抽象的
α.1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺乏是一种遗传疾病,表现为早上发病的肺气肿或肝病。虽然大多数α1-AT是由肝脏产生的,它也由支气管上皮细胞产生,还有肺部的其他细胞。在这里,我们研究突变体Z α的影响1- at (ZAAT)在人支气管上皮细胞系(16HBE14o-)凋亡中的表达及其机制
控制,M变体α1- at (MAAT)或zaat表达的细胞检测凋亡、caspase-3活性、细胞活力、Bad磷酸化、核因子(NF)-κ b活化和诱导表达的促凋亡和抗凋亡基因。
ZAAT在16HBE14 - 细胞中的表达,如MAAT,抑制基础和激动剂诱导的细胞凋亡。与对照细胞相比,ZAAT表达还抑制了Caspase-3活性57%(p = 0.05),比maat更有效抑制剂。虽然ZAAT对不良的活性没有影响,其表达活化的NF-κB依赖性基因表达在上述对照或杂草的细胞。在16HBE14O-细胞中但不是HEK293细胞,ZAAT上游CIAP-1的表达,NF-κB的上游调节剂。在ZAAT中增加了CIAP1表达与Maat支气管活组织检查。
这些数据表明ZAAT可能通过一种新的机制促进人支气管上皮细胞的生存。
在α1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺乏,一种遗传性疾病,父母的等位基因是以常染色体共同主导的方式遗传的。该疾病表现为早期发作的Pancoinar肺气肿或肝病。突变体zα1-AT蛋白(ZAAT)不同于正常的M变体α1-AT (MAAT)由单一氨基酸取代(Glu 342→Lys)1导致ZAAT二级结构的改变,进而导致蛋白质异常折叠和错误折叠的ZAAT在肝细胞内质网(ER)中积累2.这可以防止足够的蛋白质分泌并导致低于正常血浆浓度的α1——。突变的ZAAT蛋白出现在95%的α型>个体中1-AT缺乏3..
我们之前已经表明,HEK293细胞中的ZAAT积累,用作ZAAT肝病的模型,导致ER应激诱导的细胞凋亡4.然而,肝脏并不是α的唯一来源1- 在身体里。α.1-AT也可由巨噬细胞、单核细胞和肠上皮细胞产生5- - - - - -7.我们的研究在肝移植后蛋白酶抑制剂(Pi) ZZ患者的支气管肺泡灌洗液中检测到ZAAT,也表明α1-AT是在肺局部产生的8.支气管上皮细胞可能是这种α的重要来源1——。
α的作用越来越明显1-AT凋亡可以是细胞类型特异性的。ZAAT诱导的ER应力可以在成纤维细胞模型系统中激活半胱天冬酶和凋亡事件4和在活的有机体内在表达ZAAT的大鼠肝细胞中9在美国,MAAT已被证明在其他细胞类型中具有抗凋亡作用10- - - - - -12.Petrach.et al。13结果表明,在凋亡依赖型肺气肿小鼠模型中,通过表达MAAT的腺相关病毒的转导,MAAT能抑制肺泡上皮细胞的凋亡。MAAT介导这种效应的机制是通过直接抑制Caspase-3与其基材的结合14.其他研究报道了猪肺内皮细胞中的MAAT的抗凋亡作用15.尚未研究ZAAT对Caspase-3活化和凋亡的影响。
鉴于α1-AT在支气管上皮细胞中的表达已被报道可抑制凋亡细胞的死亡,其发生的附加机制,特别是在ZAAT表达的情况下,值得进一步研究。例如,ZAAT能促进细胞存活通过下调促细胞凋亡因子的表达?或者,ZAAT的某些抗凋亡因子的表达是什么样的?其他可能的机制包括抗凋亡因子的状态不良和转录因子缺氧诱导因子(HIF)-1α16.HIF-1α可被包括缺氧在内的各种刺激上调和激活17,生长因子和细胞因子导致参与细胞增殖和活力的基因的转录诱导,如。血管内皮生长因子18.
因此,鉴于细胞凋亡在肺气肿的发展中日益重要13,14,19我们研究了ZAAT对人支气管上皮细胞凋亡的影响,并将我们的研究结果与MAAT的作用进行了比较。我们还探索了可能涉及的新机制,特别是Bad、核因子(NF)-κ b的作用以及一种促凋亡和抗凋亡基因的选择,并验证了我们的研究在体外观察在活的有机体内通过使用来自ZAAT缺陷个体的支气管活组织检查。
材料和方法
细胞培养、处理和转染
人支气管上皮细胞(16HBE14o-)(个人礼物:D. Gruenert;加利福尼亚大学,旧金山,CA USA)在Eagle的memo -glutamax和10%胎牛血清(FCS)中生长。细胞(5×105)瞬时转染(Transfast;Promega, Madision, WI, USA)与500ng pZeoSV2(+)空载体(Invitrogen,佩斯利,英国),pMAAT或pZAAT(含有正常MAAT或突变ZAAT的同一载体)20.并且,在一些实验中,200ng prlsv40-contoil荧光素酶表达质粒(promega)。为了GRP78启动子和NF-κB活性测定细胞共转染300 ng的aGRP78启动子质粒(个人礼品;A.S.李;USC/Norris癌症中心,Los Angeles, CA, USA)或NF-κB5启动子连接荧光素酶报告质粒。通过添加适当的空载体DNA来保持每次实验的DNA量不变。在少于或多于5×10的实验中5DNA的数量被适当地放大或缩小。转染效率通过荧光定量法(Victor21420 Multilabel计数器;PerkinElmer, Waltham, MA, USA)使用coelenterazine (Biotium)或使用α qRTPCR检测共转染的prlsv40 -对照的荧光素酶活性1- at和β-actin特异性引物。
TUNEL染色
16HBE14O-细胞(1×105细胞·好−1)在四孔室的载玻片上生长,转染并在血清自由条件下置于总共5天或离开24小时,然后用唐尼霉素处理另外24小时。死亡比色TUNEL系统(PRomega)用于检测凋亡细胞。使用尼康CoolScope II数码显微镜(尼康公司,英国泰晤士河)的染色细胞可视化。
香烟烟雾提取制剂
香烟烟气提取物(CSE)的制备是在已有方法的基础上进行改进的21,22.简单地说,从一支研究级香烟(1毫克尼古丁,10毫克焦油)中产生的烟雾,除去过滤嘴,通过25毫升无血清培养基(SFM)。得到的悬浮液通过2 μm孔过滤器过滤。本无菌溶液(100% CSE)在配制后30分钟内适当稀释使用。
Caspase-3活性测定
用荧光底物z - devd - aminolucifin (Caspase-Glo 3/7 assay;Promega)。在推荐的caspase-glo试剂中裂解细胞,并在0和1 h使用Victor测定3个重复样品的发光(底物更替)2光度计(PerkinElmer)。Caspase活性以Δ发光单位/ μg蛋白计算。采用Bradford法测定蛋白质含量。根据转染效率进一步校正值。
细胞增殖测定
使用Celltiter 96 aq测量细胞增殖ueous一种溶液细胞增殖试验(Promega),采用适合12孔格式的方案。本试验是一种测定活细胞数量的比色法。它是基于细胞将3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)- 2h四唑生物还原成彩色福马赞产物。每孔加入含1 mL SFM的试剂200 μL的aliquot。细胞在37°C孵育,在1和2小时测量波长490 nm的吸光度。
西方免疫印迹
2.5×10的三份井6细胞未处理,用CSE、尼古丁(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA;Sigma Aldrich),或按指示转染。24 h后,用0.1 mg·mL的裂解液(1% igepal CA-640, 0.5%脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS))裂解细胞−1苯甲基磺酰氟,3%抑肽酶和1mm原钒酸钠)。样品(20 μg)用15% sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到硝化纤维素膜上。免疫反应蛋白使用p-Bad Ser136 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)或Erk2 (Santa Cruz Biotechnology)抗体、一种羊根过氧化物酶结合的二抗(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)和SuperSignal West Femto化学荧光底物液(Pierce, Rockford, IL, USA)检测。在x射线胶片上记录图像,并使用G: box Chemi XL凝胶文件分析系统(Syngene, Cambridge, UK)进行密度分析。
HIF-1α活性测定
细胞(8×105细胞·好−1)用pzaat转染,无论是未转化的还是缺氧攻击(1%o2/ 5%股份有限公司2/37°C)放置24小时。裂解液在2ml冰冷PBS/磷酸盐抑制剂缓冲液(125 mM氟化钠、250 mM β-甘油磷酸、250 mM对硝基苯磷酸和25 mM原钒酸钠)中制备。根据制造商的方案,使用TransAM™HIF-1转录因子检测试剂盒(Active Motif, Rixensart, Belgium)测定HIF-1α的活性。
qRTPCR
按照制造商的说明使用TRI试剂(Sigma Aldrich)分离RNA。使用定量逆转录试剂盒(Qiagen, Crawley, UK)将等量的RNA逆转录为cDNA。所得的cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。合成寡核苷酸引物(Eurofins MWG, Ebersberg,德国),并在20 μ l体积内进行定量PCR反应,其中包含2 μ l模板cDNA, 2x SYBR Green master mix (Roche Diagnostics, Mannheim,德国),每个引物10 pmol(表1)⇓).使用LightCycler 480 PCR系统(Roche Diagnostics)进行扩增。基因表达量由相对定量(2−ΔΔCT)通过每个样品产生的荧光的方法被标准化为每种目标基因的β-肌动蛋白产物。
主题招聘
研究对象从爱尔兰都柏林Beaumont医院呼吸内科门诊招募。本研究采用两组患者,其中3例患者为α型Pi ZZ基因型1-AT缺乏(2男1女,平均年龄43.6岁)和3名健康志愿者(2男1女,平均年龄45.3岁)。本研究经博蒙特医院伦理委员会批准,志愿者书面知情同意。α受体的受试者1- 缺乏血清α的诊断确诊1-AT水平<11 μM,等电聚焦显示为ZZ表型。没有志愿者在α1-AT缺乏群有过敏,哮喘或其他呼吸系统疾病的历史。正常受试者是健康的非莫斯文志愿者,没有肺病,过敏或哮喘的历史,没有呼吸系统症状。
支气管活检
对招募的患者进行了支气管内活检。简单地说,受试者接受2.5 mg雾化沙丁胺醇预处理,随后静脉注射芬太尼50 μg和咪达唑仑2-10 mg,直到达到清醒镇静。后咽部喷洒利多卡因,使用柔性纤维支气管镜(Olympus BF型XT20;奥林匹斯,绍森德海上,英国)通过的嘴。加入2毫升等量的2%利多卡因通过支气管镜应用于声带、气管、左右主支气管。然后使用BARD preciserpulmonary coated disposable biopsy镊从右上叶、右中叶和右下叶的第二至第四代支气管隆突下进行支气管内活检。活检标本用4%多聚甲醛固定,并包埋在甲基丙烯酸乙二醇树脂中。
免疫组织化学
切片(2 μm)使用超微切片机(徕卡,Solms,德国)切割,漂浮在氨水(1:500)上,置于0.01%聚l赖氨酸玻片(BDH实验室用品,普尔,英国),室温干燥1小时。切片用0.3%过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶。使用含10% FCS的tris缓冲盐水(TBS)阻断非特异性抗体结合30分钟,然后用cIAP-1抗体(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)孵育过夜。在TBS洗涤后,应用生物素化的通用二抗2 h,然后应用链霉亲和素-生物素辣根过氧化物酶复合物2 h (Vectastain universal Elite kit;英国媒介实验室,彼得伯勒,英国)。用TBS洗涤后,用3,3-二氨基联苯胺显色原(DakoCytomation)检测过氧化物酶。所有切片用Mayer氏苏木精(Sigma Aldrich)进行反染色。所有病例的同型匹配抗体对照均为阴性。玻片编码并在光镜(尼康Coolscope)下检查。图像是用安装在显微镜上的高清数码相机拍摄的。
NF-κB和GRP78启动子 - 荧光素酶测定
细胞(5×105)用Sv2(空载体),pmaat或pzaat和NF-κB共转染5-荧光素酶报告质粒或GRP78启动子连接的荧光素酶报告酶质粒和PRLSV40 24小时。将一些细胞用二甲基亚甲醚(作为载体)处理,unicicamycin(1μg·ml−1,24小时)或白细胞介素(IL)-1β(10 ng·ml−1如图所示,24小时)(R&D Systems Inc.)。通过光度测量来定量相对荧光素酶生产。
统计分析
使用GraphPad Prism 4.0软件包(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)分析数据。结果表示为平均值±se并且通过适当的配对或未配对的T检验比较。当p值<0.05时,差异被认为是显着的。
结果
人支气管上皮16HBE14o细胞表达α1-在
据报道,多种人类上皮细胞表达α1-at,包括Calu-3,A549和H44123- - - - - -25.我们确定16HBE14-人支气管上皮细胞系是否属于此类别。使用QRTPCR我们检测到α1- at mRNA在16HBE14o细胞中的表达(图1a)⇓), α表达上调1-AT基因表达对促炎和内质网应激刺激的响应。
α.1抗胰蛋白酶(α1- at)在16HBE14o细胞中的表达。a) 16HBE14o细胞(1×105)不受刺激或用脂多糖(LPS;10μg·毫升−1)或衣霉素(Tm;1μg·毫升−1)24小时。分离总RNA,表达α1-AT通过qRT-PCR分析,β-actin归一化。b-d) 16HBE14o细胞(5×105)用空载体(SV2),M变量α共转染24小时1-AT (MAAT)或Z α突变体1-AT (ZAAT)表达质粒。b)总RNA分离及α表达1-AT通过qRT-PCR分析,β-actin归一化。c)上清液(▪)和裂解液(烧嘴)检测α1-AT蛋白的ELISA表达。d)随后与prlsv40对照荧光素酶表达载体和aGRP78启动子连接的荧光素酶报告质粒细胞未处理或二甲基亚砜(DMSO;Tm (1 μg·mL .−1)注射24 h。GRP78-启动子活性通过光度法量化,并归一化到转染效率。所有检测均重复进行三次。B-ACT:β肌动蛋白。#:与未经处理的细胞;¶:与SV2;§:与DMSO或SV2。
用MAAT或ZAAT转基因转染16HBE14-细胞导致α的显着增加1-At基因表达(图1B⇑).总α1-AT蛋白由sv2转染细胞产生,28%在裂解液中,72%分泌到上清液中(图1c)⇑),用ELISA法测定。与sv2转染的细胞相比,MAAT的表达导致α总体增加22%1-AT蛋白生产(数据未显示)。在ZAAT-expressing细胞与转染了sv2的细胞中α的含量增加了16%1-AT可检测在裂解物中,而α只有0.25%增加1在上清中检测到-AT,表明ZAAT蛋白在细胞内保留(图1c)⇑).内质网应激激动剂tunicamycin处理16HBE14o细胞后,内质网应激反应基因表达显著增加GRP78.同样,过表达ZAAT而非MAAT的细胞也表现出内质网应激的迹象GRP78启动子活动显着增加(图1D⇑).
与MAAT一样,ZAAT也能抑制16HBE14o细胞的凋亡
然后,我们瞬时转染16hbe14,用空载体,pzeoSv2或Maat或Zaat表达质粒,并通过Tunel(末端脱氧核苷酸转移酶DUTP酸甜酸酯染料酶DUTP缺口蛋白质标记)评估凋亡5天后染色。图2A⇓结果表明,与MAAT一样,ZAAT的表达也能抑制血清饥饿引起的细胞基础凋亡。我们还评估了ZAAT对激动剂诱导的细胞凋亡的影响。转染24h后的细胞不处理或用ER激动剂tunicamycin刺激。图2 b⇓表明ZAAT与MAAT对衣霉素诱导的细胞凋亡具有同样的抑制作用。在这个实验中,我们也使用了qRTPCR来证实细胞是有效转染的。转染MAAT或ZAAT表达质粒的细胞中α含量增加了300倍1-AT mRNA。
突变体Z α的影响1-抗胰蛋白酶(ZAAT)在细胞凋亡中的表达。a-d) 16HBE14o细胞(1×105)分别为a) dnase处理(阳性对照)或b)空载体(SV2), c) M变体α1-AT (MAAT)或d) ZAAT表达质粒,在无血清培养基中保留5天。e-h) 16HBE14o-细胞(1×105用e)空载体(SV2)或f) SV2、g) MAAT或h) ZAAT表达质粒转染24 h后,用1 μg·mL衣霉素处理−1).TUNEL标记法检测凋亡细胞。图像代表了三个独立的实验。
ZAAT抑制人支气管上皮细胞caspase-3活性
caspase -3是参与凋亡反应的关键caspase。一系列促凋亡刺激物,包括内质网应激激动剂thapsigargin,可以激活caspase-326.其他因素,如CSE和尼古丁,可以抑制基础或激动剂诱导的Caspase-3活化27,28.众所周知,Maat抑制Caspase-3活性13,14.我们评估了ZAAT的影响与MAAT对每光单位caspase-3活性的影响即。标准化转染效率。图3一⇓结果表明,与空载体转染细胞相比,MAAT表达显著降低人支气管上皮细胞caspase-3活性29.3±0.02% (p≤0.05)。这一观察结果与Petrache及其同事的发现相似13,14采用大鼠和小鼠肺泡细胞和内皮细胞。ZAAT表达对caspase-3活性的影响更为明显,与对照组相比,caspase-3活性下降了56.7±0.02% (p≤0.05)。MAAT和ZAAT对caspase-3的抑制作用也有显著差异(p≤0.05),说明在这些细胞中,ZAAT对caspase-3的抑制作用强于MAAT。Thapsigargin(一种内质网应激激动剂)和CSE/尼古丁分别作为阳性(+)和阴性(-)对照。
突变体Z α的影响1-抗胰蛋白酶(ZAAT)对caspase-3活性和细胞活力的影响。a) 16HBE14o细胞(5×105)用空载体(SV2),M变量α共转染24小时1-AT (MAAT)或ZAAT表达质粒和prlsv40 -对照荧光素酶表达载体。未处理细胞或转染SV2的细胞用thapsigargin (TG;0.5 μM)、卷烟烟气提取物(CSE;20%)或尼古丁(Nic;1.5 μM)孵育24 h,测定caspase-3活性。b) 16HBE14o细胞(5×105)用CSE(如24小时表示的CSE(如24小时)保持或刺激,或用空载体(SV2),MAAT或ZAAT表达质粒共转染。通过降低Mts(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺酰基)-2H-四唑)来定量细胞活力。结果以490nm±波长的吸光度单位表示扫描电镜.测定以三份(n = 3)进行。+:阳性控制;- :负面控制。#:与SV2;¶:与真理正义之神;§:与无血清培养基(SFM)。
我们还确定了是否通过ZAAT抑制caspase-3活性和凋亡导致细胞增殖增加。与CSE剂量依赖性地增加16HBE14o-细胞的增殖不同,ZAAT和MAAT对增殖没有任何影响(图3b)⇑).
ZAAT不具有抗凋亡作用通过Bad的磷酸化或HIF-1α的激活
坏是一种促凋亡因子。不良磷酸化导致其失活并抑制细胞凋亡。此前,我们证明,用Tudca治疗HEK293细胞导致磷酸化和失活导致细胞存活增加。发生这种情况的机制涉及磷酸阳性-3激酶(PI3K)的激活4.尼古丁还可诱导肺泡细胞中Bad的磷酸化和失活,提高细胞整体存活率29.我们研究了ZAAT是否调节支气管上皮细胞中Bad的失活。以TUDCA、CSE、尼古丁为阳性对照4,29,30.与未处理的细胞相比导致Bad的磷酸化。(图4)⇓)和MAAT(数据未显示)对Bad的磷酸化均无影响。
烟抽提物(CSE)、烟碱(Nic)、牛磺脱氧胆酸(TUDCA)和突变体Z α的影响1-抗胰蛋白酶(ZAAT)对Bad. 16HBE14o-细胞磷酸化的影响(2.5×106)或20% CSE、1.5 μM尼古丁或300 μM TUDCA处理(24 h),或用ZAAT表达载体横切48 h。制备蛋白提取物,并用western blot分析等量的磷酸化- bad蛋白和总蛋白。直方图显示了pBad/负载控制比率的密度分析。结果是有代表性的三个独立的实验。#:与控制;¶:不重要的。
我们还确定转录因子HIF-1α是由ZAAT激活的作为可能的抗凋亡机制。与缺氧处理的细胞相比,ZAAT的表达对HIF-1α活性没有影响(数据未显示)。这些数据表明,ZAAT不利用PI3K /坏或HIF-1α信号传导来抑制人支气管上皮细胞中的凋亡。
在16HBE14o细胞中,ZAAT上调cIAP1基因表达在活的有机体内在支气管上皮细胞
使用QRTPCR,我们接下来评估了ZAAT对抗凋亡基因的表达的影响。促凋亡Bcl2的表达不受ZAAT表达(未示出的数据)的影响。与空载体转染的细胞相比,ZAAT诱导细胞凋亡的表达增加4倍,CIAP1(图5A⇓).MAAT的表达导致了不到2倍的增长。抗凋亡因子Bax、cIAP2、XIAP表达无变化。
突变体Z α的影响1-抗胰蛋白酶(ZAAT)对支气管上皮细胞和HEK293细胞抗凋亡基因表达的影响。a)用空载体SV2转染16HBE14o-细胞;□),M变型α1-AT (MAAT)(烧断)或ZAAT(▒)表达质粒48 h。分离总RNA,采用qRT-PCR分析Bax、cIAP1、cIAP2和XIAP的表达,并与β-actin进行归一化。检测进行了两次重复。b) 16HBE14o-(代码)或HEK293(▪)细胞未转染或用空载体(SV2)或ZAAT表达质粒转染48小时。分离总RNA,用qRT-PCR分析cIAP1的表达,并对β-actin进行归一化。检测重复进行三次。B-ACT:β肌动蛋白。#:与SV2;¶:不重要的。c-e)来自MM (n = 3)或ZZ (n = 3)纯合子个体的支气管活检通过免疫组织化学分析cIAP1表达。c) MM无抗体,d) MM+cIAP1抗体,e) ZZ+cIAP1抗体。展示了具有代表性的图像。比例尺= 50 μm。
为了调和我们观察到的ZAAT对16HBE14o-和HEK293细胞凋亡影响的差异4即。在16HBE14 - 细胞中抗凋亡和在HEK293细胞中的促凋亡,我们研究了响应于ZAAT表达的两种细胞系中CIAP1的表达(图5B⇑).有趣的是,ZAAT的表达未能诱导HEK293细胞中的CIAP1表达,为两种细胞系响应于ZAAT表达而显示出不同凋亡响应的可能解释。
我们还评估了在体外观察被复制在活的有机体内通过使用从MM和ZZ纯合体中取出的支气管活组织检查,并为CIAP1进行免疫组化。图5C.⇑显示支气管上皮细胞在MM活检染色中只有微弱的cIAP1。相比之下,cIAP1的表达可以清楚地检测到,并且在ZZ活检中很大程度上被划分为支气管上皮细胞。
zaat表达激活NF-κB
CIAP1是细胞保护转录因子NF-κB的上游稳压因子。表明,在16HBE14-细胞中,ZAAT过表达可以诱导CIAP1表达,我们研究了它是否也可能导致NF-κB活性的伴随增加。图6.⇓表明ZAAT能有效激活NF-κB。MAAT的表达也激活了NF-κB,但作用不那么明显,这与MAAT对cIAP1的低诱导程度一致(图5a)⇑).IL-1β作为阳性对照。
突变体Z α的影响1-抗胰蛋白酶(ZAAT)对NF -κB活化的影响。16 hbe14o -细胞(5×105)用空载体(SV2),M变量α共转染24小时1-AT (MAAT)或ZAAT表达质粒,pRLSV40(用于转染效率)和NF-κB5启动子连接的荧光素酶报告酶质粒并用白细胞介素(IL)-1(10ng·ml刺激或刺激−1,6 h)。通过发光测定量定量NF-κB活性并标准化以转染效率。测定以三重份数至少三次进行。#:与SV2。
讨论
α.1-AT主要是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。α的其他性质1-AT包括抑制肺泡巨噬细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α和基质金属蛋白酶的能力,以响应凝血酶和CSE31,以削弱脂多糖诱导的单核细胞活化并阻止细胞凋亡10- - - - - -12.关于细胞凋亡,α1-AT已被证明在凋亡依赖性肺气肿模型中具有直接的促生存效应13.我们研究了ZAAT的促生存特性,它是α的一个错误折叠变体1-AT与遗传性肺气肿相关。
我们的数据显示,如Maat,Zaat,可以抑制人支气管上皮细胞中的Caspase-3活性。有趣的是,甚至考虑到瞬态转染导致的潜在差异,ZAAT表达对Caspase-3活性的影响比Maat更明显。据报道,通过加热至60℃诱导2小时的误折叠的Maat的聚合物形式不能通过肺内皮细胞内化,因此,不能阻断Caspase-3,也不能直接抑制Caspase-3在体外13.尽管我们的异位表达研究与Petrache及其同事的蛋白转导方法存在差异13,14我们的数据表明AAT能够抑制Caspase-3活动的能力,本身与Glu342Lys Z突变导致的异常折叠无关。
α.1-AT是由支气管上皮细胞和其他细胞在肺部局部产生的5,8,23- - - - - -25.在非-α1-AT缺陷个体,α1-AT从循环中扩散到肺部是α更丰富的α1- 在支气管肺泡灌洗液中。虽然已经表明α1-AT可以将细胞内化直接抑制Caspase-313在ZAAT缺乏的个体中,尽管抑制caspase-3的潜力仍然很明显,但上皮表面的ZAAT水平可能不足以有效地执行这一事件,聚合的ZAAT不太可能被气道上皮细胞内化。相反,由支气管上皮细胞本身产生的ZAAT可能具有独联体-产生细胞存活的作用效应在活的有机体内.我们评估cIAP1表达的免疫组化研究支持这一观点。因此,尽管ZAAT缺乏与广泛的肺泡上皮细胞凋亡有关,但ZAAT缺乏肺中的支气管细胞可能由于其表达ZAAT而免于凋亡死亡。
细胞暴露于ER应激导致蛋白蛋白凋亡患者抑制剂的转录诱导通过活化pkr样ER激酶(PERK)32.反过来,PERK活性被证明通过诱导细胞凋亡抑制剂(cIAP1和cIAP2)蛋白抑制内质网应激诱导的细胞凋亡33.IAP家族增强细胞对不同刺激的存活率34.PERK中cIAP1的过度表达- / -内质网应激期间的小鼠胚胎成纤维细胞被证明可以延缓内质网应激诱导的caspase活化和凋亡的早期发生33.以前认为iap可以直接抑制caspases;然而,只有XIAP与caspases表现出强烈的结合35,36.而是至少有两个潜在的机制,IAP通过其达到抗凋亡作用。一种是抑制TNF受体类型I信令37,38.然而,我们表明CIAP1的表达与NF-κB活化相关联。先前已显示CIAP1激活非规范NF-κB途径通过NF-κB诱导激酶(NIK)泛素化和蛋白体降解的机制39.本小组描述了cIAPs如何作为泛素E3连接酶促进NIK泛素化和降解以及NF-κB的激活。
我们在研究中观察到的一个有趣现象是,在caspase激活或抑制方面,ZAAT的细胞类型特异性特性。在HEK293细胞中,ZAAT的表达强烈地诱导caspase-3的激活,从而导致内质网应激下的细胞凋亡4.我们发现使用16HBE14o-支气管上皮细胞这种反应不明显。其他研究也观察到,在异位表达或α内化后,MAAT具有类似的抗caspase活性1-在13,14.这种二分法的原因并不完全清楚;然而,我们已经证明cIAP1的表达可能有重要的作用,并假设这可能是由于不同类型的细胞响应内质网应激的能力。在内质网应激反应过程中,细胞被迫发生凋亡,并可能发生不同类型细胞调控细胞存活的能力通过激活细胞保护因子NF-κB,会对结果产生很大影响。我们在16HBE14o-细胞中观察到的cIAP1和NF-κ b被ZAAT激活支持了这一理论。有趣的是,我们也检测到在zaat表达细胞中cIAP1的表达增加在活的有机体内.
我们调查了ZAAT是否可能施加其抗凋亡效应通过坏或hif-1α;但是,没有证据证明这一点。我们还研究了ZAAT可能施加独特的抗凋亡效应的其他潜在机制。我们发现没有Bax,CIAP2或XIAP的参与,也没有看到ZAAT的促细胞凋亡因子表达的任何下调,例如BCL2。我们的数据确实揭示了CIAP1和NF-κB激活的角色。
α增强治疗1-AT是目前治疗α的肺表现1-AT缺乏。这种方法不仅可能纠正蛋白酶/抗滴油性不平衡并抑制气道表面上的炎症反应,而且还可能通过灭活Caspase-3来抑制与肺气肿的发展相关的细胞凋亡。我们还观察到对CIAP1的上调,以应对MAAT的表达,尽管ZAAT诱导的强度较小。这表明增强治疗的潜在抗凋亡效应部分可以部分地介导通过CIAP1。
总的来说,我们的结果已经确定了ZAAT诱导的支气管上皮细胞存活的独特机制,涉及CIAP1的上调和NF-κB的激活。
支持声明
这项研究由爱尔兰健康研究委员会(都柏林,爱尔兰)和Alpha One基金会(迈阿密,佛罗里达,美国)资助。
感兴趣的语句
T.P.卡罗尔的利益声明可在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 收到了2008年12月19日。
- 接受2009年9月29日。
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