lps诱导的PMN迁移在活的有机体内。
我们的结论是PI3Kγ在lps诱导的肺损伤中,经上皮细胞迁移是必需的,而非经内皮细胞迁移。抑制PI3Kγ活动可能有效抑制肺损伤中PMN过度浸润。
招募多形核白细胞(PMNs)到发炎组织是先天免疫反应的基本要求,但当过度和不受控制时,可导致器官损伤。在肺中,过度的PMN浸润可导致急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS),这种情况可伴随肺炎、酸性吸入性、严重创伤或败血症,仅在美国每年就导致约75,000人死亡1。pmn耗竭抑制实验性肺损伤2但在大多数患者中并不可取,因为它会导致宿主防御功能受损。尽管PMN在ALI/ARDS中的致病性已经得到了令人印象深刻的证明,但PMN在肺中运输的分子机制仍然知之甚少3.。这可能解释了为什么到目前为止,除了机械通气和其他支持方法外,还没有调节人体PMN浸润的策略,也没有治疗ALI/ARDS的方法4。ARDS的死亡率仍然很高,为35-40%5。
炎症性白细胞的肺浸润是由循环pmn的激活引起的,导致机械特性的改变和迁移活性的增强6。在某些ARDS模型中,pmn与肺内皮的初始接触需要粘附分子7,但在其他国家则不然8。一旦被激活的pmn粘附在肺毛细血管上,就需要额外的步骤来启动跨内皮细胞迁移到肺间质和跨上皮细胞迁移到肺泡间隙,包括激活趋化因子受体和粘附分子的结构重排9。pmn、内皮细胞和上皮细胞的细胞骨架重组是促进白细胞向肺定向运动的先决条件。
I类磷酸肌醇3激酶家族(PI3KS)是异二聚脂质修饰蛋白的异构体,参与调节多种细胞功能,包括细胞生长、增殖、粘附、运动和存活10。PI3Kγ是IB类PI3K,由p110γ催化亚基和101-kD调节亚基(p101)。PI3Kγ信号在不同受体类型的下游被发现,包括G蛋白偶联趋化因子受体。趋化因子受体的激活导致G蛋白亚基βγ的释放,该亚基βγ与p110适配器蛋白结合,并开始转位PI3Kγ到细胞膜,在那里它介导磷脂酰肌醇(PI) 3,4-二磷酸磷酸化为PI 3,4,5-三磷酸11。PI 3,4,5-三磷酸是细胞定向和定向运动的重要媒介12,从而使PI3Kγ在白细胞依赖性炎症疾病中有希望的靶点13。
的参与PI3Kγ在ALI中有牵连,但研究结果一直不明确。在呼吸机引起的肺损伤模型中,PI3Kγgene-deficient (PI3Kγ-/-)小鼠表现出改善的肺力学和减少透明膜的形成,而肺中趋化细胞因子的释放没有改变14。在同一模型中,其他研究表明,在用非选择性PI3K抑制剂预处理的小鼠中,炎症细胞中核因子(NF)-κB的激活减弱,炎症细胞因子的释放减少15。相比之下,PI3Kγ-/-腹腔给药后小鼠更易发生急性肺损伤大肠杆菌16或气管内应用肺炎球菌毒力因子肺溶解素17。在另一个脓毒症模型中,使用非选择性PI3K抑制剂渥曼素预处理会增加血清促炎细胞因子水平,并增加死亡率18。在不同的ALI模型中,PMN招募和浸润到肺PI3Kγ-/-小鼠被发现毒性减弱19,增加16或类似的17野生型小鼠。重要的是要认识到,在所有这些研究中,肺中PMN运输的单个步骤没有分化。
函数表达式PI3Kγ在内皮细胞中,最近已经证明并建议介导白细胞的选择素依赖性粘附19。是否PI3Kγ肺微血管上内皮细胞或上皮细胞是否参与粘连或转生尚不清楚。
目前的研究旨在阐明的作用PI3KγPMN在肺中运输的不同步骤,即。从外周血中募集并粘附到肺毛细血管,经内皮细胞迁移到肺间质,经上皮细胞迁移到肺泡间隙。我们使用基因缺陷小鼠和选择性小分子抑制剂进行阻断PI3Kγ函数在体外和在活的有机体内。我们创造了骨髓嵌合体来研究PI3Kγ对造血的影响与nonhaematopoietic细胞。我们的结果证明了PI3Kγ这可能有助于解释之前研究中相互矛盾的结果。
材料与方法
老鼠
野生型雄性C57Bl/6小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA)。育种对PI3Kγ基因缺乏的老鼠(PI3Kγ-/-, C57Bl/6背景)由康涅狄格大学(Farmington, CT, USA)的D. Wu提供。培养小鼠,缺失p110亚基PI3Kγ经PCR证实20.。野生型窝友(PI3Kγ+/+)作为对照动物。所有的动物实验都得到了弗吉尼亚大学(Charlottesville, VA, USA)动物护理和使用委员会的批准。小鼠8-12周龄。
血细胞计数差异
增加的血细胞计数的基因缺陷小鼠的目标,改变细胞转运已被描述21并将影响迁移活动的分析。为了揭示不同组小鼠之间可能的差异,在PI3Kγ+/+和PI3Kγ-/-小鼠使用自动分析仪(Hemavet 850 FS;CDC技术,牛津,CT,美国)。
嵌合小鼠的生成
嵌合小鼠是通过骨髓移植产生的PI3Kγ+/+和PI3Kγ-/-前面描述的老鼠22。简单地说,受体小鼠分别接受两次600 rad的致命照射(间隔4小时)。该方案在重建6周时产生90%的供体来源中性粒细胞。从供体小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓,并在受体小鼠体内静脉注射了约500万个细胞。骨髓移植(BMT)在四组小鼠中进行:1)来自PI3Kγ-/-成PI3Kγ+/+(嵌合小鼠表达PI3Kγ仅在非造血细胞上);2)骨髓PI3Kγ+/+成PI3Kγ-/-(嵌合小鼠表达PI3Kγ只适用于造血细胞);3)骨髓PI3Kγ-/-成PI3Kγ-/-;4)骨髓PI3Kγ+/+成PI3Kγ+/+。第3组和第4组的小鼠作为可能的辐射效应的阴性和阳性对照。嵌合小鼠在骨髓移植后6周进行实验。
小分子PI3Kγ抑制剂
我们对小分子进行了评估PI3Kγ抑制剂AS-605240(5-喹草林-6-甲基噻唑烷-2,4-二酮)(Merck Serono,日内瓦,瑞士)23因为它能有效地阻止PMN的迁移在体外和在活的有机体内。AS-605240选择性抑制PI3Kγ酶活性,PI3Kγ-介导的下游信号和趋化性23。用0.5%羧甲基纤维素(CMC)和0.25%吐温20盐水配制原液,并按指定浓度使用。
在体外transendothelial迁移
为了测试抑制中性粒细胞PI3Kγ在调节迁移中是否重要,我们进行了研究在体外对pmn和肺内皮细胞(PECs)进行了转生研究,以便我们可以用AS-605240分别处理细胞类型。PECs取自野生型雄性C57Bl/6小鼠,采用CD31 (Mec 13.3)阳性免疫磁选择(EasySep®Biotin selection Kit;StemCell Technologies,温哥华,BC省,加拿大)。在DMEM中培养PECs (d-缬氨酸而不是l缬氨酸;chemickon, Phillipsburg, NJ, USA), 10%胎牛血清(FBS), 20 mM HEPES, 1%青霉素和链霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 50 μg·mL−1内皮细胞生长补充剂(Sigma公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。通过对血管性血友病因子(Abcam, Cambridge, MA, USA)和CD31染色以及对异硫氰酸荧光素标记乙酰化低密度脂蛋白(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA, USA)的摄取来确认PECs的纯度。磁免疫分离得到>90%纯度的内皮细胞培养。内皮细胞在Transwell系统(直径6.5 mm,孔径3.0 μm;Corning Inc., Corning, NJ, USA)并生长至融合(72小时)。实验前2小时,用含1% FBS的无酚DMEM代替培养基。没有内皮细胞的过滤器作为阴性对照。
来自C57Bl/6或PI3Kγ-/-使用三层Percoll梯度(78、66和54%)从骨髓中分离小鼠,如前所述9。该技术获得的细胞纯度为>90%。分别用AS-605240在15 μM下孵育pmn、内皮细胞或两者孵育30min。这种浓度已被证明可以显著减少单核细胞趋化蛋白-1诱导的小鼠单核细胞迁移23。阴性对照组仅用载体液(CMC 0.5%和Tween 20 0.25%盐水)处理。最后15分钟,用钙黄蛋白AM (5 μM;Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA),清洗两次。将过滤器移至含有400 μL无酚DMEM的外孔,其中含有或不含趋化因子(CXC motif)配体(CXCL)2/3(巨噬细胞炎症蛋白- 2,200 ng·mL−1;PeproTech公司,洛基山,新泽西州,美国)。2.5×105pmn被镀在有或没有内皮细胞的过滤器上。过滤器在37°C下孵育2小时,并在底部孔中测量荧光(激发485 nm;发射波长530 nm)。
在体外人类细胞的跨内皮和跨上皮迁移
如前所述,通过两层Percoll梯度(72%和63%)分离来自健康捐赠者的pmn24。所得细胞群纯度为>95%。人A549肺上皮细胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)在含有10%胎牛血清、1%上皮细胞生长补充剂和1%青霉素/链霉素溶液的RPMI中培养。将100,000个上皮细胞植入倒置Transwell过滤器的胶原蛋白涂层下表面,并在37°C的5%湿CO中粘附2小时2孵化器。去除不粘附的细胞,将过滤器移至含有培养基的孔中,细胞孵育72小时,直到形成融合的单层25。PMNs、A549细胞或两者均用as -605240在15 μM下孵育30 min,迁移活性测定如上文所述。阴性对照组仅用载体液(CMC 0.5%和Tween 20 0.25%盐水)处理。在其他实验中,将人肺微血管内皮细胞(HPMECs) (ScienCell研究实验室,Carlsbad, CA, USA)在Transwell系统中镀在纤维连接蛋白涂层的过滤器上,并按照上述方法评估人pmn的转运。
ALI小鼠模型
在一个特制的圆柱形室(20×9 cm)中,多达四只小鼠暴露在雾化脂多糖(LPS)中,该室与空气喷雾器(MicroAir;欧姆龙医疗保健,弗农山,伊利诺伊州,美国)。有限合伙人的肠炎沙门氏菌(Sigma Co.)溶于0.9%生理盐水(500 μg·mL)−1),小鼠吸入LPS 30分钟。如前所述,这模拟了ALI的几个方面,包括PMN招募到肺的所有室室,增加血管通透性26趋化因子的释放和肺结构的破坏27。对照组小鼠暴露在盐水气溶胶中。
在活的有机体内抑制PI3Kγ
评估PMN迁移在活的有机体内,野生型和PI3Kγ-/-在LPS暴露前1小时腹腔注射AS-605240。抑制剂的使用浓度为50 mg·kg−1如前所述23。对照组小鼠只注射培养液(CMC 0.5%, Tween 20 0.25%盐水)。
PMN在肺中的运输
如前所述,评估PMN在肺不同腔室(肺脉管系统、间质、肺泡腔隙)中的募集情况26。简单地说,LPS暴露24小时后(在支气管肺泡灌洗液(BALF)中LPS诱导的pmn积累的峰值),血管内pmn用a标记注射。注射Alexa 633标记GR-1。5分钟后,对小鼠实施安乐死,用10 mL PBS以25 cmH冲洗肺血管,去除不粘附的pmn2通过自发跳动的右心室取出BALF,切除肺,切碎并在过量未标记抗gr -1的存在下消化,以防止注射的抗体与血管外PMN结合。将消化后的肺通过70 μm细胞过滤器(BD Falcon, Bedford, MA, USA)制备细胞悬浮液。流式细胞术检测BALF和肺细胞总数及pmn百分比。在BALF中,pmn通过其正向/侧向散射的典型外观及其CD45(克隆30-F11)、7/4(克隆7/4)和GR-1(克隆RB6-8C5)的表达来识别。在肺中,GR-1的表达被用来区分血管内(CD45+7/4+GR-1+)和间质(CD45+7/4+GR-1-) pmn,注射抗体无法到达。在所有实验中,均使用同型对照抗体来设置闸门。
BALF的细胞旋
野生型和BALF的细胞旋度PI3Kγ-/-LPS暴露24小时后收获的小鼠使用细胞离心机制备(Thermo shan, Waltham, MA, USA)。细胞纺细胞染色(Diff-Quick染色;IMEB公司,圣马科斯,CA,美国),风干和覆盖。
肺微血管通透性
野生型和肺微血管通透性PI3Kγ-/-小鼠埃文斯蓝染色外渗量测定28。埃文斯蓝(20毫克·公斤)−1;Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)在安乐死前30分钟静脉注射。通过自发搏动的右心室向肺内灌注冷PBS以去除血管内染料。如前所述,切除肺部,提取埃文斯蓝29。埃文斯蓝的吸收测量在620 nm,并校正血红素色素的存在:A620(校正)= A620-(1.426×A740+0.030)30.。在LPS (LPS诱导微血管通透性增加的峰值)或盐水吸入后6小时,测定不同动物组中渗出的埃文斯蓝,并根据标准曲线(每克肺微克埃文斯蓝染料)计算。在另外的实验中,野生型小鼠被预处理AS-605240 (50 mg·kg−1i.p。),测定微血管通透性。
BALF蛋白质
我们测量了野生型小鼠BALF中脂多糖诱导的蛋白质积累,作为上皮通透性的指标。LPS后6小时,根据制造商的说明,用比色法对照标准曲线测定BALF中的蛋白质(双氯二烯酸;Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)。部分小鼠给予AS-605240 (50 mg·kg)预处理−1i.p。).
统计分析
采用JMP统计软件(7.0版;SAS研究所有限公司,卡里,北卡罗来纳州,美国)。两组间的差异由单因素方差分析(ANOVA)评估事后图基测试。数据以均数±表示sdp<0.05为有统计学意义。
结果
血细胞计数
为了揭示潜在的PMN计数变化PI3Kγ-/-使用自动分析仪测定小鼠基线差异血计数。在野生型和野生型之间检测不到PMN计数的差异PI3Kγ-/-老鼠。然而,单核细胞计数升高PI3Kγ-/-老鼠(0.6±0.3×103.μL−1与0.3±0.2×103.μL−1;p < 0.05;表1⇓).
PI3Kγ调节PMN经上皮转运进入肺
我们使用流式细胞术检测野生型和野生型肺不同腔室中的pmnPI3Kγ-/-老鼠。pmn通过正向/侧散射的典型外观及其CD45和7/4的表达来识别(图1a)⇓).在肺中,我们通过GR-1+的额外表达来定义血管内pmn(图1b)⇓).在BALF中,所有pmn都通过CD45、7/4和GR-1(采集后添加的单克隆抗体)的表达来识别(图1c⇓).在基线时(无LPS),肺中的所有pmn都在血管内(图1b)⇓左面板,7/4+和GR-1+,右上方框)。LPS吸入诱导跨内皮细胞迁移至肺间质,GR-1- pmn的发生证实了这一点(图1b)⇓,右边面板,右下方框)。在BALF中,基线时未检测到pmn(图c,左面板)。肺间质和BALF的基线PMN计数在野生型和野生型之间没有差异PI3Kγ-/-老鼠;然而,PI3Kγ-/-小鼠在肺微血管系统中显示出更高的PMN积累(图2a⇓).
吸入LPS后,野生型和野生型肺的所有肺室都有显著的PMN募集PI3Kγ-/-小鼠(图1⇑和2⇑).lps诱导的肺循环中PMN的积累明显增加PI3Kγ-/-LPS后24 h与野生型小鼠比较(2.2±0.6×106与1.1±0.3×106;p < 0.05;图2一个⇑).此外,PMN向间质的迁移显著增加PI3Kγ-/-老鼠(2.4±0.4×106与1.5±0.4×106;p < 0.05;图2 b⇑).尽管肺组织(血管内和间质)中PMN数量较高,但PMN迁移到肺泡间隙(BALF;图2 c⇑)减少到PI3Kγ-/-老鼠(1.1±0.2×106与2.4±0.6×106;P <0.05),提示在活的有机体内,PI3Kγ-/-对肺内的上皮细胞迁移是必需的,但对内皮细胞迁移不是必需的。肺泡腔内PMN计数减少PI3Kγ-/-通过BALF的细胞旋转证实(图2e⇑).
PMN贩卖嵌合小鼠
刻画…的角色PI3Kγ在造血细胞和非造血细胞上,我们通过在野生型和野生型之间转移骨髓来创造嵌合小鼠PI3Kγ-/-老鼠。在接受相同基因型小鼠骨髓的对照组小鼠中,lps诱导的PMN迁移与野生型(阳性对照组)相似PI3Kγ-/-(阴性对照组)小鼠(图3⇓).在小鼠中表达PI3Kγ仅在非造血细胞上,经上皮向BALF的迁移显著减少(0.8±0.2×10)6与2.4±0.5×106;p < 0.05;图3 c⇓).减少到与阴性对照组小鼠(骨髓)相似的水平PI3Kγ-/-成PI3Kγ-/-老鼠;0.8±0.2×106与0.9±0.2×106;不重要的)。与经上皮迁移的缺陷一致,这些小鼠的血管内和间质PMN计数升高(图3a⇓和b).当中性粒细胞的经上皮迁移在血管内和间质室受损时,中性粒细胞可能会“积压”在血管内和间质室PI3Kγ-/-老鼠。当PI3Kγ-/-用野生型小鼠的骨髓重建小鼠,经上皮迁移仅部分恢复(1.6±0.3×106与2.4±0.5×106在小鼠中表达PI3Kγ在所有单元格上;p < 0.05;图3 c⇓).在血管内和间质PMN计数PI3Kγ-/-用野生型小鼠骨髓重建的小鼠与用野生型小鼠骨髓重建的野生型小鼠无明显差异,但显著低于阴性对照组小鼠或对照组小鼠PI3Kγ-/-老鼠。这一发现支持了假设PI3Kγ参与pmn的经上皮迁移。
为- 605240抑制在体外轮回
评价其抑制趋化因子诱导的PMN迁移的效果在体外,我们孵育野生型C57Bl/6或pmnPI3Kγ-/-小分子小鼠PI3Kγ抑制剂AS-605240 (15 μM),并允许它们通过Transwell过滤器迁移。迁徙活动PI3Kγ-/-与野生型pmn相比,pmn显著减少。AS-605240减少了cxcl2 /3刺激野生型的迁移,但没有减少野生型的迁移PI3Kγ-/->60% (p<0.05)与未处理对照组)(图4a⇓),证实了AS-605240对这种PI3K亚型的特异性作用。
接下来,我们试图确定AS-605240对PECs的影响与中性粒细胞。将PECs生长至合流,测量cxcl2 /3诱导的PMN跨内皮迁移。pmn, PECs或两种细胞类型均用PI3Kγ抑制剂指示。
当用AS-605240预处理pmn时,cxcl2 /3刺激的通过内皮层的迁移显著减少(>减少50%;p < 0.05与未经处理的控制;图4 b⇑).当PECs预处理时,未观察到任何影响PI3Kγ抑制剂。当pmn和PECs同时预处理时,迁移类似于仅预处理pmn的井,表明PI3Kγ趋化因子诱导的内皮细胞转运(图4b)需要在pmn中,而不是在内皮细胞中⇑).
我们的在活的有机体内实验暗示了一个明显的作用PI3Kγ用于经上皮迁移。因此,我们假设阻塞PI3KγA549细胞中可减少PMN经上皮迁移在体外。当用AS-605240预处理pmn时,cxcl2 /3诱导的经上皮迁移显著减少,与经内皮迁移相似(减少46%;p < 0.05与未经处理的控制;图4摄氏度⇑).当PI3Kγ在A549细胞中被阻断,PMN的迁移减少了26% (p<0.05与未经处理的控制)。这与我们对内皮细胞阻断的研究结果相反PI3Kγ不影响迁移和支持我们的假设,上皮PI3Kγ参与PMN在肺中的运输。阻塞PI3Kγ在A549细胞和pmn中没有进一步减少迁移,表明PI3Kγpmn限制PI3Kγ在我们的系统中依赖美国的人口贩卖。这符合我们的在活的有机体内结果(图3c⇑).
为了揭示pmn的pi3k依赖性转运的潜在物种差异,我们重复了在体外用hpmec进行轮回试验。与我们在小鼠细胞中的发现类似,HPMEC中抑制PI3K不影响PMN迁移(图4d)⇑),表明这两个物种具有可比性。
AS-605240对在活的有机体内轮回
接下来,我们试图确定AS-605240 (50 mg·kg)的效果−1)对lps诱导的PMN迁移的影响在活的有机体内。野生型和PI3Kγ-/-小鼠在LPS暴露前30分钟注射AS-605240。24 h后,流式细胞术检测肺不同腔室中pmn的积累情况。在野生型小鼠中,AS-605240预处理可显著减少lps诱导的pmn流入BALF(1.6±0.3×106与2.6±0.6×106;p < 0.05;图5⇓).该抑制剂不能减少pmn向肺血管的募集或跨内皮细胞向间质的迁移。此外,该抑制剂对lps诱导的PMN迁移无影响PI3Kγ-/-小鼠,支持其特异性为PI3Kγ。
微血管通透性与BALF蛋白
在伴有PMN浸润的ARDS早期发展中,内皮完整性的干扰和富含蛋白质的液体流入肺组织是关键事件之一。因此我们确定了的作用PI3Kγ在lps诱导的微血管通透性中,通过埃文斯蓝外渗和肺泡间隙蛋白质积累分别作为内皮和上皮通透性的指标进行评估。LPS诱导野生型小鼠微血管通透性显著增加(394±33与151±11μg·g−1肺;p < 0.05)PI3Kγ-/-老鼠(568±153与279±97μg·g−1肺;p < 0.05;图6⇓).虽然基线和脂多糖诱导的微血管通透性倾向于较高PI3Kγ-/-小鼠,差异不显著。AS-605240预处理不能防止野生型或野生型lps诱导的微血管通透性PI3Kγ-/-老鼠。此外,lps诱导的进入肺泡间隙的蛋白外排不受PI3Kγ抑制的影响(图6b⇓).这表明PI3Kγ在我们的模型中对细胞运输有明显的作用。
讨论
本研究旨在描述的作用PI3Kγ在肺中PMN运输的不同步骤中在ALI/ARDS小鼠模型中,PI3Kγ是pmn从肺间质经上皮迁移到肺泡腔隙所必需的,而与肺内皮的粘附和通过肺内皮的迁移不受PI3Kγ。轮回主要依赖于PI3Kγ但在骨髓细胞上PI3Kγ对非造血细胞的影响导致pmn经上皮迁移。的小分子PI3Kγ抑制剂AS-605240减少了PMN的迁移在体外PMN浸润肺体内。
的关键作用PI3Kγ在白细胞迁移到炎症组织导致了一些实验研究,试图确定的影响PI3Kγ在ALI中,这种疾病的主要特征是炎症细胞的浸润。这与抑制PI3Kγ减弱ALI,普里et al。19发现lps诱导的PMN迁移到BAL几乎完全被废除PI3Kγ-/-老鼠19。PI3Kγ-/-肺中的PMNs表现出NF-κB的激活减弱,促炎趋化因子白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达减弱31。在呼吸机诱导的肺损伤模型中也发现了类似的结果,其中用非选择性PI3K抑制剂阻断PI3K可以减少NF-κB的核转运以及肺中白细胞介素-6和巨噬细胞炎症蛋白-2的释放15。在类似的模型中,PI3Kγ-/-通过呼吸力学和透明膜的形成,小鼠表现出较少的肺损伤14。在那项研究中PI3Kγ通路不依赖于趋化趋化因子的释放,但作者观察到肺细胞的凋亡活性增加PI3Kγ-/-小鼠细胞坏死减少。
的角色PI3K介导细胞凋亡的通路已经建立32。然而,细胞凋亡在炎症性疾病病理生理学中的作用仍存在争议。细胞凋亡增加,特别是在淋巴组织中,导致败血症期间发生的免疫抑制和器官衰竭33。相反,与坏死相反,细胞凋亡通常不会产生炎症和组织损伤34。在肺损伤中,细胞坏死而非凋亡与炎症反应相关,并与肺功能呈负相关35。此外,PI3Kγ依赖通路似乎对肺泡上皮的完整性尤为重要36,这与我们的发现一致PI3Kγ在肺中介导上皮性而非内皮性屏障功能。巴南et al。37发现了一种内源性的PI3K抑制途径,该途径是由前二磷酸二烯(PSDP)的产生启动的。在酸诱导的肺损伤中,PSDP被抑制PI3Kγ活动增加。因此,PSDP类似物预处理减少了酸诱导的PMN浸润和肺组织损伤。
然而,有益的影响PI3Kγ对ALI的抑制作用并非不容置疑。研究发现,促进肺上皮修复的不是抑制,而是pi3k依赖通路的激活在体外fas诱导细胞凋亡38或机械损伤39。在大肠杆菌脓毒症,肺PMN积累和微血管通透性明显PI3Kγ-/-与CD47和β表达增加有关3.整合蛋白16。与我们的发现一致,作者通过形态计量学分析观察到肺间质中PMN计数增加,并提出cd47相关β的上调3.-整合素复合物导致pmn在细胞外基质内的粘附增加和pmn在肺间质中的积累。在该研究中未确定经上皮迁移到BALF的情况。在内毒素血症小鼠中,非特异性PI3K抑制导致高凝状态,细胞因子释放增加,最显著的是死亡率增加40。此外,硫辛酸或磷酸葡聚糖的抗炎作用都能刺激PI3K通路,但当PI3K信号被阻断时,它们的抗炎作用就被取消了41这表明PI3K通路是内毒素血症和败血症炎症的生理抑制剂。在一个肺炎链球菌诱发肺部炎症时,细菌清除率明显降低PI3K信号被抑制,很可能是由于呼吸爆发缺陷和活性氧产生不足17。此外,PI3Kγ-/-小鼠不能充分招募单核细胞进入肺,而PMN运输不受影响,证实了细胞特异性作用PI3K其他人观察到的信号42。
多个pi3k依赖通路的激活具有相反的作用,这可能是不同研究中肺损伤明显差异的一个解释14,16,17,40,43。同样重要的是,到目前为止,使用非选择性PI3K抑制剂(如wortmannin或LY294002)阻碍了该药物的验证PI3Kγ通路作为治疗靶点。
已知内皮PI3K信号通路介导细胞迁移、血管通透性和血管生成44,45因此,在各种恶性疾病中被认为是一个有前途的靶点46。然而,内皮细胞受累PI3Kγ在炎症反应中一直存在争议。PI3Kγ在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,tnf诱导的NF-κB上调并非必需的。47。然而,其他人却进行了演示PI3Kγ在肺微血管内皮细胞中,NF-κB与细胞间粘附分子(ICAM)-1启动子结合,是pmn静态粘附所必需的48。趋化因子诱导的白细胞粘附减少PI3Kγ-/-小鼠和在被致命辐射的野生型小鼠体内这些野生型小鼠的骨髓已经从PI3Kγ-/-老鼠49。有趣的是,当PI3Kγ-/-缺失局限于骨髓来源的细胞(50%)与减少80%),强调非白细胞的贡献PI3Kγ。在我们的模型中,PI3Kγ-缺乏导致肺中血管内pmn增加三倍。造成这种差异的原因可能有几个。1)史密斯et al。49测试的作用PI3Kγp -选择素依赖性粘附。在我们的模型中,肺微循环粘连与p选择素无关(未发表的观察)。2)体循环中的细胞运输与肺循环有很大的不同。肺小毛细血管粘连的发生在很大程度上独立于粘连分子和趋化因子。3)史密斯et al。49发现,PI3Kγ在60秒内保持白细胞附着于毛细血管后小静脉是必要的。在肺中,pmn在释放回循环或迁移到肺中之前停留了更长的时间(1-2小时)。26。短期效应在本研究中未被研究。4)重要的是要认识到,肺循环中pmn的积累与这些细胞的迁移活动直接相关。向肺泡间隙迁移的减少会增加上游房室中中性粒细胞的数量,即。间质和血管内空间。
此外,内皮细胞,而不是白细胞PI3KγTNF-α介导的PMN粘附于火化肌小静脉,以及非白细胞PI3Kγ导致脂多糖诱导的pmn迁移到BALF19。e -选择素介导的PNMs与助睾肌小静脉的粘附几乎完全取消PI3Kγ内皮细胞是否缺失19。其他人确认了一个角色PI3Kγ趋化因子诱导的PMN迁移,但未观察到PI3Kγ-依赖粘附和滚动50。在本研究中,肺中PMN运输的区室划分显示,通过肺内皮的粘附和转运不需要PI3Kγ。与这些发现一致的是,我们发现用AS-605240治疗PECs没有影响在体外。当PI3Kγ在pmn中被阻断时,尽管迁移活性降低,但AS-605240对中性粒细胞通过内皮单层迁移的抑制作用与没有单层时相当。这些研究表明,PECs不显著促进pi3k γ介导的PMN迁移。相反,在人肺上皮细胞中阻断PI3Kγ可显著减少PMN的迁移在体外轮回系统(图4c⇑).这支持了我们的假设,即上皮PI3Kγ在肺白细胞转运中具有独特的作用。
此外,PI3Kγ-/-与野生型小鼠相比,小鼠血管内PMN数量显著增加(图1b⇑和2⇑).这种增加的血管内中性粒细胞的可用性可能有助于增加pmn通过内皮屏障的迁移PI3Kγ-/-老鼠。然而,经上皮向肺泡腔隙的迁移显著减少PI3Kγ是缺席。缺陷在PI3Kγ-/-老鼠,当PI3Kγ白细胞功能恢复。连接非白细胞的机制PI3Kγ-信号通路对炎症细胞招募的影响尚不完全清楚,但依赖pi3k的粘附分子激活似乎参与其中。在HUVECs中,细胞因子诱导的ICAM-1和血管细胞粘附分子-1的表达涉及pi3k信号51。然而,其他研究表明PI3K抑制了内皮细胞粘附分子的表达52。ICAM-1在lps诱导的肺损伤中起重要作用7。值得一提的是,肺泡和支气管上皮上的ICAM-1显著促进炎性白细胞向肺的募集53。在我们的研究中观察到,PI3K缺失可能会减少上皮细胞间粘附分子-1的表达,并导致干扰的上皮间迁移。非白细胞pi3k信号在炎症中的其他机制包括热休克蛋白70的激活54以及活性氧化剂的释放48。
综上所述,我们的研究揭示了PI3Kγ脂多糖诱导的PMN在肺中的传输信号。我们的发现指出了PI3Kγ经上皮细胞迁移到肺泡间隙涉及PI3Kγ在非造血细胞上。一个小分子PI3Kγ抑制剂有效地减少了PMN的转运,但没有降低脂多糖诱导的微血管通透性。需要进一步的研究来确定它在ALI中的治疗潜力。
支持声明
这项研究由德国研究基金会(波恩,德国;将RE 1683/3-1授予J. Reutershan)和美国贝塞斯达国立卫生研究院(将HL73361授予K. Ley)。
权益声明书
T. Rückle的利益声明可以在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 收到了2009年5月30日
- 接受2009年9月8日。
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