文摘
本研究的目的是确定和验证新基因/蛋白质的生物学意义参与过敏性呼吸道疾病的发展在小鼠哮喘模型。
基因微阵列被用来识别基因至少增加了1/2在肺的两个不同品系小鼠基因表达与高、低过敏的易感性。mRNA的验证数据是通过免疫印迹和免疫组织化学,其次是功能分析的确定与目标基因在小鼠特定基因表达的影响。
的两种抗氧化酶的表达,谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)及谷胱甘肽年代转移酶ω(GSTO) 1 - 1诱导后增加两品系小鼠过敏性呼吸道疾病和局部肺上皮细胞。老鼠破坏的目标Gpx-2基因显示显著增强气道炎症比较敏感和野生型小鼠的挑战。
我们的数据表明,基因编码抗氧化剂GPX2和GSTO 1 - 1是常见的炎症基因表达的诱导过敏性气道炎症,并独立于过敏的易感性。此外,我们提供的证据来说明一个抗氧化酶的重要性,GPX2,防止allergen-induced疾病。
过敏性哮喘是一种多色的疾病展开各种基因与环境因素的相互作用。尽管识别几种蛋白质和途径参与炎症过程,临床试验关键调解人在抑制透露,和未知的因素可能会参与过敏的级联1。在寻找这些假定的候选人,这是有趣的推测抗氧化防御系统可能参与气道炎症的规定,由于航空公司自然暴露在氧气浓度高于其他组织。最近的研究已经确定了水平的提高氧化应激和抗氧化酶的变化在肺部过敏的个体和过敏动物模型,导致氧化应激增加的假设可能导致哮喘的特征2。
不同的技术可以应用在搜索的新因素。最近的一些研究受益从微阵列基因表达谱分析,以识别基因参与过敏性气道炎症的发展,回顾了以前3。这种方法有显著的优势,超过常规的实验方法。传统方法只允许已知的炎症介质的研究,通常,先前的研究已经暗示可能与过敏性气道疾病。演绎基因表达分析通过微阵列,然而,可能识别介质没有任何已知的与炎症或呼吸道疾病,从而真正的“小说”目标引入过敏性气道领域的研究。识别一般小说因素参与肺部炎症,因此,我们采用核糖核酸微阵列技术。比较天真的和治疗小鼠一方面,和两个鼠标的菌株与已知的遗传易感性不同的诱导过敏性气道疾病4另一方面,使我们能够识别常见的基因参与肺部炎症,独立于遗传易感性疾病的发展。识别基因中有多个基因参与氧化应激的规定,其中抗氧化的酶,谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)、谷胱甘肽年代转移酶ω1 - 1 (GSTO 1 - 1)。这两种酶没有承认之前的一部分allergen-mediated炎症级联。我们的数据表明,GSTO 1:1和GPX2调节过敏性气道炎症。此外,缺乏GPX2导致过敏性气道炎症的增加。操纵这个途径在未来的研究将测试假设氧化应激参与了哮喘的发病机制。
方法
动物
Specific-pathogen-free雌性BALB / c和C57BL / 6小鼠(Harlan-Winkelmann、Borchen、德国)和C57BL / 6小鼠有针对性的中断Gpx-256 - 8周大,起点的实验中,使用了。每组5动物进行分析和三个独立的实验。实验过程都是通过动物保健设施(柏林办公室职业安全,健康和保护技术Safety-LAGeSo,柏林,德国)。
敏化作用和挑战协议
小鼠腹腔内注射敏感的20μg卵白蛋白(OVA)年级六世(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)在2天1和14毫克的氢氧化铝。气道炎症是引起鼻内滴注法卵子年级V (Sigma-Aldrich)(50μg 50μL PBS) 28天(用于微阵列分析)和29(实时定量rt - pcr)。为研究GPX2 -空的动物,老鼠系统敏感i.p。注入卵子和氢氧化铝。没有卵子Nonsensitised老鼠收到氢氧化铝。在天28日,29日和30日,所有老鼠与卵子的挑战,并杀死了32天。微阵列分析,动物牺牲16 h后28天的单鼻内的挑战。rt - pcr、免疫印迹和研究GPX2零动物,动物牺牲48 h后最后的挑战,即。要么48 h后两个挑战28和29天或后48 h挑战28天,29日和30日。
过敏表型的检测
免疫球蛋白
48 h后最后的挑战,血液从尾静脉,和血清免疫球蛋白(Ig)总额的水平E和OVA-specific IgE ELISA测定,如前所述6。
支气管肺泡灌洗
16 h后一个过敏原挑战和多个挑战(48 h后28天28和29天,29日和30日;见以前的部分)、肺灌洗,cytospin幻灯片准备,沾Diff-Quik(戴德贝林AG) Liederbach,瑞士)和200个细胞根据形态学特征通过光学显微镜。
RNA的准备
总RNA提取小鼠肺使用试剂盒RNeasy总RNA隔离设备(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。
微阵列分析
cRNAs分别被杂交老鼠基因组MG-U74Av2芯片(Affymetrix、威、英国)。总的来说,八肺进行分析,两种治疗老鼠与两个控件在两个不同品系小鼠(BALB / c和C57BL / 6),分别。基因芯片进行扫描,Affymetrix基因芯片仪器和使用Affymetrix的微阵列扩展套件软件5.0 (MAS5)。我们做了四数组的比较;两个不同品系小鼠之间和治疗与控制(2×2的矩阵)。只有那些基因被发现在所有四个比较类似的监管被归类为差异表达基因。信号对数比转换为标准平均对数刻度和褶皱的变化四个比较计算。我们连续关注这些基因,类似的监管压力的老鼠和多处理和未经处理的小鼠之间的双重变化。更详细的描述微阵列分析是作为补充材料。
实时聚合酶链反应
PCR扩增和分析进行了使用ABI棱镜7700(珀金埃尔默,Rodgau,德国)和SDS软件1.7版本(更详细描述的实时PCR可以找到在线补充材料)。
引物设计和序列
互补DNA PCR引物为放大设计使用Primer3输入软件(怀特黑德生物医学研究所,剑桥,妈,美国)的DNA和RNA序列从基因库,美国。的引物序列和归档列表作为补充材料。
蛋白质制备、sds - page及免疫印迹
1 g的小鼠肺组织(snap-frozen;储存在-80°C)在消化缓冲单一化。整除的肺匀浆进行分析通过使用anti-GPX2或anti-αsds - page及免疫印迹- - - - - -GSTO抗体(详细描述中提供的在线补充材料)8,9。
免疫组织化学
本地化GPX2和GSTO 1 - 1蛋白的检测通过使用4μm石蜡部分肺组织免疫组织化学。抗原检索是由加热组织部分6分钟预热Dako目标检索解决方案(Dako,汉堡,德国),使用压力锅。检测GSTO 1:1,兔抗血清稀释10000倍9和检测的执行GPX2兔多克隆anti-GPX2抗体8。使用生物素化的二次anti-rabbit抗体的稀释1:10,000 (Amersham淀粉微球的生物技术,弗莱堡,德国)。信号放大和可视化anti-GSTO 1 - 1和anti-GPX2酪胺放大系统(CSA设备;Dako)使用。作为peroxidase-reaction色原3 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dako)使用。
统计分析
数据有关的过敏表型进行分析统计Mann-Whitney紫外线测试。微阵列分析完成MAS5使用非参数统计检验(魏克森讯号等级测试)。
结果
过敏表型分析
系统性的敏化作用与过敏原卵BALB / c小鼠会导致显著增加总和OVA-specific IgE与动物相比,只收到了PBS(总IgE 1639 ng·毫升−1与924 ng·毫升−1;OVA-specific IgE 423光单位(陆)·毫升−1与< 6.2卢·毫升−1)。气道的炎症反应显示一个特定的和时间模式为不同的细胞类型的支气管肺泡灌洗(BAL)流体(见在线补充表1)。16 h后单气道过敏原的挑战主要是中性粒细胞,但几乎没有嗜酸性粒细胞,被检测到。在这个时间点,气道代(AHR)测量通过WBP6还没有开发(数据没有显示)。在稍后的时间点(48小时),球包含一个健壮的嗜曙红细胞和淋巴细胞浸润,相应的发展在活的有机体内AHR。
调节炎症基因的识别敏感和挑战动物的肺组织
RNA隔绝整个肺组织被用来生成Affymetrix-based基因表达谱。肺组织在16 h后获得一个过敏原气道挑战来分析基因在气道炎症的早期时间点来识别基因参与的发展这个模型的辅助2型的表型特征。基因表达之间相比BALB / c小鼠和C57BL / 6小鼠,因为他们知道气道炎症的发展,AHR的差异4。虽然两菌株发展重要的气道炎症,和系统性的敏化作用参数如有浓度过敏原特异性IgE气道高反应性更明显在BALB / c株。我们假定这两个菌株的比较会加强我们的目标(“气道炎症基因识别签名”)相当与一个方法只利用一个鼠标应变相比,增加的概率识别基因真正相关的过敏性气道炎症的发展。OVA-sensitised和OVA-challenged C57BL / 6小鼠表达的改变370探针集天真控制老鼠相比,而OVA-challenged BALB / c小鼠2128探针组表达水平的改变。在这两组之间,95个探针集不断调节敏感和挑战BALB / c和C57BL / 6小鼠,但只有31探针集编码至少27个不同的基因调节双重两品系小鼠(调节基因的列表后卵子的挑战是网上提供的辅料如表2)。基因个体发生学分析显示,在这些常见的炎症基因,一些参与氧化应激反应。其中两个,GPX2和GSTO 1尚未报道,在呼吸道过敏反应,并由此进一步分析。
Upregulation的GPX2和GSTO 1 - 1在allergen-induced气道炎症是由定量rt - pcr证实
定量rt - pcr是用来证实基因芯片结果。敏感和挑战老鼠(卵子/卵子)显示两-和5倍更高水平的GPX2 GSTO 1:1 mRNA在肺组织与动物气道炎症没有诱导(PBS / PBS)(图。1⇓)。虽然upregulation GPX2(图1⇓)和GSTO 1 - 1(图1 b⇓)被发现在这两个品系小鼠过敏性气道炎症诱导后,在BALB / c小鼠增加甚至更高,由目标之间的相对荧光强度的差异mRNAβ-actin mRNA,看家基因。
谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)及谷胱甘肽年代转移酶ω1 - 1 (GSTO 1 - 1)在小鼠肺mRNA水平。)的mRNA水平GPX2基因和b)GSTO-1基因测定48 h后最后的挑战从老鼠受到卵白蛋白(OVA)敏化作用和挑战(卵子/卵子)与控制老鼠(PBS / PBS)实时PCR。最初mRNA水平正常化β-actin mRNA水平。比较了通过设置控制老鼠的价值。信使rna表达计算的重要性通过ΔΔCT-method。*:p≤0.05, Mann-Whitney紫外线测试。
GPX2和GSTO 1 - 1蛋白质表达水平上高于小鼠过敏性气道炎症
西方墨点法与特定anti-GPX2 anti-GSTO 1 - 1抗体被用来验证一个upregulation mRNA水平会导致组织蛋白质含量的增加这些酶的小鼠过敏性气道炎症。蛋白质的表达水平升高小鼠的肺组织中发现了挑战与卵子(卵子/卵子)与接受PBS对照组(PBS / PBS)(图2所示⇓)。而这些值达到统计学意义GPX2蛋白质表达水平(图2⇓),比较OVA-challenged老鼠PBS控制显示趋势GSTO 1 - 1高表达水平。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/1148/F2.medium.gif)
谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)及谷胱甘肽年代转移酶ω1 - 1 (GSTO 1 - 1)蛋白水平在小鼠肺。相对数量)GPX2或c) GSTO 1 - 1蛋白质含量与蛋白质含量β-actin利用免疫印迹分析集成密度值(b和d) 48 h后最后的挑战。卵:卵清蛋白。*:p≤0.05, Mann-Whitney紫外线测试。
的表达模式GPX2和GSTO 1在小鼠肺
免疫组织化学GPX2 GSTO 1 - 1显示不同的表达模式,这些蛋白在小鼠支气管上皮细胞(图3所示⇓)。蛋白质的表达模式相似的肺治疗动物和挑战以及敏感动物关于本地化。GPX2表达式,它到目前为止还没有发现在蛋白质水平上的肺,被发现在基底细胞(箭头;图3⇓),揭示兼容模式表达的细胞负责上皮再生。GSTO 1 - 1被发现主要在上皮细胞的顶端部分,有时出现“萌芽”表面的细胞(箭头;图3 b⇓),但分泌蛋白质没有检测到免疫组织学气道腔内。
本地化的谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)及谷胱甘肽年代转移酶ω1 - 1 (GSTO 1 - 1)在小鼠肺。免疫组织化学检测)GPX2和b)在小鼠肺GSTO 1 - 1蛋白表达。GSTO 1 - 1蛋白被发现主要在顶端部分上皮细胞(箭头),而GPX2蛋白质在基底局部上皮细胞(箭头)。蛋白表达了通过免疫组织化学的石蜡削减肺收获后48 h的挑战。BR:支气管。
GPX2防止气道炎症
为了评估我们的发现的生物意义,我们评估的后果GPX2没有上下文中的急性allergen-induced气道炎症利用老鼠GPX2表达的基因缺陷。如图4所示⇓、直接的比较GPX2基因敲除小鼠气道炎症水平明显高于野生型的同胞透露的GPX2基因敲除小鼠,主要是由于显著的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞数量的增加(图4⇓)。OVA-specific IgE和免疫球蛋白1水平也在增加GPX2基因敲除小鼠,但无意义的水平(图4 b⇓和c)。为了评估功能GPX2不足的后果,我们分析了气道阻力在孤立和醋甲胆碱挑衅后灌注肺从野生型和基因敲除小鼠。这里,我们观察到相对折叠气道阻力增加32%基因敲除小鼠与野生型小鼠相比(图4 d⇓)。
谷胱甘肽peroxidase-2 (GPX2)缺乏提高过敏性气道炎症和气道反应性。与野生型相比,同窝出生(□;n = 6),GPX2基因敲除小鼠(
;n = 6)显示增加气道炎症,由于增加了大量嗜酸性粒细胞(伊红)和淋巴细胞(lympho)敏化作用后与抗原和挑战。卵清蛋白(OVA)特殊免疫球蛋白(Ig) E (b)和免疫球蛋白1(c)增加GPX2基因敲除小鼠但不显著水平。d)比较孤立的灌注肺的气道阻力GPX2击倒(▪)和野生型小鼠(□)(n = 6)敏化作用和挑战之后,我们发现更高的相对折叠气道阻力GPX2基因敲除小鼠比相应的野生型控制。Granulo。:granulocytes; macro.: macrophages. *: p<0.05.
讨论
在目前的研究中,我们利用基因表达分析在两个不同品系小鼠肺组织识别小说和常见的炎症基因参与了过敏性呼吸道疾病。我们发现两个抗氧化剂,GSTO 1 - 1和GPX2,还没有承认在这种情况下,显著的调节,在转录和翻译水平。我们的数据支持最近的证据表明,慢性过敏性气道炎症,在某种程度上,由于和由活性氧(ROS)2。此外,增加的炎症和气道反应性水平GPX2零小鼠支持了这样的观点,即GPX2在气道炎症中起着保护作用,类似于其在胃肠道的抗炎作用5。
GPX家庭由四个硒蛋白,GPX1-4,关键酶的氧化还原循环。他们的微分表达式模式和额外的酶能力表明他们发挥重要作用发挥在代谢调节细胞和组织的作用10。GPX1-4都被报道在人体肺部被表达11功能,但对健康和疾病研究揭示他们的贡献这个器官保持稀疏。霍夫曼et al。12最近表明,GPX1,但不是GPX4蛋白质升高(2.8倍)挑战C57BL / 6 j小鼠的肺组织中分析了29天。在我们的分析中,我们无法重现这一增长。然而,诱导GPX1基因表达可能发生的时间晚的过敏性炎症比时间点分析在我们的研究中。
大多数GPX2迄今为止的研究仅限于消化道5,13,14。尽管mRNA GPX2表达式被发现在小鼠肺、本地化这个器官尚未阐明15。在人类中,GPX2蛋白表达尚未检测到肺13肺部和GPX活性主要归因于GPX1活动16。
GPX2由核转录因子调节红细胞2(两个相关因素Nrf2),增加水平hyperoxia-induced肺损伤Nrf2空鼠指向GPX2在防止氧化应激中的作用15,17。本研究这些发现扩展到另一个已知的成分也会生成活性氧簇ROS的肺不良事件以及炎症介质:过敏性气道炎症。这个发现增加的气道炎症没有GPX2强烈支持这种蛋白过敏性气道炎症的保护作用。
考虑到何et al。16表明,95%的谷胱甘肽氧化酵素肺归因于GPX1的活动,有可能的保护作用GPX2这个器官是由不同的酶的活动。事实上,谷胱甘肽氧化酵素抑制前列腺素合成已报告18,从而减少炎性介质表达的已知过敏性哮喘的发病机制中发挥重要作用。此外,GPX2基因敲除研究表明一个参与抗炎机制5。GPX2减少气道炎症的确切机制将是进一步研究的主题为我们初步研究有关古典炎症介质的变化(IL-5白介素(IL) 4日,IL - 10和interferon-γ)在过敏原re-stimulation没有显示显著差异(数据没有显示)。
在我们目前的研究中属于所确定的其他基因谷胱甘肽的表生的家庭年代转移酶,其中我们发现谷胱甘肽的小鼠同系物年代转移酶ω1 - 1 (GSTO 1 - 1)。在人类肺癌、酶GSTO 1 - 1被报道是专门在肺泡巨噬细胞表达19当鼠标同系物已被证明是无所不在地表达,表达水平最高的肺和肝9。
直到现在,这种酶尚未与支气管哮喘的病理。谷胱甘肽的年代转移酶家族最初描述提供重要的解毒一步各种活性氧20.但是许多的六个不同的子类执行额外的反应21。人类GSTO 1 - 1作为glutathione-dependent thioltransferase,这可能会暴露于氧化应激后恢复酶的功能22。人类GSTO 1:1也已被证明能够抑制IL-1β-dependent细胞凋亡通过细胞因子释放抑制性药物23执行的管理操作,提出一种新型的酶。鼠标同系物的GSTO 1 - 1的表达,p28,最初发现在一个防辐射的淋巴瘤,指向一个可能的抗辐射诱导细胞死亡的作用9。这个角色是由研究表明谷胱甘肽年代转移酶激酶抑制某些压力,如小君氨基端激酶24,进而抑制细胞凋亡,并允许细胞修复25。
将属于GSTO 1 - 1的功能结果集成到我们的小鼠模型,抑制细胞凋亡的upregulation GSTO 1 - 1在细胞可能导致不良反应,在正常情况下,将被删除。一个假设有关活性氧的影响提出了氧化应激反应的三个层次:1)少量的氧化应激诱导的保护性反应通过cytoprotective的感应和抗炎介质;2)一个中间水平的氧化应激引起的诱导细胞因子,趋化因子和粘附分子,导致炎症反应;最后,3)大量的氧化应激导致细胞凋亡和坏死,导致炎症和重塑的感应,感应GSTO 1 - 1可能发挥作用,正如前面了25。
其他发现指向可能GSTO 1 - 1和GPX2过敏性气道疾病源自遗传异质性研究。个人的能力来处理一个氧化剂负担可能部分取决于遗传背景。多态性的谷胱甘肽的不同子类年代转移酶已被证明与哮喘、肺功能和对异型生物质增强的过敏症状21,26,27。最近,添加了功能数据,这表明谷胱甘肽年代转移酶能够修改柴油机排气微粒的辅助效果,从而减弱局部和全身性过敏炎症26。这样一个协会尚未公布GSTO 1 - 1或GPX2同工酶。然而,两个独立的研究能够链接哮喘的发展染色体14抓起,即染色体的位置GPX228,29日。综上所述,我们的数据表明,不同活动水平的GSTO 1 - 1和GPX2由于基因多态性可能影响疾病发展的相对风险,假设应该测试在疾病组关联研究。
总之,我们已经确定了两个常见的炎症基因以前从未被认为是参与allergen-mediated气道疾病的发展。知识的机制在肺部氧化应激可能允许开发新型抗氧化剂干预措施。这些策略将需要测试的假设氧化应激参与了哮喘的发病机理,不仅通过直接损伤细胞,而且是气道炎症的一个基本因素。
支持声明
这项工作是支持由德国国家基因组研究网络(联邦研究(BMBF) 01 gs0120) (e . Hamelmann),美国的克罗恩氏和结肠炎基金会(f。Chu)和美国国立卫生研究院(贝塞斯达,医学博士,美国)R01 CA114569 (f。楚)。
感兴趣的语句
没有宣布。
确认
我们感谢c赛博(夏洛蒂柏林,柏林,德国)为她优秀的技术援助。
脚注
本文可以从在线补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年2月20日。
- 接受2009年10月8日。
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