文摘
克雷伯氏菌肺炎是一个院内肺炎的常见原因。骨桥蛋白(OPN)是一种磷酸化糖蛋白参与炎症过程,其中一些是由CD44。本研究的目的是确定中OPN的角色k .肺炎全身的肺炎。
野生型(WT)和OPN淘汰赛(KO)小鼠鼻内感染104集落形成单位k .肺炎,或者管理克雷伯氏菌脂多糖(LPS)。此外,重组OPN (rOPN)给与WT和CD44 KO小鼠。
在克雷伯氏菌肺炎、WT老鼠显示肺和血浆OPN水平升高。OPN KO和WT老鼠类似肺部细菌感染后6 h堆积如山,此后,克雷伯氏菌负载高的肺OPN KO小鼠和这个群体的死亡率高于WT老鼠。早期中性粒细胞招募到支气管肺泡空间受损没有OPN在肺内的交付克雷伯氏菌细菌或克雷伯氏菌有限合伙人。此外,rOPN诱导中性粒细胞迁移到支气管肺泡空间,独立于CD44。在体外OPN并不影响k .肺炎增长或中性粒细胞的功能。
总之,OPN水平在支气管肺泡空间在迅速上升k .肺炎肺炎,OPN是对中性粒细胞趋化现象的功能,从而促进有效的先天免疫反应。
肺炎是一种常见和严重的疾病,是人类的发病率和死亡率的主要原因克雷伯氏菌肺炎是一个经常孤立在院内肺炎病原1。
骨桥蛋白(OPN)是一种磷酸化糖蛋白,广泛的组织和细胞,表达的是参与许多生理和病理过程。OPN已经涉及炎症的重要调节器,占据核心地位的先天和适应性免疫通过调解炎性细胞分化、成熟和迁移,细胞因子的生产。这些过程是通过其受体介导,跨膜分子,CD44,会影响细胞迁移和趋化因子的响应2。动物研究特别指出,OPN在肺部炎症的作用,如出现过敏和哮喘3,4急性呼吸窘迫综合征5、肝纤维化6和寄生虫感染7。此外,患有各种肺部疾病,包括肺结核、矽肺结节病,显示增强肺OPN的表达5,7,结核病患者或间质性肺炎有显著升高血浆OPN水平与健康对照组相比8,9。最近,血浆OPN浓度是脓毒症患者的增加,其中大多数患有肺炎作为主要的感染源10。
考虑OPN表达之间的联系和肺疾病和脓毒症,我们试图确定OPN的潜在作用下呼吸道感染的宿主反应所致k .肺炎。我们首次展示,OPN是重要的早期中性粒细胞招募到支气管肺泡空间,从而为一个有效的免疫反应k .肺炎全身的肺炎。
材料和方法
老鼠
C57BL / 6野生型(WT)老鼠从哈伦的雄性sd公司中购买(霍斯特,荷兰)。OPN敲除小鼠(KO)(杰克逊实验室、巴尔港、我)和CD44 KO小鼠(请提供的a·伯恩斯认为,荷兰癌症研究所,阿姆斯特丹,荷兰)11与C57BL / 6,遗传背景,在动物饲养设施的学术医疗中心(阿姆斯特丹)。
研究设计
动物保健和使用委员会阿姆斯特丹大学的(阿姆斯特丹)批准所有实验。肺炎是由鼻内接种104菌落(CFU)k .肺炎血清型2(写明ATCC 43816;美式文化收藏,,美国马里兰州罗克维尔)作为描述12。样品采集和处理,决定细菌负荷和细胞计数进行描述12。在一些实验中,k .肺炎脂多糖(LPS)(100μg;L1519,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)或重组鼠标OPN (rOPN;1或10μg;< 1.0每1μg取决于欧盟内毒素鲎变形细胞溶解产物测定;研发系统,明尼阿波利斯,美国)鼻内接种。keratinocyte-derived中和的细胞因子(KC), 50μg单克隆anti-murine KC抗体(研发系统)是腹腔内注射2 h rOPN之前,所述13;和控制动物收到同形像控制抗体(研发系统)。
化验
髓过氧化酶(MPO) OPN, KC,脂多糖(LPS)全身的科学家趋化因子(LIX)和巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2水平由ELISA (MPO: Hycult Uden,荷兰;其他:研发系统,阿宾顿、英国)。肿瘤坏死因子(TNF) -α和白介素6 (IL)是通过测量仪珠阵列多路检测(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。天冬氨酸转氨酶(ASAT)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、尿素和creatinin测定与商用设备(σ),使用日立分析器(罗氏)根据制造商的指示。
免疫组织化学
石蜡肺部分被苏木精和伊红染色或Ly-6G单克隆抗体(美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)和作用得到描述14。
杀菌试验,吞噬作用和phago-lysosomal融合
k .肺炎培养在800 - 0.8 ng·mL的存在吗−1rOPN或大豆胰蛋白酶的肉汤。在表示时间点,细菌的数量是由血琼脂板电镀和计数殖民地16 h的孵化后37°C。嗜中性粒细胞的吞噬作用k .肺炎确定所述15。为了确定phago-lysosomal融合在中性粒细胞的吞噬作用k .肺炎,过程是相似的,除了k .肺炎贴上了pHrodo(表达载体、布雷达,荷兰)和中性粒细胞被贴上使用anti-Gr-1-FITC (BD Pharmingen)16。吞噬作用和phago-lysosomal融合计算每个样本的指标:平均荧光阳性细胞×%阳性细胞。
统计分析
所有数据都表示为±扫描电镜。比较了两组完成Mann-Whitney U-tests,比较两组以上完成Kruskall-Wallis邓恩的多重比较测试紧随其后。幸存的动物的数量在观察期间通过卡方检验进行比较。这些分析使用GraphPad Prism 4.0版本,GraphPad软件(CA)圣地亚哥。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
结果
骨桥蛋白水平在增加k .肺炎感染
获得第一个洞察潜在角色OPN在革兰氏阴性肺炎,我们测量浓度OPN在支气管肺泡灌洗液(BALF),肺癌和血浆从WT小鼠感染和6之前,24和48 h后感染104CFUk .肺炎。OPN BALF中浓度迅速增加,达到峰值后6 h感染(图1一个)。肺OPN水平提高较慢且24小时之后与基线相比显著升高(图1 b)。等离子体水平已经在6小时后增加k .肺炎感染与基线相比,继续上升至48 h (图1 c)。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/36/6/1337/F1.medium.gif)
肺和血浆骨桥蛋白(OPN)浓度升高肺炎克雷伯菌感染。OPN在浓度)支气管肺泡灌洗液(BALF), b)肺癌和c)等离子体(0)之前,6、24和48 h后感染104菌落的k .肺炎。数据意味着±扫描电镜;n = 8老鼠每组。*:p < 0.05;* * *:相比p < 0.001 0 h。
骨桥蛋白限制肺部细菌生长
确定OPN由于死亡率的影响克雷伯氏菌肺炎,我们跟着WT和OPN KO小鼠后14天k .肺炎感染。虽然平均生存时间没有差别,很大一部分的WT老鼠(27%)在观察期间而没有任何WT小鼠(p = 0.03;图2)。接下来,我们质疑OPN影响抗菌反应k .肺炎。因此,我们决定细菌产物BALF和肺匀浆WT和OPN KO小鼠6、24和48 h后感染。在感染后6 h,细菌负荷在BALF和肺两品系小鼠相似(图3和b)。在24和48 h后感染,然而,细菌负荷高出10 - 100倍的BALF和肺OPN KO与WT老鼠(BALF: p < 0.01;这两个时间点的肺:p < 0.05;图3和b)。获得洞察感染的传播,我们确定细菌负荷血和脾。6 h,细菌在这些器官还未检测到,而在24和48 h,细菌负荷相似的血和脾WT和OPN KO小鼠(图3 c和d),血浆细胞因子水平(TNF-α和il - 6)和肝损伤(ASAT和ALAT等离子体水平所显示的那样)和肾损伤(如由尿素和creatinin等离子体水平表示)是不同的与WT老鼠相比,OPN KO小鼠(表1)。总之,这些数据表明OPN有助于本地主机防御,肺内舱,期间克雷伯氏菌肺炎。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/36/6/1337/F2.medium.gif)
骨桥蛋白(OPN)敲除小鼠(KO)显示增强的死亡率。百分比生存的野生型小鼠(▪)和OPN KO(□),直到14天后鼻内感染104菌落的肺炎克雷伯菌。每组n = 14日至15日。p = 0.03团体之间。
增强细菌产物中骨桥蛋白(OPN)基因敲除小鼠(KO)。野生型(WT)(▪)和OPN KO(□)小鼠感染104菌落(CFU)肺炎克雷伯菌和细菌负荷测定6、24和48 h后感染)支气管肺泡灌洗液(BALF), b)肺,c)血液和d)脾。CFU血和脾不检测6 h。数据均值±扫描电镜;n = 8老鼠每组。*:p < 0.05;* *:p < 0.01 WT老鼠。
骨桥蛋白缺陷并不影响肺部病理
获得洞察OPN在肺部炎症反应的作用k .肺炎,我们分析肺组织学幻灯片6,获得24或48 h后感染使用半定量评分系统。已经在感染后6 h,轻微的间质炎症和胸膜炎被发现在所有的老鼠。这些参数在24和48 h,大幅度增加和支气管炎,endothelialitis和水肿也从24小时开始。重要的是,肺部炎症的程度在所有时间点两组相似(图4)。此外,肺重量在24小时没有差别;然而,从OPN KO小鼠肺明显重而从WT 48 h后诱导的小鼠肺肺炎(24小时:115±2与109±3;48 h: 109±5与134±9日WT与OPN KO小鼠,分别;分别为p = 0.13, p < 0.01)。
类似的肺组织病理学。代表肺组织学的野生型(WT) (a、d、g)和骨桥蛋白(OPN)淘汰赛(KO) (b、e、h)小鼠6 (a - c)、24日(d-f)和鼻内感染后48 h(胃肠道)104菌落的肺炎克雷伯菌。肺部分代表八个老鼠每组时间点。溶血素和伊红染色。规模酒吧= 1毫米。病理学分数意味着±扫描电镜。▪:WT;□:OPN KO;n = 8老鼠每组。
骨桥蛋白缺乏会导致受损的早期中性粒细胞招募到支气管肺泡空间在k .肺炎感染
肺部细菌负荷是相似的在感染后6 h但增强没有OPN的24小时之后,我们接下来质疑OPN影响早期中性粒细胞招募到肺部k .肺炎感染。6 h BALF中中性粒细胞数明显减少OPN KO小鼠相比WT老鼠(图5,p < 0.05)。然而在肺组织,嗜中性粒细胞浸润和OPN在WT类似KO小鼠,由MPO测量肺匀浆和量化Ly6 +细胞在肺组织的幻灯片(图5 b和c)。感兴趣的,在这个时间点,OPN水平强烈增加BALF而不是肺匀浆与未感染的小鼠相比图1)。趋化因子发挥重要作用在炎症细胞的招聘,我们测量科学家在感染后6 h BALF中趋化因子水平。而KC水平显著降低OPN KO小鼠与WT老鼠相比,MIP-2和LIX浓度是相似的(图5 d-f)。值得注意的是,在24和48 h后感染,中性粒细胞数BALF中显著增强OPN KO小鼠与WT老鼠(24小时:6.39±0.7与15.3±1.7×105细胞·毫升−1BALF;和48 h: 5.1±0.6与13.2±3.3×105细胞·毫升−1BALF;分别为p < 0.01和p < 0.05);同样,趋化因子水平更高的BALF中OPN KO小鼠比BALF WT老鼠在这些以后点(数据没有显示)。重要的是,肺部细菌负荷高出10 - 100倍OPN KO小鼠在24小时(图3),可能导致这些老鼠在这些增强的促炎反应后时间点。在一起,这些数据表明,OPN在BALF有助于早期中性粒细胞的涌入到支气管肺泡空间后肺部感染k .肺炎。
受损的早期中性粒细胞招募支气管肺泡灌洗液的骨桥蛋白(OPN)基因敲除小鼠(KO)。一)中性粒细胞涌入到支气管肺泡灌洗液(BALF);b)髓过氧化酶(MPO)在肺匀浆浓度;c) Ly6 +细胞在肺组织的幻灯片量化;和BALF d) keratinocyte-derived细胞因子(KC), e)巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2和f) lipopolysaccharide-induced科学家趋化因子(LIX)感染后6 h 104菌落的肺炎克雷伯菌。数据意味着±扫描电镜;n = 8老鼠每组。*:p < 0.05;* * *:与野生型相比p < 0.001 (WT)。
骨桥蛋白缺乏会导致早期中性粒细胞减少肺内的交付后流入到支气管肺泡空间克雷伯氏菌有限合伙人
获得进一步证明为一个角色OPN在早期中性粒细胞招募革兰氏阴性肺部炎症的可能影响不同的细菌负荷,我们灌输克雷伯氏菌有限合伙人通过OPN KO的航空公司和WT老鼠和BALF中中性粒细胞的数量决定收获6和24 h后。在WT老鼠,有限合伙人政府造成BALF中OPN水平显著上升后6 h有限合伙人(p < 0.05);然而,在24 h, OPN回到基线水平(图6)。像在小鼠感染的可行性克雷伯氏菌,OPN KO小鼠接种克雷伯氏菌有限合伙人显示中性粒细胞减少BALF中与WT小鼠6 h有限合伙人(但不是在24小时后图6 b)。重要的是,OPN在WT老鼠浓度升高后6 h但不是在24 h有限合伙人;因此这些数据进一步表明OPN BALF中导致中性粒细胞的涌入到支气管肺泡空间。
骨桥蛋白(OPN)诱导中性粒细胞招聘到支气管肺泡空间。)OPN水平在支气管肺泡灌洗液(BALF)野生型(WT);▪)小鼠和b)中性粒细胞涌入到WT BALF和OPN淘汰赛(KO;□)小鼠6,鼻内政府100μg后24小时克雷伯氏菌脂多糖。数据意味着±扫描电镜每组(n = 6 - 8)。c)中性粒细胞在鼻内后6 h BALF PBS涌入,1μg或10μg重组OPN在WT老鼠(rOPN)政府。中性粒细胞涌入到BALF鼻内后6 h 10μg rOPN政府d) 50 WT老鼠收到μg keratinolyte-derived细胞因子(KC)中和抗体或同形像控制腹腔前2 h rOPN WT和CD44 KO小鼠和e)。数据意味着±扫描电镜;n = 5 - 8每组。* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
骨桥蛋白是支气管肺泡趋化现象的空间
确定OPN确实是趋药性的支气管肺泡空间我们给与灌输PBS或1或10μg WT rOPN的老鼠。在滴注法后6 h,我们决定渗透BALF细胞的数量。虽然1μg rOPN并非与大量细胞,滴注法10μg rOPN导致招募中性粒细胞的支气管肺泡空间(图6 c,与PBS相比p < 0.001)。自从在OPN KO小鼠早期中性粒细胞数量减少k .肺炎感染是伴随着KC浓度降低,我们确定是否KC依赖rOPN的趋化作用。因此,我们预处理小鼠中和anti-KC或控制抗体(如前所述)13,17肺内的交货前)2 h rOPN(10μg)。Anti-KC治疗并不影响引起的中性粒细胞招募到BALF rOPN (图6 d)。CD44是一个跨膜分子介导细胞迁移和趋化因子的响应18,OPN的重要受体19。因此,我们决定是否引起的中性粒细胞招募OPN CD44的依赖。在10μg WT rOPN行政和CD44 KO小鼠表现出类似的嗜中性粒细胞招募后6 h (图6 e)。在一起,这些数据表明OPN在肺趋化现象的一种机制,是独立于KC和CD44。
骨桥蛋白不影响k .肺炎增长和中性粒细胞吞噬或phago-lysosomal融合
上述实验证实没有OPN,老鼠显示早期招募中性粒细胞减少支气管肺泡空间,伴随着细菌负荷增加。除了受损的早期中性粒细胞涌入,增强细菌产物在缺乏OPN可能另外解释直接OPN对细菌生长的影响或改变OPN KO中性粒细胞的吞噬能力或phago-lysosomal融合。因此,我们添加了OPNk .肺炎和监控是否影响细菌生长。OPN没有改变这种病原体的生长在体外(图7)。此外,吞噬能力和phago-lysosomal融合没有改变OPN KO相比WT中性粒细胞(图7 b和c)。综上所述,细菌清除率的观察损伤OPN KO小鼠无法解释OPN的没有杀菌作用或通过吞噬作用减弱或与溶酶体融合时间OPN KO中性粒细胞。
没有杀菌作用的骨桥蛋白(OPN)肺炎克雷伯菌在体外一成不变的中性粒细胞吞噬作用和phago-lysosomal融合。)增加剂量的重组OPN不影响的增长k .肺炎。growth-arrested b)吞噬作用k .肺炎和c) phago-lysosomal融合在中性粒细胞吞噬决心从野生型(▪□)和OPN淘汰赛(•○)血液在37°c(▪•)和4°c (□,○)。数据意味着±扫描电镜;n = 5 /组。
讨论
目前的研究是第一次调查的功能角色OPN在细菌感染。根据最近的一份报告透露OPN循环水平的提升主要细菌性败血症患者患有肺炎10,我们将演示本地和系统性的OPN水平升高克雷伯氏菌肺炎小鼠。OPN迅速被释放到支气管肺泡空间在呼吸道感染k .肺炎,它极大地推动了早期的招募中性粒细胞。随后,OPN KO小鼠显示降低抗菌防御感染在主站点,反映在肺部细菌含量的增高,导致更高的死亡率。OPN的趋化功能在bronchalveolar空间对中性粒细胞在研究证实使用来自克雷伯氏菌并使用rOPN实验。OPN抗菌效应中性粒细胞的功能没有影响。我们的数据表明OPN提高本地主机防御中克雷伯氏菌肺炎至少部分通过促进早期中性粒细胞招募。
几项研究已经证明了增强OPN表达在亚急性和慢性肺部炎症4,5,7,20.。然而,知识的生产OPN在急性炎症是有限的。到目前为止,只有一项研究在实验感染革兰氏阴性,引起的弗朗西斯氏菌属novicida气管内的管理,表明OPN信使rna诱导肺感染的老鼠21。我们这里显示鼻内滴注法的可行性k .肺炎结果OPN在快速释放到支气管肺泡空间,而肺组织OPN水平逐渐增加更多。值得注意的是,OPN已经检测BALF中未受感染的老鼠。呼吸道上皮细胞是一个可能的来源的本构BALF OPN水平:我们观察到显著的自发释放OPN在培养两个截然不同的小鼠上皮细胞系(MLE-12和MLE-15)没有任何刺激(数据未显示)。此外,众所周知,肺泡巨噬细胞分泌OPN在炎症2。一致,我们发现深刻OPN释放小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)与刺激克雷伯氏菌有限合伙人或完整k .肺炎(数据没有显示)。
在这项研究中,我们表明OPN水平的增加引起的k .肺炎肺炎服务功能在宿主防御这种感染中的作用。尽管肺部细菌生长仍然类似OPN KO和WT小鼠6 h postinfection,增强细菌生长在主站点的感染被发现在缺乏OPN从24小时开始。,OPN KO小鼠表现出更高的死亡率。传播细菌和器官衰竭在两组相似,这表明肺部细菌负荷的差异主要决定结果的感染。作为快速中性粒细胞招募为有效清除肺部是至关重要的k .肺炎22期间,我们调查是否OPN影响这一过程的早期感染。事实上,我们发现受损的早期中性粒细胞招募到支气管肺泡空间,但不进入肺组织,在缺乏OPN在感染后6 h。早在这个时间点,BALF OPN水平增加,但不是在肺匀浆,与未感染的老鼠相比,这些数据表明OPN的快速释放到支气管肺泡空间在呼吸道感染克雷伯氏菌行为,吸引中性粒细胞进入航空公司。这个建议是我们实验的支持克雷伯氏菌有限合伙人被用来煽动刺激(揭示嗜中性粒细胞减少涌入到BALF OPN KO小鼠)和研究的肺内的交货rOPN诱导中性粒细胞招募到支气管肺泡空间。之前我们的数据确认和扩展数据OPN的角色作为中性粒细胞化学引诱物在酒精在肝脏,和反面A-induced肝炎23,24。此外,OPN一直牵连在腹膜腔作为中性粒细胞化学引诱物研究表明OPN KO小鼠的腹腔内中性粒细胞招募受损应对高碘酸钠和一个健壮的中性粒细胞数量增加腹水rOPN局部注射25。据报道一致,OPN KO中性粒细胞向fMLP展览减少化学运动性和趋化作用,而rOPN施加直接的对中性粒细胞趋化现象的影响在体外25,26。最近的一项研究表明,聚合与α9β1 OPN的结果在一个互动的整合素在中性粒细胞,OPN的趋药性的功能是至关重要的27。这种交互是否还驱动OPN-induced中性粒细胞迁移到支气管肺泡空间在活的有机体内还有待建立。我们目前的结果反对科学家的一个重要的间接作用趋化因子在OPN的影响中性粒细胞招聘到支气管肺泡空间。KC, LIX MIP-2已被证明调解中性粒细胞招募在革兰氏阴性肺部炎症28。其中,只有KC水平降低BALF中OPN KO小鼠感染后早期克雷伯氏菌,这可能会导致中性粒细胞减少涌入这些动物。然而,anti-KC没有影响涌入这些炎症细胞在鼻内rOPN管理局,反对一个中间角色的KC OPN-mediated中性粒细胞招募。值得注意的是,人类和老鼠趋化因子系统不同,因此当前结果肺炎OPN在小鼠模型的作用不能直接推断人类呼吸道感染。此外,克雷伯氏菌主要原因在免疫功能低下的患者感染;尽管增强OPN表达在免疫缺陷的患者被描述29日;进一步的研究需要建立OPN的功能作用的细菌感染免疫功能不全的主机。
CD44是OPN的重要受体2,19参与分化和中性粒细胞的趋化作用30.。与巨噬细胞、中性粒细胞中CD44的表达和本地化OPN表达独立的25。我们这里有证明rOPN-induced中性粒细胞招募到支气管肺泡空间CD44独立是这种反应CD44 KO和WT老鼠之间几乎没有区别。值得注意的是,巨噬细胞OPN引起的累积在活的有机体内以前发现依赖CD44,表明OPN施加对中性粒细胞和巨噬细胞趋化现象的影响通过不同的机制31日。toll样受体(TLR)信号明显有利于宿主防御中k .肺炎感染32- - - - - -35,一个潜在的OPN信号之间的相互作用和TLR反应可能会感兴趣的。尽管这种互动的知识是非常有限的,一项研究表明OPN表达成牙骨质细胞,诱导Porphyromonas gingivalis派生的有限合伙人,这是众所周知TLR2和TLR4交互36,部分被抗体TLR4 / MD2复杂37。
增强细菌生长在缺乏OPN可以,除了受损早期中性粒细胞涌入到支气管肺泡空间,此外被解释为一个改变OPN KO中性粒细胞的吞噬能力或phago-lysosomal融合。我们没有发现改变没有OPN在这些过程中的任何一个。这个结果是按照之前数据显示,一些抗菌效应中性粒细胞的功能不受OPN缺乏症25。
当前的模型克雷伯氏菌肺炎与人类相似肺炎和败血症),因为它是侵入性呼吸道感染导致感染的传播和遥远的器官损伤,引起的临床相关的革兰氏阴性呼吸道病原体。细菌性肺炎的发现在这个模型生成被认为是理解的相关性肺炎的发病机理38,39。尽管如此,推断人类疾病应小心。
总之,我们这里首次表明OPN水平在支气管肺泡空间正在迅速上升k .肺炎肺炎,对中性粒细胞趋化现象的函数,从而有效的先天免疫反应。
确认
我们感谢j . Daalhuisen m .十边缘和r . de啤酒专家技术援助。
脚注
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年1月6日。
- 接受2010年3月27日。
- ©2010人队