文摘
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一个激进的恶性肿瘤与石棉接触,只有有限的应对常规治疗;因此,早期诊断MPM是非常重要的。我们以前报道,检验(Ang) 1与bleomycin-induced肺纤维化。
在这里,我们调查了Ang-1协会的发展MPM细胞,来源于间充质细胞类似于肺成纤维细胞,并证明Ang-1刺激MPM细胞的生长和迁移在体外。我们还表明,患者MPM的水平明显高于血清Ang-1相比,人口曾暴露于石棉但没有发达MPM。MPM晚期患者显示更高水平的比早期Ang-1 MPM病人和kaplan meier方法揭示血清Ang-1水平和生存之间的显著相关性。
我们建议的可能性Ang-1 MPM肿瘤生长中起着重要的作用,我们的数据表明,血清浓度Ang-1可能是有用的预后因子。
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一个咄咄逼人,恶性肿瘤的间皮的起源与石棉接触有关1- - - - - -3。尽管最近,石棉的使用减少了在西方国家和日本,MPM的发病率明显预计将增加在未来几十年里因为有很长的潜伏期(20 - 40岁)之间的石棉暴露和肿瘤的发展4。MPM显示只有有限的应对传统的化疗和放疗。虽然最近,多目标antifolate培美曲塞已获批准,成为一线代理,与顺铂相结合,治疗MPM,整体存活率仍然很差58 - 18个月的中位生存时间6。在几个中心,潜在的治疗手术结合某种形式的辅助治疗已被执行。这样的早期治疗干预似乎比晚更有益的干预。因此,在早期诊断MPM是非常重要的1。然而,在组织学诊断往往是非常困难的研究。在肺癌的诊断、血清标记,如癌胚抗原、细胞角蛋白片段,progastrin-releasing多肽和鳞状细胞癌抗原,提供支持性角色确认诊断。血清生物标志物MPM, mesothelin和骨桥蛋白等7,8已经被报道,并用于协助MPM的诊断。为进一步提高诊断的特异性和敏感性,研究新型生物标记的发展是迫切需要的。
我们以前报道,检验(Ang) 1与bleomycin-induced在小鼠肺纤维化9。在这份报告中,我们证明了Ang-1 mRNA水平提高bleomycin-treated小鼠肺组织与控制组织。此外,我们发现人类的肺成纤维细胞和myofibroblasts Ang-1产生,这可能是肺纤维化的底层机制。MPM涉及间皮的细胞的恶性转化,来源于间充质细胞类似于肺成纤维细胞。在这里,我们调查的影响Ang-1 MPM的迁移细胞生长和/或细胞在体外患者的血清Ang-1 MPM人口相比,暴露于石棉不发展MPM。
方法
细胞培养
人类MPM细胞系H28(上皮样的),H2052(肉瘤样的),H2452(两相的)和msto - 211 h(两相的),和人类间皮的细胞系MeT-5A得到来自美国文化类型集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。这些细胞被培养在RPMI 1640(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)补充heat-inactivated 10%胎牛血清。
实时定量rt - pcr
总RNA分离使用RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)和使用高容量reverse-transcribed cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。实时定量rt - pcr进行如前所述10- - - - - -12使用TaqMan基因表达产品对人类Tie-2 Ang-1 Ang-2。18年代核糖体RNA作为一个内生控制(应用生物系统公司)。
测量Ang-1
Ang-1浓度和/或Ang-2在细胞培养上清液和血清测定使用酶联免疫试剂盒(研发系统、牛津大学、英国)。意味着Ang-1最小检测量的酶联免疫试剂盒是3.45 pg·毫升−1。
和磷酸化Tie-2总量的测量
细胞培养10分钟有或没有重组人类Ang-1 (100 ng·毫升−1)(研发系统)和胞质提取准备使用核提取工具包(活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国),然后总磷酸化Tie-2检测使用酶联免疫试剂盒(研发系统)。我们测量的总蛋白质含量的胞质提取物(蛋白质量化Kit-Rapid Dojindo、熊本、日本)和全部的值和磷酸化Tie-2纠正总蛋白质含量的比例。
细胞迁移试验
在体外迁移进行了分析使用CytoSelect 24-well细胞迁移试验(8μm,比色格式;细胞生物学实验室,Huissen、荷兰),根据制造商的指示,如前所述12。简而言之,MPM细胞系和MeT-5A细胞密度1×10停牌6细胞·毫升−1在RPMI 1640和放置在一个Boyden室的上半部分。的下半部分Boyden室充满RPMI 1640含100 ng·毫升−1重组人类Ang-1或仅RPMI 1640年。这些细胞被孵化16 h, nonmigratory细胞住在参议院被移除。迁移细胞与细胞染色剂染色的解决方案,使用提取溶液提取,然后用一个盘子读者波长560纳米。
动物
6周大C.B-17 / Icr -scidJcl (scid/scid重度联合免疫缺陷(SCID)雌性老鼠从克丽购买日本(东京、日本)和维护在我们特定的无菌动物设施。所有的动物都根据动物保护指南兵库大学医学院(日本兵库县)。综述了所有协议用于动物安乐死和批准的实验室动物研究所(医学院毕业,兵库县医学院)。
异位(皮下)异种移植模型
产生皮下(南卡罗来纳州。10)肿瘤单细胞悬架7msto - 211 h细胞植入南卡罗来纳州。在SCID小鼠。
免疫组织化学
老鼠牺牲植入后28天。肿瘤在4%多聚甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡切片。部分被使用应用兔anti-mouse Ang-1多克隆抗体(菲茨杰拉德,康科德,妈,美国)其次是抗兔多克隆抗体(Dako Cytomation,斯特鲁普,丹麦)和过氧化物酶活性呈现使用diaminobenzidine工具包(Dako Cytomation)。
病人
我们研究了Ang-1水平在102年的血清诊断病人的呼吸医学部门的兵库县医学院医院(日本兵库县)从2000年到2007年。所有的病人有石棉接触史记录。62人恶性胸膜间皮瘤,用组织病理学诊断的样本由熟练的病理学家MPM的诊断。40个人有良性的石棉相关疾病(石棉肺或胸膜斑)或者是健康尽管他们石棉暴露。所有患者分类分期系统国际间皮瘤利益集团(IMIG)13。11名患者的样本与肺癌恶性胸膜炎和五个健康志愿者也进行了研究。这项研究是通过我们的道德委员会依照1975年赫尔辛基宣言。从所有患者知情同意了。样本立即在液态氮冷冻和储存在-80°C到使用。
统计分析
为在体外研究中,数据均值±sd执行的三个实验一式三份。执行统计分析使用Bonferroni-Dunn多个比较测试。的非参数Mann-Whitney紫外线测试被用来比较两组血清样本。之间的数据比较不同组的血清样本进行非参数的克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是Mann-Whitney紫外线测试。在所有的测试中,p值< 0.05被认为是显著的。为了估计血清Ang-1的价值,接受者操作特征(ROC)曲线,ROC曲线下面积(AUC)及其95%可信区间计算使用标准技术。检查血清的截止值,我们计算总敏感性和特异性为每个截止值,然后选择最大化每个因素的截止值。估计生存概率的计算使用kaplan meier方法使用生存率较和比较。为了评估Ang-1 MPM患者生存率的预后意义,Cox比例风险的回归分析(向后)进行了多元分析。
结果
评价Ang-1, Ang-2 Tie-2表达式
我们评估的mRNA表达Ang-1、Ang-2 Tie-2实时rt - pcr分析。所示表1,Ang-1 mRNA表达H2052和msto - 211 h细胞。然而,H28 H2452 MeT-5A显示没有Ang-1 mRNA的表达。在H2452 Tie-2 mRNA表达,msto - 211 h和MeT-5A细胞。没有MPM Ang-2 MeT-5A细胞表达。蛋白质含量的Ang-1 Ang-2 ELISA的细胞进行分析。H2052和msto - 211 h细胞被证明产生Ang-1 (2384±372.6, 140.9±22.1 pg·毫升−1分别),而H28, H2452 MeT-5A没有Ang-1生产。相比之下,没有人产生Ang-2(数据没有显示)。我们还研究了道达尔和磷酸化Tie-2,发现在msto - 211 h细胞磷酸化Tie-2增加(1.2±0.036倍增加,p = 0.026),而总Tie-2不受添加Ang-1(1.0±0.0028倍增加)。然而,无论是总量还是磷酸化Tie-2被添加在H2452 Ang-1改变(1.0±0.052倍增加,1.0±0.016倍增加,分别)和MeT-5A(1.0±0.0060倍增加,1.1±0.052倍增加;细胞分别为p = 0.060)。Tie-2不是H28和H2052细胞中发现。
Ang-1对MPM和MeT-5A细胞的扩散
澄清的参与Ang-1 MPM肿瘤发展的增长,我们研究了Ang-1对MPM细胞的增殖的影响和人类间皮的细胞系MeT-5A。所示图1,Ang-1 msto - 211 h细胞刺激增长,既表达了Ang-1 Tie-2,和H2452细胞,这表示只有Tie-2剂量依赖性的方式,到达了一个高原100 ng·毫升的浓度−1(1.3±0.045倍(p < 0.0001)和1.1±0.014倍增加(p < 0.0001),分别)。H2052细胞的增殖,这表示Ang-1没有Tie-2表达式,和H28细胞,既不表示,不受添加Ang-1(1.0±0.019倍和1.0±0.020倍增加,分别)。然而,Ang-1没有影响人类间皮的细胞系的增殖MeT-5A,尽管Tie-2表达式(1.0±0.049倍增加,图1)。
效果检验(Ang) 1恶性胸膜间皮瘤的扩散(MPM)和间皮的细胞。msto - 211 h, b) H2452 MPM细胞和c)人类间皮的细胞系MeT-5A 96年培养,平底的文化板块48 h在无血清培养基0,1,10或100 ng·毫升−1Ang-1,细胞增殖是化验方法中所描述的部分。数据意味着±sd三个单独的实验一式三份。执行统计分析使用Bonferroni-Dunn多个比较测试。#:p < 0.0001。¶:p = 0.0003。
Ang-1对MPM细胞的迁移的影响
众所周知,细胞迁移起着重要的作用在肿瘤细胞入侵,特别是MPM肿瘤的扩散。因此,我们进行一个在体外迁移的影响试验研究Ang-1 MPM进展,表明在这两种msto - 211 h,它既表达Ang-1 Tie-2, H2452,只能表达Tie-2,细胞移植诱导(1.4倍增加(p = 0.002)和1.3倍增加(p = 0.002),分别)Ang-1 (图2)。H2052细胞的迁移,这表示Ang-1但不是Tie-2和H28细胞,既不表示,并没有引起的Ang-1(数据没有显示)。Ang-1没有影响的迁移MeT-5A间皮的细胞,尽管表达Tie-2 (图2)。
效果检验(Ang) 1恶性胸膜间皮瘤的迁移(MPM)和间皮的细胞。msto - 211 h, b) H2452 MPM细胞和c)人类间皮的细胞系MeT-5A培养过夜在100 ng·毫升的存在与否−1Ang-1和细胞迁移试验进行中描述的材料和方法。数据意味着±sd三个单独的实验一式三份。执行统计分析使用Bonferroni-Dunn多个比较测试。严重联合免疫缺陷小鼠的肿瘤皮下注射msto - 211 h细胞在4%多聚甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡切片。部分应用使用d)控制或e)兔anti-mouse Ang-1多克隆抗体的方法部分中描述。#:p = 0.002。原来放大×400。
免疫组织化学结果
我们之前报道,只有msto - 211 h细胞生长南卡罗来纳州。10在SCID小鼠单个细胞悬液7H28、H2052 H2452, msto - 211 h细胞> 95%的生存能力是植入SCID小鼠12。检查Ang-1的病理生理作用在活的有机体内从异位异种移植模型,肿瘤组织植入msto - 211 h细胞用于Ang-1染色。可以看到Ang-1染色在肿瘤细胞的细胞质(图2)。
患者的血清水平的Ang-1 MPM,良性的石棉相关疾病(石棉肺或胸膜斑),与石棉接触史的健康个体
我们招募了总共102例石棉接触史。25,62已经确认MPM,胸膜斑和/或石棉肺,和15没有石棉相关病变尽管他们暴露于石棉;即。他们是健康的。他们的特点是所示表2。
ROC曲线对患者血清Ang-1水平表明,MPM的AUC 0.7974 (95% CI 0.7261 - -0.8687)相比,那些有良性的石棉相关疾病(石棉肺或胸膜斑)和那些健康尽管他们接触石棉。截止值为34.5 ng·毫升−1、诊断敏感性为71.0%,特异性为77.5% (图3)。阳性预测值(PPV)为83.0%,阴性预测值为63.3%。水平Ang-1 MPM患者明显高于(44.4±16.1 ng·毫升−1)相比,那些良性石棉相关疾病(石棉肺或胸膜斑)和那些健康的(28.5±10.7 ng·毫升−1;p < 0.0001)。从肺癌患者血清水平的Ang-1恶性胸膜炎(n = 11)较低(31.9±9.1 ng·毫升−1;比MPM患者(p = 0.0088)图3)。此外,血清MPM Ang-1水平的散点图显示倾向于增加随着疾病的进展(I期35.7±4.7 ng·毫升−1阶段II 36.1±11.4 ng·毫升−1,第三阶段40.2±13.7 ng·毫升−1和四期49.3±17.2 ng·毫升−1;非参数p = 0.049的克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是Mann-Whitney紫外线测试;图3)。Ang-1水平之间的差异不同MPM组织学阶段未达到统计上的显著水平(数据没有显示)。Ang-1水平没有明显差异的主题与良性石棉相关疾病(石棉肺或胸膜斑)和健康的人尽管有石棉接触史(数据没有显示)。
患者血清检验(Ang) 1水平在恶性胸膜间皮瘤(MPM)和non-MPM科目。a)敏感性和特异性识别患者的血清Ang-1 MPM non-MPM科目(接受者操作特征曲线)。分析,包括62 MPM患者和40 non-MPM史的受试者石棉暴露给曲线下面积为0.7974 (95% CI 0.7261 - -0.8687)。截止值为34.5 ng·毫升−1诊断敏感性为71.0%,特异性为77.5%。b)血清水平的Ang-1 non-MPM主题,MPM患者和肺癌恶性胸膜炎测量方法部分中描述。c)的血清水平Ang-1 MPM患者疾病分为四个阶段。b)非参数Mann-Whitney紫外线测试或c)非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是Mann-Whitney紫外线测试使用。- - -:每组的平均值。··········:截止值。#:p < 0.0001。¶:p = 0.0088。
Ang-1水平和总体存活率之间的关系
研究血清Ang-1水平之间的关系和病人的临床课程,我们将基于患者血清Ang-1水平时的第一次测量。第一组包括患者血清Ang-1水平< 34.5 ng·毫升−1,我们使用的截止值。在这组13个病人,血清Ang-1的平均值为29.2±4.7 ng·毫升−1。另一组包括剩下的37名患者血清Ang-1水平≥34.5 ng·毫升−1、血清Ang-1的平均值为52.5±14.2 ng·毫升−1。较低的整体存活率的差异之间的组织和血清Ang-1值高于34.5 ng·mL的假定的分界点−1显著(p = 0.029;图4)。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/36/5/1099/F4.medium.gif)
恶性胸膜间皮瘤的生存主题根据血清检验(Ang) 1的水平。估计生存概率的计算使用kaplan meier方法使用生存率较和比较。- - -:34.5 ng·毫升−1;- - - - - -:≥34.5 ng·毫升−1。
Cox回归分析进行的50 MPM的病人来说,年龄数据,性别,组织学,疾病阶段,性能状态,治疗(pemetrexed-based化疗或手术)和血清Ang-1水平。统计学意义,一个独立的预后影响(≥65岁的生存与年龄< 65岁;风险比(人力资源)2.63,95%可信区间1.04 - -6.68;(p = 0.042), pemetrexed-based化疗与没有;人力资源0.38,95%可信区间0.15 - -0.941;p = 0.035)和血清Ang-1级别(≥34.5与< 34.5 ng·毫升−1;人力资源3.43;95%可信区间1.08 - -10.87;p = 0.036)。
讨论
MPM是一个恶性变换引起的间皮的细胞的接触石棉。它有一个有限的常规化疗和放疗反应,及其预后很差。MPM的终生风险与职业和/或环境有关石棉接触史14。由于长时间的潜伏期(通常> 30岁)之间的第一次接触石棉和疾病的发作,MPM的诊断仍然是困难的,与世界各地的发病率增加1,2。
尽管在先进的情况下,切除的肿瘤仅延长生存∼3个月,患者IA阶段13疾病存活≥5年之后总切除肿瘤8。我们筛查门诊病人有石棉接触史,但没有症状多年来为了检测MPM处于早期阶段。由于早期诊断的难度MPM的辐射和/或组织学检查,有效和实用的血清生物标志物MPM的诊断需要援助。到目前为止,已经有几个候选人报告临床MPM的有用指标7,8,15- - - - - -17。事实上,他们中的一些人已报告是有用的MPM的血清标记物,如mesothelin和骨桥蛋白7,8,15;然而,很少有人知道他们的生物功能或对MPM细胞的影响。
Ang-1和2为endothelial-specific抵消配体受体酪氨酸激酶Tie-2,血管生长有重要的调控作用,成熟和功能。Ang-1促进血管生成,诱导血管成熟,降低血管通透性。然而,Ang-2有能力破坏血管,增强血管渗漏,这抵销Ang-118- - - - - -20.。
我们以前报道,Ang-1 bleomycin-induced肺纤维化小鼠9。MPM是间皮的细胞的恶性转化,这来源于间充质细胞类似于肺成纤维细胞;因此,我们调查的影响Ang-1间皮的细胞。
首先,我们展示了在两个生产Ang-1四MPM细胞系,mRNA的表达的受体,Tie-2,两个。人类间皮的细胞系Met-5A,用作控制,Tie-2 mRNA表达,但不是Ang-1。msto - 211 h Ang-1及其受体的细胞信使rna表达。澄清的参与Ang-1 MPM肿瘤发展的增长,我们研究了Ang-1对MPM细胞的增殖的影响,表明添加Ang-1-stimulated MPM细胞生长在msto - 211 h和H2452细胞,表达Tie-2,剂量依赖性的方式。然而,Ang-1没有影响MPM细胞株的增殖H2052 H28,缺乏Tie-2表达式,表明在Ang-1-induced Tie-2扩散功能的重要性。Ang-1也没有影响MeT-5A扩散,表明缺乏功能性表达Tie-2在正常细胞间皮的,尽管它可能成为功能性细胞转化。目前的数据表明MPM的增殖细胞增加通过MPM的Ang-1自分泌和/或旁分泌机制细胞和Ang-1-producing周围细胞,成纤维细胞等9和周19。
细胞迁移起着重要的作用在肿瘤细胞入侵之前,我们证明了MPM细胞迁移的重要作用在肿瘤生长9。因此,我们进行一个在体外迁移的影响试验研究Ang-1 MPM传播和显示msto - 211 h和H2452细胞,细胞迁移被Ang-1诱导。H2052或H28细胞的迁移,缺乏Tie-2表达式,并没有引起Ang-1,暗示Tie-2也在Ang-1-induced迁移的重要性。然而,Ang-1没有影响的迁移MeT-5A间皮的细胞,表明Ang-1对MPM细胞的影响有限。基于这些发现,一种可能的机制是,MPM细胞传播引发的Ang-1 MPM细胞自身产生的和/或Ang-1-producing周围的细胞。
此外,众所周知,恶性肿瘤需要新的血管形成,据报道,增加血管供应MPM与不良预后相关2。Ang-1也是一个重要的血管生长调节器,成熟和功能。Ang-1促进血管生成,诱导血管成熟和降低血管通透性18- - - - - -20.。
虽然精确的细胞机制尚未完全调查,我们建议的可能性Ang-1 MPM肿瘤生长中起着重要的作用通过刺激细胞增殖和迁移。当然,正如Ang-1的主要功能是促进血管生成,我们认为,除了对MPM细胞的增殖和迁移的影响,增加血管生成可能的机制之一Ang-1-induced MPM肿瘤的增长21。
接下来,我们评估的临床作用Ang-1作为MPM的血清生物标志物。在这项研究中,我们发现患者MPM的水平明显高于血清Ang-1相比人口与石棉接触史,或健康志愿者(n = 5;年龄为32.0±8.0岁;三个男人和两个女人)从未暴露于石棉(Ang-1 33.7±4.3 ng·毫升−1)。血清Ang-1水平之间的人口与石棉接触史和健康志愿者从不暴露于石棉未达到统计上的显著水平。尽管Ang-1的诊断敏感性为MPM根据中华民国曲线不高(71.0%)、PPV相当好(83.0%),表明高血清Ang-1可能支持MPM的诊断水平。我们还测量了肺癌患者的血清水平的Ang-1恶性胸膜炎,发现Ang-1水平低于MPM的病人。
此外,疾病进展的水平逐渐增加,虽然只有四期Ang-1 MPM潜在显著更高的值,和kaplan meier方法揭示血清Ang-1水平和生存之间的显著相关性。此外,血清Ang-1水平显示有统计学意义,对生存预后影响的Cox回归分析,这表明它的有效性作为一个标记来估计预后。自MPM的临床阶段与胸腔积液的存在与否,和早期的MPM患者的良性石棉相关疾病是必要的,我们建议测量血清中Ang-1水平似乎是一个简单的和有用的工具为MPM临床管理。
总之,我们证明了Ang-1-stimulated MPM细胞的细胞生长和迁移在体外研究。我们还表明,患者MPM的水平明显高于血清Ang-1相比,人口与石棉接触史,没有开发MPM, MPM晚期患者显示更高水平的Ang-1相比早期MPM患者。我们建议Ang-1新颖有效的血清预后因子。这是第一个报告Ang-1和MPM的关系。
确认
我们感谢h .们(分工呼吸医学,内科医学部门,兵库县医学院兵库县,日本)提供技术援助。
脚注
支持声明
KAKENHI本研究支持的科研补助金(C) (20590936) (C . Tabata)的癌症研究基金兵库县健康促进协会(C . Tabata),促进科学技术和特殊的协调基金(H18-1-3-3-1) (t . Nakano)。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2009年9月29日。
- 接受2010年2月8日。
- ©2010人队