文摘
脂肪氧合酶、cyclo-oxygenase和细胞色素P450 (CYP)产品的花生四烯酸(AA)在肺vasoregulation牵连。的CYP-mediated epoxyeicosatrienoates(缺钱)前面描述的主要类花生酸在人体肺部刺激与Ca2 +离子载体A23187。在这项研究中,我们人类肺灌注挑战两个微生物制剂:大肠杆菌溶血素(决定)和formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)。
两个刺激引起明显代白细胞三烯(LTs) hydroxyeicosatetraenoic酸(het),前列腺素类(PTs)和特点/ dihydroxyeicosatrienoic酸(DHETs),根据液相色谱-光谱法评估,由肺动脉收缩血管的平行反应和肺部水肿的形成。的最大特点/ DHETs缓冲浓度超过LTs + het和分四(决定)或三倍(AA / fMLP)。双重5-lipoxygenase / cyclo-oxygenase抑制引起明显减少AA / fMLP-induced LT / PT合成和水肿形成,但只有有限的衰减的肺血管收缩,而抑制CYP epoxygenase明显减毒AA / fMLP-induced邂逅了DHET合成和血管收缩而不是水肿的形成,表明LTs / PTs血管渗漏的主要贡献和特点/ DHETs加压反应。
因此,一代的特点/ DHETs大于LTs + het和分体外包括人类肺部在微生物挑战暗示这些介质的重大贡献inflammatory-infectious肺损伤。
肺血管是富含脂质中介花生四烯酸(AA)的生物合成通过AA级联的酶途径:脂氧合酶(LOX),细胞色素P450 (CYP),可溶性(医师)和cyclo-oxygenase环氧化物水解酶(COX)1- - - - - -12。不同的类花生酸包含LOX-mediated白细胞三烯(LTs)和lipoxins (lx)的CYP-mediated epoxyeicosatrienoic酸(epoxyeicosatrienoates;缺钱),sEH-mediated dihydroxyeicosatrienoic酸(DHETs)的COX-mediated前列腺素类(PTs)(前列腺素(后卫)和血栓素(tx))和顺反共轭hydroxyeicosatetraenoic酸(het)由液态氧,CYP或考克斯(概述图1)。他们显示广泛的生物功能,从促炎和vasoconstrictive抗炎和血管扩张性属性1,4,5,11。
的主要途径arachindonic酸(AA)级联。液态氧:脂肪氧合酶;LT:白细胞三烯(LTB4LTC,4有限公司4和LTE4);HETE: hydroxyeicosatetraenoic酸(15-HETE、11-HETE 8-HETE, 12-HETE, 9-HETE和5-HETE);LX: lipoxin (LXA4和LXB4);CYPω:细胞色素P450ω-oxygenase;ω-ox-LTB4:ω-oxygenase-mediated LTB4代谢物(20-HO-LTB4,20-COOH-LTB4);CYP:细胞色素P450;特点:epoxyeicosatrienoic酸(12-EET 14 15-EET 11日8 9-EET, 6-EET);医师:可溶性环氧化物水解酶;15-DHET DHET: dihydroxyeicosatrienoic酸(14日,11日,12-DHET, 8日9-DHET, 5, 6-DHET, 6-DHETδ-lactone);考克斯:cyclo-oxygenase;PT:前列腺素类(前列腺素(PGI2,6-keto-PGF1α,铂族元素2,PGD2和PGF2α)和血栓素(酸2和TXB2))。
LTs是涉及多种血管异常的条件下发生肺部炎症,如前置和post-capillary血管收缩和血管渗漏(cysteinyl-LTs)以及白细胞趋化和激活(LTB4),而het另外可能影响白细胞动力学和肺液内稳态5,6,13。研究多形核中性粒细胞(中性粒细胞)在体外在buffer-perfused兔肺,已知港口大量的中性粒细胞,单核细胞和淋巴细胞即使在广泛的冲洗14,15,展示了高收益率的LT和HETE形成同步应用程序免费AA和炎症性配体,如formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)或细菌毒素大肠杆菌溶血素(决定)8,16,17。这丰富的中介代是实质性的结果AA解放的网站炎症事件和LT合成leukocyte-endothelial合作,包括1)LT中间LTA转移的不稳定4从中性粒细胞馈线细胞受体内皮细胞(ECs)后续就业后者的酶设备转换成LTs,和2)发布的免费AA ECs的吸收和处理相邻的中性粒细胞的前兆3,16- - - - - -21。
无处不在的还差了6 HETE regioisomers显示不同的生物活性,包括抗炎(15-HETE)促炎(5-HETE)属性,并包括趋化性(5-HETE, 11-HETE和12-HETE)和监管的酶通路AA级联1,5,13,22,23。
的生理属性well-investigated分达到从vasoconstrictive(酸2,PGF2α)vasodilatative (PGI2,PGD2和铂族元素2)函数1,5。氨甲环酸2和PGI2代表一个经典的例子,在敌对的两介质:肺灌注和通风vasocontriction以及由此产生的不匹配引起的酸2由环前列腺素中和(PGI吗2)。同样的,酸的胶粘剂和aggregatory行动2由antiadhesive中和和antiaggregatory PGI吗2。
AA-derived中脂质介质,CYP-mediated特点及其代谢物的sEH-mediated DHETs,据说与矛盾vasoregulative功能,特别感兴趣。他们被描述为血管舒张药和血管收缩的作用,通过metabolisation考克斯或诱导考克斯的表达,因此,增强前列腺素类的生产11,24- - - - - -26。与系统性心血管隔间,邂逅了/ DHETs提出并讨论了十多年前的化学相关vasodilatative endothelium-derived hyperpolarising因素(EDHF)27- - - - - -30.的角色,这些CYP / sEH-mediated内分泌物肺循环研究甚少。有趣的是,第一个报告描述血管收缩剂和血管舒张11,24如前所述,由我们组10炎症的挑战人类肺nonphysiological Ca2 +离子载体A23187诱发一系列广泛的类花生酸的增强版本,与CYP-mediated邂逅了到目前为止的主要介质,平行的肺动脉压力增加(δP巴勒斯坦权力机构)和肺体重增加(δW)。
在目前的研究中,我们扩展这种方法通过询问是否人类肺部病理生理相关微生物的挑战刺激本身,如蛋白质的跨膜造孔外毒素电解珩磨和炎症趋化现象的细菌receptor-operated三肽fMLP,管理存在外生AA的可用性可能会引起一种类似类二十烷酸简介A23187和这种代谢反应是否与血管收缩剂反应和水肿形成的人类肺隔间。灌注研究与孤立进行,人类肺部和通风完好无损,使用技术相结合的多步固相萃取(SPE)缓冲液随后权力平等主义的毛细管液相色谱(CapLC)与双在线光电二极管阵列检测(PDAD)和电喷雾电离(ESI)串联质谱(MS / MS)检测同时评估所有LOX -考克斯,CYP sEH-mediated AA级联的代表31日。全面类二十烷酸与这个CapLC-PDAD-ESI-MS / MS方法分析揭示了几乎所有的释放的主要代表AA级联反应微生物挑战,与绝对优势(三到四倍)CYP / sEH-mediated特点/ DHETs其他脂质介质。这个中介解放概要文件由肺动脉血管收缩剂平行反应,CYP epoxygenase通路可能特别贡献,和δW,这可能主要是由于液态氧和考克斯的活动。
材料和方法
材料
AA, 20-carboxy-LTB4,20-hydroxy-LTB4LTC,4有限公司4,LTE4的调整,16 t-ltb46 t 12 e-ltb4,LTB4,LXA4,LXB45 s 6 r-dihete、5 s、6 s-dihete,和15 - 11 - 8 - 12 - 9 -和5-HETE从Biomol GmbH购买(德国汉堡)。12 - 14、15 - 11日,8、9 - 5,6-EET, 14、15、11、12、8、9 - 5, 6-DHET, 6-DHETδ-lactone由Biomol和开曼化学公司(美国安阿伯市MI)。6-keto-PGF1α,PGD2,铂族元素2,PGF2α,TXB2和stearidonic酸(SDA)开曼群岛。fMLP,丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)、二乙胺(DEA)和三乙胺从σ获得化学GmbH(德国慕尼黑)。5-LOX抑制剂MK886, COX抑制剂双氯芬酸和CYP epoxygenase抑制剂N(-methylsulfonyl-6) - 2-propargyloxyphenyl hexanamide从开曼群岛(MS-PPOH)。EDTA二钠盐二水合物、乙二胺四乙酸四钠盐四水合物(Na4EDTA·4 h2O)和甲酸(FA)从大肠默克公司购买(达姆施塔特,德国)。水净化Milli-Q系统(微孔,埃施博恩,德国)。甲醇是购自Burdick和杰克逊(美国MI马斯基根),乙腈是购自j.t贝克(代芬特尔、荷兰)和异丙醇是获得丙烯酰胺AG(书、瑞士)。Krebs-Henseleit缓冲区(港口)购买Serag Wiessner(指甲,德国)。
制备电解珩磨
美国提供的外毒素是请Bhakdi(医学微生物学研究所和卫生,美因茨大学,美因茨,德国)做好准备(如前所述)32。制备的内毒素含量减少到∼3 ng有限合伙人/μg蛋白质。溶血性滴定度评估直接使用前,表示溶血性单位每毫升(胡);胡·1毫升−1每毫升对应∼100 ng蛋白质。
体外人类和兔肺灌注和实验协议
的技术体外肺灌注和通风已经被我们前面描述的组33,现在已经适应整个人类肺部来自患有支气管癌接受肺切除术。这项研究是大学伦理委员会批准(李比希,Gießen,德国)和知情同意从每个病人手术前了。切除肺血管床的立即和广泛冲洗加工制造。癌区是夹紧;血,冲刷的灌流液最初不循环。流在慢慢增加到400毫升·分钟−1。然后肺被置于temperature-equilibrated房地产商会在37°C,自由悬挂的测力传感器监测肺重量和通风有限公司为5.3%2,21%啊2,73.7% N2(潮汐容量500毫升;12呼吸频率·分钟−1;呼气压力4毫米汞柱)。稳态时间20 - 30分钟后,灌注液灌注是交换和肺部循环脉动的流量为600毫升·分钟−1总量(500毫升)。15分钟后,100年胡锦涛决定(即。胡·毫升subcytolitic剂量的0.2−1;n = 5)或fMLP(20μM最终浓度缓冲)在AA (AA / fMLP, n = 5)或单独(AA / fMPL控制实验中,n = 2) bolus-injected进入肺动脉和时间设置为零。AA(10μM最终浓度)添加到缓冲丸注入fMLP前30年代。Time-matched基线控制实验(n = 2)进行,而无需应用程序决定或(AA /) fMLP。在实验条件下与AA / fMLP挑战的同时抑制5-LOX和考克斯(10μM MK886和30μM双氯芬酸,分别;n = 2)或抑制CYP epoxygenase(10μM MS-PPOH, n = 2),相应的抑制剂添加后立即启动循环灌注。10毫升灌流液样本收集类二十烷酸分析静脉流出物的前15分钟(-15分钟),立即(0分)之前,2、3、5、10、15、20、30和45分钟后AA / fMLP或电解珩磨的挑战。类二十烷酸浓度结果修正进步中介集中效应产生的灌流液总量的逐渐减少由于切除10毫升样品,通过考虑每个类二十烷酸的总量测量在每个时间点,包含在最初的灌流液总量500毫升。此外,类二十烷酸释放水平和体重增加纠正了原来肺重量的差异通过肺肺作为参考之一类二十烷酸浓度和δ的正常化W对于其他肺部。
体内的影响提供邂逅了加压反应和水肿形成使用孤立的研究,包括人类和通风(n = 2)和兔(n = 5)肺采用上述的试验装置。兔肺灌注如前所述33,流量150毫升·分钟−1总量(250毫升)和通风与人类的肺一样的气体混合物。人类和兔肺,在最初的下半场稳态期间,11日12-EET(0.3μM最终浓度)当时bolus-injected进入肺动脉,被设置为0。
SPE女士和CapLC-PDAD-ESI-MS /设备和程序
类花生酸被适应从肺灌流液中提取前一个SPE程序34提取所有代表介质的AA级联。短暂,收集后,所有样本与不断的调整补充1SDA和内部标准和参考物质相对保留指数的计算(RRI),二叔丁基对甲酚作为一种抗氧化剂,Na4EDTA·4 h2O FA和异丙醇,漩涡,离心机并受SPE使用以(ODS)墨盒(Chromabond C18ec, 200毫克吸附剂质量;Macherey-Nagel Duren,德国)。提取的类花生酸受到CapLC-PDAD-ESI-MS / MS分析,如前所述31日,采用1100系列毛细管LC单元(安捷伦科技德国GmbH, Waldbronn,德国)界面上的《时尚先生》3000 +离子阱质谱仪(力量Daltonik GmbH,不来梅,德国)。分离的内分泌物进行毛细管列(长度×内部直径250 mm×300μm;GROM-SIL 80 ODS-7 pH值)Grom德国+高效液相色谱GmbH (Rottenburg-Hailfingen、德国)雇佣作为流动相的混合水/乙腈/甲醇/ FA(130/240/80/0.22, /卷/卷/卷卷;pH值4.30,调整与DEA)流量2.7μL·敏−1。筛选了化合物受到双重在线光谱光度测量的和MS / MS分析在负离子模式下。身份和纯度的筛选了二十烷类再三确认记事本上草草写就:色谱的权力平等主义的RRI以及双重紫外线光谱和MS / MS分析。
统计数据
分析数据,最大δP巴勒斯坦权力机构(δPpa,马克斯)和最大δW(δW马克斯)表示为±扫描电镜。统计用单向方差分析进行评估。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
结果
脂质中介代的概述
挑战与电解珩磨和组合应用程序的前体脂肪酸(AA)和fMLP导致所有代表AA-derived LOX的解放,CYP,医师和考克斯产品在人类的肺灌注。下面的类二十烷酸组AA级联(图1)进行分析。1)LOX-mediated LTs和lx: LTB4cysteinyl-LTs (LTC4有限公司4,LTE4),ω-oxidation LTB代谢物4(20-HO-LTB4和20-COOH-LTB4)总结ω-ox-LTB4,LXA4和LXB4;15-EET 2) CYP epoxygenase-mediated环氧乙烷14日,11日,12-EET, 8日9-EET, 6-EET;15-DHET 3) sEH-mediated EET-derived vic-diols 14日,11日,12-DHET, 8日9-DHET, 6-DHET;4)COX-mediated分:6-keto-PGF1α作为内皮不稳定(PGI指标2),PGD2,铂族元素2,PGF2α,TXB2作为酸不稳定的指标2;5)LOX -, CYP -考克斯或介导15-HETE 12-HETE, 11-HETE, 9-HETE, 8-HETE 5-HETE。
测量类二十烷酸水平绝对值在每个时间点,反映了特定的释放和再吸收或分解之间的动态平衡每个中介,因此,根据消除过程的速度,他们或多或少地准确地反映实际的解放。根据清除的速率达到最大浓度后,观察两种类型的模式:1)狂热的消除(代/释放显然被再吸收/分解)与水平趋于零LT (B, C, D)4分(5 - 8 - 9 - 12)HETE和2)最小的消除(代/释放和再吸收/分解)之间的平衡导致LTE几乎停滞不前的水平4,ω-ox-LTB4和15-HETE特点/ DHETs。
中介发布基线条件下
在最初的下半场基线时期,即。没有决定或AA / fMLP政府没有基线版本的LTs (无花果2和3分别)和lx(数据未显示),但一些温和的解放15-HETE大于(8-HETE + 12-HETE), 11-HETE, 9-HETE 5-HETE单独检测(无花果2 b和3 b)。几乎没有注册(基线版本的分无花果2摄氏度和3 c)。实质性的基线解放8、9 -(特点+ DHET)和11日12 -(特点+ DHET)指出,只有适度释放5相比,6 -(特点+ DHET)和14,15 -(特点+ DHET) (无花果2 d和3 d)。在time-matched基线控制炎症的挑战,适度解放het,更多实质性的特点/ DHETs但没有LT, PT (图4)和LX(数据未显示)发布是注册。
一)动力学白三烯(LT) E4(•)和LTB4(♦),b) hydroxyeicosatetraenoic酸(het) (▪: 15-HETE;▴:8 - 12-HETE;⋄:9-HETE;•:11-HETE;□:5-HETE), c)前列腺素类(前列腺素(PG) E2(•)PGI2(▴),PGD2(♦)和PGF2α(▪),凝血恶烷(TX)2(○))和d) epoxyeicosatrienoic(缺钱)和dihydroxyeicosatrienoic酸(DHETs)(▴: 11、12 -(特点+ DHET);♦:8、9 -(特点+ DHET);▪:14、15 -(特点+ DHET);•:5、6 -(特点+ DHET))出现在缓冲液体外孤立的,灌注和通风人类肺部刺激大肠杆菌溶血素(决定)。在基线时间的15分钟,100 haemolytical单位决定bolus-injected入肺动脉(时间点0)。10毫升灌流液样本类二十烷酸从静脉污水收集的分析在不同时间点和受到固相萃取毛细管液相色谱与光电二极管阵列和电喷雾电离串联质谱检测。测量类二十烷酸水平绝对浓度在每一个时间点(n = 5;均值±扫描电镜;误差在符号)下降时失踪。PGI2和酸2从测量6-keto-PGF浓度计算1α和TXB2分别浓度。
动力学)白细胞三烯(LTs;♦:ω-oxygenase-mediated LTB4代谢产物;□:LTB4;▴:LTC2;⋄:有限公司4;•:LTE4),b) hydroxyeicosatetraenoic酸(het;▪:15-HETE;•:11-HETE;▴:8 - 12-HETE;⋄:9-HETE;□:5-HETE), c)前列腺素类(前列腺素(PG)我2(•)、铂族元素2(▴),PGD2(♦)和PGF2α(▪),凝血恶烷(TX)2(○))和d) epoxyeicosatrienoic(缺钱)和dihydroxyeicosatrienoic酸(DHETs)(♦: 8、9 -(特点+ DHET);•:11、12 -(特点+ DHET);▴:5、6 -(特点+ DHET);▪:14、15 -(特点+ DHET)发布的孤立的缓冲区,肺灌注和通风人类挑战与花生四烯酸/ formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (AA / fMLP)。下半场基线期后,肺是挑战与AA和fMLP(20μM和10μM最终浓度,分别;时间点0)。10毫升灌流液从静脉污水收集的样本在不同时间点进行固相萃取毛细管液相色谱与光电二极管阵列和电喷雾电离串联质谱检测。测量类二十烷酸水平绝对浓度在每一个时间点(n = 5;均值±扫描电镜;误差在符号)下降时失踪。PGI2和酸2从测量6-keto-PGF浓度计算1α和TXB2分别浓度。
比较a和b)的代谢(类二十烷酸生成)和c)病理生理学(血管收缩和水肿形成)反应包括人类肺在不同条件下:挑战大肠杆菌溶血素(决定;n = 5;□),花生四烯酸/ formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (AA / fMLP;n = 5;░),AA / fMLP在存在的脂氧合酶(LOX)抑制剂MK886和环氧合酶(COX)抑制剂双氯芬酸(n = 2;
),AA / fMLP选择性细胞色素P450 epoxygenase抑制剂的存在N(-methylsulfonyl-6) - 2-proargyloxyphenyl hexanamide (MS-PPOH;n = 2;▒),独自fMLP (n = 2;▪)和time-matched基线控制(n = 2;
)。)四个主要的生成脂质中介类AA级联,白细胞三烯(LTs) hydroxyeicosatetraenoic酸(het)、前列腺素类(PTs)和epoxyeicosatrienoic(缺钱)和dihydroxyeicosatrienoic酸(DHETs)提出的资金的最大灌流液浓度(σc马克斯属于各自的类花生酸类的)。报道在酒吧代表的值相对数量的每个类花生酸类(LTs het,分,缺钱和DHETs) %σc马克斯与类花生酸的总量相比在相同的实验条件下生成(挑战与电解珩磨,AA / fMLP MS-PPOH + AA / fMLP fMLP孤独,或time-matched基线控制,分别)。百分比的总和在相同的实验条件下达到100%。b)减少AA / fMLP-induced LTB的综合4cysteinyl-LTs 5-HETE,凝血恶烷(TX)2加上PGF2α,PGI2加上PGD2,铂族元素2造成双重抑制液态氧和考克斯MK886和双氯芬酸,分别。c)炎性肺血管收缩剂反应和内皮通透性增加/水肿形成表示为最大肺动脉压力上升(δPpa,马克斯)和最大体重增加(δW马克斯),分别。数据意味着±扫描电镜;酒吧内误差下降时失踪。*:p < 0.05与挑战与AA / fMLP。
LT和LX释放决定挑战
政府的决定引发了LTB的快速释放4,10分钟后达到顶峰,增强解放与随后的LTE的停滞不前的状态4。最大的灌流液的LTE4超过了LTB44倍(图2一个)。没有LTC4有限公司4,LXA4或LXB4被检测到。几乎没有(< 1%)水解衰变产物(6 t-ltb46 t 12 e-ltb45 s 6 r-dihete或5 s, LT中间LTA 6 s-dihete)的不稳定4被检测到。
HETE解放之后决定挑战
温和的基线版本后,决定自诱导峰值8 -动力学和12-HETE平行15-HETE增强解放和随后的停滞不前的状态,c马克斯(6.76 ng·毫升−1和6.95 ng·毫升−1分别)远高于5 - 9 -和11-HETE显示动力学与8 -和12-HETE (图2 b)。
PT形成了政府的决定
政府的决定引起了所有人的解放分可比动力学、0.5∼-2.5 ng·毫升的浓度−15分钟后,(图2 c)。
特点/ DHET代由电解珩磨引发的挑战
决定了所有的释放特点/ DHETs等级次序的11日12 -(特点+ DHET) > 8, 9 -(特点+ DHET) > 14, 15 -(特点+ DHET) > 5, 6 -(特点+ DHET) (图2 d)。(11、12)-特点+ DHET 8、9 -(特点+ DHET)显示迅速增加解放概要文件达到更高c马克斯(57.90 ng·毫升−1和37.50 ng·毫升−1分别比14),15 -(特点+ DHET), 5、6 -(特点+ DHET)和所有其他类花生酸类。定量的和支配regioisomers 8、9 -(特点+ DHET)和11日12 -(特点+ DHET)超越的和小regioisomers 5, 6 -(特点+ DHET)和14,15 -(特点+ DHET)是由三个因素造成的。缺钱的总量/ DHETs超过LTs的总和,het和分4倍(表1,图4)。
类二十烷酸释放在挑战fMLP孤单
仅在实验与fMLP,适度解放het更实质性的外观特点/ DHETs,但是没有LT, PT (图4)或LX(数据未显示)发布是注册。
LT和LX解放之后coapplication AA和fMLP
AA / fMLP激起了LTB的迅速出现4,ω-ox-LTB4(20-HO-LTB4和20-COOH-LTB4)和cysteinyl-LTs LT (C, D, E)4在灌流液(图3)。相比之下,几乎没有非酶的LTA (< 1%)4水解产品被检测到。LTC的LTs4和有限公司4显示高峰值(10.82 ng·毫升−1和9.92 ng·毫升−1分别;表1),其次是快速下降,伴随的逐步增加和随后的代谢物LTE的停滞不前的状态4。此外,快速的LTB达到顶峰4指出(LTC最大值大约三分之一的人吗4),随后ω-oxidation产品停滞不前的状况。总额(测量的总和c马克斯LTs值)是一个数量级以上,引起电解珩磨的应用程序(表1)。没有LXA4或LXB4被检测到。
HETE释放引起AA / fMLP管理的
基线版本后,AA / fMLP激起het增强版本。灌流液浓度最高的是指出8-HETE 12-HETE,峰值后3分钟(c马克斯17.07 ng·毫升−1),随后的快速下降。5 - 9,11-HETE显示动力学与8 - 12-HETE,然而,峰值较低的值(图3 b)。相比之下,增强解放15-HETE导致显著增加高原水平达到最大浓度为14.06 ng·毫升−1。het总量的三倍ECH-challenged肺(表1)。
PT一代又AA / fMLP挑战
在接触AA / fMLP分显示生成配置文件类似ECH-challenged肺:快速峰值出现持续下降PGI紧随其后2(长期6-keto-PGF1α),PGD2,铂族元素2,PGF2α和酸2(长期TXB2)注册(图3 c)。PGI的高峰值表示2和铂族元素2(4.11 ng·毫升−1和3.68 ng·毫升−1分别)。总PT数量决定挑战高出1.8倍。
特点/ AA / fMLP引发的DHET形成挑战
AA / fMLP挑战引发了极大地增强和进步8,9 -(特点+ DHET) (图3 d)中,其中显示到目前为止的最高最大灌流液浓度所有类花生酸分析在我们的研究(c马克斯183.71 ng·毫升−1;表1)。(11、12)-特点+ DHET显示类似的概要文件,达到一半c马克斯8、9 -(特点+ DHET)。此外,AA / fMLP诱导一些小解放14日15 -(特点+ DHET)和5、6 -(特点+ DHET)。定量的和主要regioisomers 8、9 -(特点+ DHET)和11日12 -(特点+ DHET)超越的和小regioisomers 5, 6 -(特点+ DHET)和14,15 -(特点+ DHET)的8.5倍。缺钱的总量/ DHETs超过总额的LTs het和分三倍(表1和图4)。值得注意的是,8、9 -(特点+ DHET) > 11、12 -(特点+ DHET)中发现的优势应对AA / fMLP刺激不同于11日12 -(特点+ DHET) > 8、9 -(特点+ DHET)优势决定挑战的回应。整体的特点/ DHETs post AA / fMLP post-ECH高出2.6倍。
类二十烷酸释放在AA / fMLP挑战以往CYP后,液态氧和考克斯抑制
AA / fMLP挑战人类的肺在前任政府CYP epoxygenase抑制剂MS-PPOH导致急剧衰减的特点/ DHET释放,而其他类二十烷酸组的解放(LTs het,分)没有明显的影响(图4)。
双重抑制5-LOX和考克斯在AA / fMLP-challenged人类肺部MK886和双氯芬酸,分别导致显著降低LT / 5-HETE和PT代(图4 b),而在8 -的出现没有显著变化,9 - 11 - 12,15-HETE和特点/ DHETs注册(数据没有显示)。
肺血管反应引起的电解珩磨,AA / fMLP,邂逅了挑战
啸叫P巴勒斯坦权力机构(9 - 10毫米汞柱)指出,在最初的下半场基线时期,以及time-matched基线控制实验和控制实验fMLP独自(δP巴勒斯坦权力机构< 1毫米汞柱;图4摄氏度)。挑战与AA / fMLP和电解珩磨引发明显的血管加压反应与δPpa,马克斯5.7±0.47毫米汞柱和3.8±0.32毫米汞柱,分别伴有明显水肿形成导致δW马克斯280.1±22.1 g和201.1±21.1 g,分别。在实验中AA / fMLP-challenged人类肺,同时抑制LT和PT合成MK886和双氯芬酸,分别导致显著减少δW马克斯但只有有限的δ衰减Ppa,马克斯相比与AA / fMLP挑战没有抑制剂,同时封锁的特点/ DHET代MS-PPOH不是δ的大幅衰减Ppa,马克斯但不是的δW马克斯。
应用外源性11日12-EET人类(n = 2)和兔肺(n = 5)在大约相同的浓度的内生发布11时,12-EET(0.3μM),引发了δPpa,马克斯-3.1±0.27毫米汞柱和3.4±0.31毫米汞柱与人类和兔肺,分别,但没有水肿的形成:δW< 75 g与人类肺,即。的范围一样time-matched基线控制实验(图4摄氏度)和δW< 1 g兔肺(数据未显示)。
讨论
先前的调查与非人类的肺的不同物种在不同病理生理条件下,包括与A23187挑战,决定和fMLP2,3,5,8,9,18,19,31日,35- - - - - -42透露,个别类花生酸的生成/类二十烷酸组(酸2,PGI2LTs或het),平行的加压反应和内皮通透性增加。有趣的是,挑战人类的肺A23187引发了所有主要的生成液态氧,CYP-mediated类花生酸CYP-mediated主导的特点,平行的肺损伤10。在扩展这些发现,目前的研究表明,接触的人类肺灌注两种不同,自然发生细菌代理,决定和fMLP,诱发1)的生成几乎所有的主要脂质介质AA级联,LOX-mediated LTs, COX-mediated PTs, CYP / sEH-mediated特点/ DHETs het由液态氧,考克斯或CYP平行2)血管收缩和3)水肿的形成。此外,它是指出,AA / CYP / sEH-derived / DHETs片、定量,占主导地位的中介组织,显然大大助长了血管收缩剂的反应,而不是这些代理的血管渗漏引起。然而,液态氧/ COX-derived LTs /分指出作出重大贡献内皮通透性增加,但只有有限的肺血管收缩引起的。
本研究中两种细菌代理启动类二十烷酸的一代通过endo不同的机制,实施不同的要求- /外生免费前体AA可用性,导致微分动力学类二十烷酸生物合成的影响,如类二十烷酸释放的绝对优势在AA / fMLP coapplication在电解珩磨的挑战。1)亲水跨膜造孔电解珩磨本身使被动的大量细胞外钙2 +,从而诱发逐步phospholipase-dependent释放内源性免费前体AA细胞膜脂质池17,39从零开始,数量有限,很容易转换由考克斯,液态氧和CYP同样数量有限的二十烷类。2)与电解珩磨,receptor-operated配体fMLP不是能力本身主要激活内源性AA-releasing磷脂酶。因此其功能启动AA级联基本上是依赖外源性自由前体AA的可用性16,43。整个数量的体内提供免费AA是可用的,之前启动的AA级联fMLP丸注入,在这种情况下,类花生酸的前体迅即和定量的转换,产生最大缓冲浓度高于在电解珩磨的挑战。
这些不同的操作机制和AA可用性也可能解释LTC的明显缺乏4和有限公司4在决定挑战释放模式(图2一个)与丰富的解放的所有cysteinyl-LTs co-application AA / fMLP (图3)。1)在AA / fMLP co-application,由于整个体内的可用性提供前体AA数量从一开始,不仅稳定积累成品(由逐步增加和随后的停滞不前的动力学特征)LTE4,而且短暂的中间体(说明了快速峰值动力学)LTC4和有限公司4在生成相当大,因此检测量(图3)。2)与AA / fMLP,决定挑战,逐步提供内生前体AA通过磷脂酶,因此,时间从膜脂质水解释放。在这些条件下有限的前体可用性、fast-peaking中间体LTC4和有限公司4正在迅速进一步转换以低得多的,而不是检测浓度,最后导致稳定的积累最终产品LTE吗4出席更高,因此可检测浓度(图2一个)。
所有类花生酸类,LTs最明显的优势在AA / fMLP显示与决定挑战10倍,而“仅仅”3,het 1.8和2.6,分别分和特点/ DHETs。这可能解释为额外增加的放大LT代由于体内由多个transcellular合作提供AA LTs典型生物合成机制,包括一个广泛的细胞类型,如以下所述。1)监控LT概要文件兼容的发现即使广泛与缓冲液冲洗,肺部港大,“居民”intracapillary池不同的白细胞,但几乎没有血小板14,15,各种静息肺白细胞数量(血管内、间质和肺泡巨噬细胞44,45;肺肥大细胞46;血管内粒细胞3,18;单核细胞47;和淋巴细胞48)是已知参与LOX-derived脂质介质的生物合成。2)强大力量的人类肺血管的LT释放反应微生物挑战一起缺乏(< 1%)的水解的衰变产物不稳定中间LTA LT4表明transcellular合作LT的形成机制。液态氧是局限于骨髓细胞谱系6,transcellular LT的初始化的合成是在白细胞,英国网球协会4LTA部分迅速转换4LTB水解酶的的趋化作用4。“盈余”英国网球协会4从供体白细胞(中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞,等。)到细胞外空间,贪婪地由其他受体白细胞,如。淋巴细胞49或邻近肺受体ECs和转换为LTs,完全逃避细胞外LTA退化4衰变产物。LTB的快速转换4的积累ω-ox-LTB4(图3)表明,LTB4代主要发生在中性粒细胞,唯一的细胞类型配备大量ω-oxygenase活动5,50。与液态氧,cysteinyl-LT synthesis-mediating谷胱甘肽-年代转移酶导致的LT (C, D, E)4发生在一些骨髓细胞,如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞,以及ECs,但不是在中性粒细胞2,5,6,12。因此,cysteinyl-LTs生成部分细胞内配备液态氧和LTC4合酶,如肥大细胞和巨噬细胞和单核细胞5,12,当然主要是通过transcellular合作合成。这包括一个英国网球协会4从白细胞供者细胞转移到相邻的受体ECs的快速转换LTA紧随其后4对cysteinyl-LTs3,18- - - - - -21。Transcellular LT生物合成的合作不仅包括本公司的转变4从白细胞捐赠者与后续代LTs血管受体细胞,但也从激活释放自由AA ECs其次是吸收和处理这个前体邻白细胞16,17。
vasoregulatory和pro - /抗炎作用的het肺脉管系统在很大程度上是未知的。有趣的是,不断丰富解放经抗炎15-HETE微生物挑战,以前从人类分离肺5,51指出。相比之下,只有小解放促炎5-HETE观察(表1和无花果2 b和3 b)。
常分PGI2(环前列腺素),PGD2和铂族元素2成为主流vasoconstrictive分酸定量2和PGF2α(强烈的血管收缩剂氨甲环酸的水平2低于3.2 - -4.4倍的强有力的血管舒张药PGI吗2)(表1和无花果2摄氏度和3 c),这表明一个相当温和的贡献vasoconstrictive PTs的加压反应人类的肺。虽然血小板被称为酸的主要来源2生物合成,与居民白细胞,池加边血小板的游离肺灌注冲洗,可以忽略不计14。因此,ECs常驻巨噬细胞,单核细胞,淋巴细胞和中性粒细胞,称为extraplatelet氨甲环酸的网站2合成52- - - - - -54,可以作为替代候选人extraplatelet血栓素生成。这可以解释为什么甚至在coapplication AA / fMLP,即。可用性的外生前体AA,酸2绝对定量小中介(表1)。
释放大量的CYP / sEH-mediated特点和DHETs人类肺血管在微生物挑战是有趣的事实,人们几乎不知道关于他们vasoregulatory在肺癌中的作用。LOX-mediated LTs的总量,有趣的是,LOX -考克斯——或者CYP-mediated het, COX-mediated分,这是众所周知的调停者的肺血管收缩,是由三到四倍的特点/ DHETs (图4,表1)。这绝对主导地位的特点和DHETs AA级联的其他脂质介质像先前描述的人类肺接受δP巴勒斯坦权力机构在刺激与A2318710,考虑到一些可用的报告描述的特点和DHETs作为孤立的血管收缩剂,加压兔子肺动脉24和缺氧兔子和老鼠的肺31日,38,55的问题是否高的特点和DHET数量可能影响血管加压反应和/或在微生物在人体肺部水肿形成挑战。
值得注意的是,同时抑制液态氧和考克斯在AA / fMLP-challenged人类肺MK886和双氯芬酸,分别诱导显著降低LT和PT代(图4 b)平行的显著减少体重增加(图4摄氏度),暗示LTs和分水肿形成的重大贡献。值得注意的是,只有有限的衰减的人类肺血管收缩血管的炎性反应的挑战是注册(图4摄氏度),尽管LTB的一代4,5-HETE cysteinyl-LTs vasoconstrictive PTs(酸2和PGF2α)和vasodilatative PTs (PGI2,PGD2和铂族元素223)强烈抑制(12日,15日,21和19%,分别比AA / fMLP-challenge没有液态氧/考克斯抑制;图4 b),暗示可能贡献CYP / sEH-derived特点和DHETs肺血管收缩。
事实上,选择性的应用56CYP epoxygenase抑制剂MS-PPOH fMLP / AA挑战之前,虽然只有在两个实验由于缺乏可用的人类肺灌注实验,导致相当大的减少的特点和DHET代(图4)伴随着一个衰减的加压反应∼50%,但没有水肿的形成(图4摄氏度)。这些结果关联与那些通过外源性应用11日12-EET人类和兔肺的最终浓度c马克斯11日公布的从内部12-EET:诱导δP巴勒斯坦权力机构,但没有明显的δW9-EET 12-EET,虽然11日和8日,属于定量主导regioisomers释放人类肺部微生物挑战;因此,他们是潜在的主要候选人造成水肿的形成。
这些发现与报告一致57,58描述一个regiospecific,内皮permeability-increasing活动的四个特点regioisomers 3 - 10μM的浓度范围,即。到目前为止,超过c马克斯的特点在挑战人类肺部释放AA / fMLP(15 - 0.04μM 14日(特点+ DHET), 0.56μM 8、9 -(特点+ DHET);浓度在μM ng·毫升各自价值观的转换−1在表1),从而提出一个相当微不足道的贡献水肿的形成在这些条件下的特点。
总之,这些数据表明,在人体肺部的特点生成的条件下细菌挑战代理加压反应,但没有引起明显水肿的形成。
总之,刺激完整的人类肺部有两个微生物制剂,电解珩磨和fMLP,引起肺血管收缩和血管渗漏,与解放大量的所有代表介质的AA级联(LTs het,分和特点/ DHETs)灌流液。为了应对这两种刺激,CYP / sEH-mediated特点/ DHETs显然主导的和其他类花生酸类。双重抑制液态氧/考克斯在AA / fMLP-challenged人类肺部造成明显减少LT / PT生物合成和水肿形成,但只有有限的衰减的δP巴勒斯坦权力机构,而选择性CYP epoxygenase抑制诱导显著抑制的特点/ DHET生成和血管收缩剂反应但不衰减的水肿形成,依照外生的特点应用程序,导致肺动脉压力上升,但没有肺体重增加。知名LOX -和旁边COX-mediated肺血管异常,CYP的重大贡献/ sEH-mediated特点/ DHETs肺加压反应可能的发展,因此,预期。
脚注
支持声明
这项工作得到了德意志Forschungsgemeinschaft项目KI 567/1-2”Vaskulare Funktionen Cytochrom P450-abgeleiteter Eicosanoide在der pulmonalen Strombahn”,项目GR 1081/4 1“综合和Metabolismus冯Eicosanoiden biologischen Systemen”,项目KI 567/3-1“死罗尔·冯·Cytochrom P450——abgeleiteten Eicosanoiden在der Pathogenese der pulmonalen Hypertonie des人”,由大学医学中心的科研补助金由Sonderforschungsbereich吉森和马尔堡(UKGM)和547年。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2009年1月2日。
- 接受2010年3月28日。
- ©2010人队