摘要
虽然肺淋巴滤泡(LFS)的存在已经与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的进展相关,存在关于血管形成的地址素或炎性细胞密度的这些结构内的COPD的图案,表达无信息。
组织学和免疫组化技术用于评估LFS的患病率,结构,定位,血管和细胞增殖和细胞增殖/凋亡,以及B-和T淋巴细胞,巨噬细胞,树突细胞和CD57的滤窗密度+在9名不吸烟者、18名非COPD吸烟者、16名中度COPD吸烟者和16名非常严重COPD患者的肺组织中发现细胞。
CD57的密度+COPD患者的LF类内细胞显著增加相比,非吸烟者和吸烟者不COPD(P <0.05)。此外,LF型材与细胞凋亡百分比也COPD患者(P = 0.03)更高显著。相反,在其它炎性细胞的滤泡密度观察组之间没有差异显著,也不在血液和淋巴管的LF内的分布。
由于CD57+细胞是细胞毒性和免疫调节的重要效果,其滤饼密度的增加支持COPD中局部免疫功能障碍的假设。
慢性阻塞性肺病(COPD)的特征在于渐进性和不完全可逆的气流受限,与肺对有害颗粒和气体,主要是香烟烟雾的异常炎症反应有关1.COPD的主要病理特征是周围气道和肺实质,以及肺血管。
现在已经确定,慢性阻塞性肺病是一种由固有免疫系统和适应性免疫系统细胞之间复杂的相互作用引起的慢性炎症。最近,这一炎症过程与COPD患者肺中的异位淋巴滤泡(LFs)的发展有关2- - - - - -7,类似于在其他炎症或自身免疫性疾病中发现的三级淋巴组织8,9.
因为LFs在COPD患者的气道中被描述2在美国,这些结构及其在COPD发病机制中的可能作用的研究越来越受到关注。慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD) 0期至4期COPD的进展与含LFs的细支气管数量相关3..此外,尽管触发-LF类形成的刺激的性质仍然是未知的,在COPD患者和肺气肿小鼠的滤泡B淋巴细胞寡克隆过程已经报道,这表明在这些结构中的抗原特异性增殖4.
相反,尽管有报道称COPD患者肺组织中巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞的数量增加10.,11.,现有数据很少对这些细胞的毛囊密度和参与招募到COPD的LF分子,特别是在疾病的最严重的阶段。事实上,只有一个研究报告的T调节细胞的中度慢性阻塞性肺病患者的LF内的较高比例与吸烟者和非吸烟者相比,5,但没有任何资料有关的血管供应,淋巴引流或其他关键炎性细胞在有和没有COPD患者毛囊密度。此外,没有研究探讨,其地址素参与炎症细胞的迁移从血液进入在COPD的LF。
本研究的目的是检测中、重度COPD患者肺组织中LFs的患病率、定位、血管化、定位素表达和炎症细胞密度,与不吸烟者和非吸烟者进行比较。
方法
主题
该研究人群组成59名受试者,接受肺切除的肺切除,对非阻塞性外周血肺肿瘤或进行双重肺移植以进行非常严重的COPD。Vall D'Hebron医院(西班牙巴塞罗那)的道德委员会批准了研究和书面知情同意,从所有患者中获得。根据他们的吸烟习惯(吸烟者和非吸烟者)和COPD严重程度,将受试者分为四个临床组1: 9例不吸烟(不吸烟)患者,肺功能正常;18例无症状吸烟者,肺功能正常;16例中度COPD吸烟者(GOLD 2期);16名吸烟者,患有非常严重的COPD (GOLD stage 4),正在接受肺移植。
标准程序12.和设备(Masterlab;Jaeger, Würzburg,德国)用于评估所有患者的肺功能,包括测量1秒内用力呼气量(FEV)1)、肺活量、残余肺活量、总肺活量及一氧化碳扩散能力(DL,CO).所有受试者均无急性肺部感染,术前均未接受化疗。
样品处理
在手术过程中所获得的切除肺或裂片立即用4%甲醛浸泡前充气固定液24小时。固定后,手术标本中连续切成1厘米轴向区段和肺气肿的严重程度,使用由Thurlbeck描述的面板网格分级等等。13..随后,2×2×1-cm随机选取组织块,石蜡包被,切成4 μm系列切片,安装在带正电的载玻片上(Starfrost Plus;Menzel-Glaser,布伦瑞克,德国)。每块切片用苏木精和伊红染色。
免疫组织化学
下列抗体在指定的稀释液中使用:多克隆抗CD3(达科葡萄球菌,丹麦,丹麦; 1:400),单克隆抗CD4(Novocastra,UK; 1:50),单克隆抗CD8(达科偶联; 1:100),单克隆抗CD20CY(达科葡萄球菌; 1:800),单克隆抗CD57(达科葡萄球菌; 1:80),单克隆抗滤泡树突细胞(Dakocytomation; 1:20),单克隆抗CD83(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,CA,USA,USA; 1:30),单克隆抗CD68(达科葡萄球菌; 1:50),单克隆抗血小板 - 内皮细胞粘附分子(PECAM)-1(Dakocytomation; 1:200),单克隆抗Podoplanin(Abcam,剑桥,英国; 1:150),单克隆抗粘膜地址细胞粘附分子(Madcam)-1(ABD Serotec,Kidlington,UK; 1:30),单克隆反外围节点地址(Pnad)(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA; 1:50),单克隆抗KI-67(达科葡萄球菌; 1:150),单克隆抗BCL-6(达科葡萄球菌; 1:60)和多克隆抗切割Caspase 3.(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,美国;1:200)。
用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)反应;免疫染色使用抗生物素蛋白 - 生物素复合物(ABC)免疫过氧化物酶方法进行(Vector Laboratories公司,Burlingame的,CA,USA的Vectastain ABC精英试剂盒)。对于CD3和CD57抗原的免疫双,将切片先用多克隆抗CD3培养。DAB发展后,此标记是用镍硫酸铵溶液,这使微分黑颜色的T细胞的获得方法扩增。在此之后放大,切片用单克隆抗CD57孵育,用DAB发展产生棕颜色。因此,这种设计CD3之间允许分化+CD57.+细胞(用黑色和棕色染色)和CD3-CD57.+细胞(brown-stained)。
LF类评估
继先前由埃利奥特描述的标准等等。14.,将LFS定义为> 50个淋巴结核细胞的局灶性收集,细胞密度(每毫米细胞平方)超过周围组织的10倍以上。Haematoxylin和eosin染色用于评估来自所有患者的样品中LFS的存在和位置。此外,针对每种抗体分析每个受试者的两部分。
对于细胞密度的评估,使用了前面描述的点计数方法15..简而言之,至少六个场被随机且系统地采样,以便通过使用具有附着在显微镜目镜的目镜的已知区域的栅格来评估卵泡组织中的细胞密度。使用针对所使用的特定放大倍率计算的转换因子计数并转换为击中每个LF曲线的点数并转换为平方毫米。在每个领域中,通过计数不在血管或排除线的相交的细胞分布来确定细胞的数量。通过平均所有LFS的结果获得平均患者值。表达细胞密度作为检查每平方毫米组织的细胞数。
无论是在LF周边或在其内部:此外,患者的血管结构之内的LF地址素阳性染色的百分比通过考虑这些标记的两个不同的位置来确定。患者与增殖和凋亡的LFS中的标志物阳性的比例也平均。这些案件进行编码和测试,缺乏临床资料的知识做。
统计分析
的描述性统计分析包括平均值±扫描电镜为每一个参数。采用方差分析对组间临床资料进行比较。采用χ 2检验比较病例组间LFs的患病率、血管化、增殖和凋亡情况。采用Kruskal-Wallis检验分析LF细胞密度的差异。当差异显著时,组间比较采用Kruskal-Wallis检验后再采用Mann-Whitney u检验。显著性水平为p<0.05。所有分析均使用Statgraphics Centurion XV (StatPoint, Inc., warren, VA, USA)进行。
结果
人口学和临床数据
表1显示了患者群体的特征。4个临床组在年龄上相似,COPD吸烟者与非COPD吸烟者的累计吸烟量无显著差异。相比之下,FEV的值1, FEV1/ fvc和DL,COCOPD患者显着差异,非常严重的COPD受试者显示最低值。此外,如预期的那样,COPD患者中有显着增加的宏观肺气肿度(%预测),特别是那些在一个非常严重的金阶段(表1).
LF评估
结构化和本地化
在研究的89%的样品中观察到至少一种LF的存在,它们在四个临床组中的患病率为83-100%,而且它们之间的显着差异(表1).LF类无纤维覆盖层进行了表征单核细胞浸润的高密度。此外,碳末颗粒经常位于LF类的外围,特别是病人有非常严重的慢性阻塞性肺病(而是1A).
肺淋巴滤泡(LFs)的血管化和定位素。a)小动脉外膜LF苏木精-伊红染色。淋巴团块周围常可见炭疽颗粒(箭头)。淋巴管围绕在左乳周围(星号)。b)血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)-1在肺LFs中的免疫定位。淋巴肿块内部及周围可见血管。PECAM-1在内皮细胞的扁平型和高内皮小静脉(HEV)表型中均有表达。c) podoplanin在肺LFs中的免疫定位。浸润淋巴团块的周围淋巴管细节。d)外周淋巴结地址蛋白(PNAd)在肺LFs中的免疫定位。 PNAd was expressed in both HEVs and conventional vessels. e) Immunolocalisation of mucosal addressin cell adhesion molecule (MAdCAM)-1 in a Peyer’s patch (positive control). f) Immunolocalisation of MAdCAM-1 in lung LFs. None of the LF profiles was MAdCAM-1-positive. Immunostained sections were counterstained with Friedlander's haematoxylin. Scale bars: a, d and e) 100 μm; b, c and f) 50 μm.
支气管动脉和adventitias,和实质间质:LF类基本上是在三个组织区室分布。有时,某些样品表现出支气管adventitias和小叶隔片,这不包括在由于它们的低频率的进一步分析LF类。
在存在于每个隔室的LF的频率观察到组间无差异显著。然而,有趣的是,非吸烟者显示支气管的LF的发病率较高,而在COPD患者中,小动脉车厢被更频繁地渗透的LF(而是1A).
Vascularisation
在LF类的存在和血管的分布通过PECAM-1(的免疫定位确定而是1B.).结果发现,LF部分的95%呈阳性这个标记,并有在临床群体中积极的配置文件的数量没有显著差异。血管在LF两者的中心,并且还与相邻结缔组织中发现,被观察两个平坦和内皮细胞的高内皮微静脉(HEV)的表型(而是1B.).
Podoplanin的免疫常规允许评估LFS中淋巴管的存在(而是1C.).结果显示,约一半(56%)的LFs中检测到淋巴内皮,组间无显著差异。当评估这些LFs中的淋巴管分布时,观察到只有12%的LFs内显示有淋巴管冲洗(而是1C.),而91%的LFS围绕其周边的结缔组织围绕淋巴管。在淋巴管的分布中观察到群体之间没有显着差异。
血管addressins
为了确定肺LFs血管表达的是哪个地址,我们在肺样本中对PNAd和MAdCAM-1进行了免疫定位。肺标本中35%的LFs为pad阳性,但在临床组间差异无统计学意义。值得注意的是,PNAd不仅在hev中表达,而且在LFs的常规内皮细胞中也有表达(而是1D),以及在细支气管和小动脉的一些外膜血管而不叔淋巴组织。
关于LF类的PNAD分布,结果发现,82%,表现出周PNAD阳性血管,而54%显示出中央定位,无临床组之间显著差异。然而,严重的COPD患者表现出较高的数量与全国住户抽样调查中心的LF染色比其他群体(而是2).
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/2/289/F2.medium.gif)
肺的百分比淋巴滤泡(LFS)与外围淋巴结地址(PNAD)+中央船只。数据显示为平均值±扫描电镜.非常严重的慢性阻塞性肺病患者患有较高百分比的LFS中央PNAD染色,尽管发现群体之间没有显着差异(P> 0.05)。ns:nonsmokers;mod:中等;vs:非常严重。
为了评估肺LF类为的MAdCAM-1的反应性,小肠与淋巴集结的部分被用作阳性对照(而是1E).我们发现,无论在哪个位置或临床组,没有一个肺LF谱是madcam -1阳性的(而是1F.).
细胞密度
CD3+, CD4+和CD8+细胞和B淋巴细胞,以及巨噬细胞和CD57+和树突状细胞,以评估是否,临床组之间,有在构成LF类的主要炎症细胞的定性或定量的差异免疫染色。
所有LF类的特点是一个中央芯B-淋巴细胞,最丰富的滤泡细胞(而是3A),和周边区主要由T淋巴细胞浸润(而是3B.).其中,CD4+和CD8+T细胞(而是3C及d)被广泛分布,在任一滤泡芯或周围生发中心。在任何情况下,B细胞和T淋巴细胞都与血液和淋巴管密切接触被发现。
肺淋巴滤泡内主要细胞类型的免疫定位。a) b淋巴细胞是LFs内最丰富的细胞,呈中心分布。b) t淋巴细胞主要分布在卵泡外围,CD4为主+细胞中最丰富的子集(c)中。CD4+和CD8+(d)滤泡核心也有细胞。e)巨噬细胞在淋巴聚集物中弥散分布,而成熟的树突状细胞在大多数LF谱中很少出现(f)+在外围和LF类的中心都被发现的细胞,以及它们的密度是在COPD患者比那些患者的LF类显著高于无COPD(H)。切片用弗里德兰德的苏木精复染,除了一个(c)中,将其用曙红复染。比例尺;一个,d,e和g)为100μm;b和c)125微米;F)250微米;和h)为250μm。
巨噬细胞,成熟树突状细胞和CD57+细胞在大多数LF型材中分布在大部分(而是3E-H).相比之下,孤立的滤泡性树突细胞仅在属于非常严重的COPD患者的样品中发现。
重要的是,当比较LFs的细胞密度时,我们发现COPD患者的CD57密度明显更高+与不吸烟者和非COPD吸烟者相比(p<0.05) (表2,和无花果3 g和h,和4)。相比之下,在其他类型细胞的密度没有显著差异被发现(表2).
此外,为了区分CD57的亚群+细胞,CD3和CD57抗原的双重免疫染色在本系列(执行而是5).随后,CD57的滤泡密度+CD3-和CD57+CD3+亚群进行了评估。结果表明,CD57的平均比+CD3-细胞CD57+CD3+加上CD57+CD3-细胞LFS中为0.23。发现临床组间无显著差异(0.21非吸烟者,0.33吸烟者无COPD,0.16中度COPD患者和0.29在极重度COPD患者)。
![图5-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/2/289/F4.medium.gif)
淋巴卵泡(LFS)对CD3和CD57抗原的双免疫染色。a)CD3(黑色)和CD57(棕色)抗原在COPD患者的LF上的双免疫染色的代表性显微照片。b)CD57(棕色)在同一LF的控制连续部分(3μm)上的免疫染色。箭头表示CD3+CD57.-细胞,圆圈CD3-CD57.+细胞和方块CD3+CD57.+细胞。比例尺= 20 μm。
增殖和凋亡
为了检查是否-LF类中增殖和/或细胞凋亡的词条活性,与阳性细胞染色样本的的Bcl-6,Ki-67的百分比和在至少一个LF胱天蛋白酶3激活测定。
只有两个Nonsmoker和一个非常严重的COPD患者的LF型材对于BCL-6染色阳性(而是6A).相比之下,Ki-67的染色(而是6B)显示大部分LFs发生增殖(范围56 ~ 91%),组间无显著差异。
![图6-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/2/289/F5.medium.gif)
肺淋巴滤泡(LFs)的增殖与凋亡。a)非吸烟者LF中Bcl-6的免疫定位。在一个非常严重的慢性阻塞性肺病患者的LF连续切片中Ki-67 (b)和活化的caspase 3 (c)的免疫定位切片用伊红(a)和弗里德兰德苏木精(b和c)进行反染色。标尺= 50 μm。
在细胞凋亡方面,COPD患者激活caspase 3阳性的比例明显高于其他组(p<0.05) (图。4和6C).事实上,适度的COPD患者的25%,极重度COPD患者的30%,表现出活化的caspase 3染色,而与阳性没有在的LF非吸烟者和吸烟者发现无COPD(而是4).
滤泡CD57+细胞密度(□)和细胞凋亡(Caspase 3+淋巴滤泡(LFs);░)。数据显示为平均值±扫描电镜.中等(Mod)和非常严重的(VS)慢性阻塞性肺病(COPD)患者显示出明显较高的滤泡CD57密度+细胞和LF型材凋亡显著百分比高于非吸烟者(NS)和吸烟无COPD。*:P <0.05与NS;#:P <0.05与吸烟者没有慢性阻塞性肺病。
讨论
很长一段时间,LFS的存在已经与COPD进展相关联3.但是,只有最近注意到在COPD患者中对该三级淋巴组织的细胞和分子模式进行了注重5,6.根据这一研究路线,目前的工作中代表的LF,包括他们的患病率,血管形成,细胞在中度和极重度COPD组成和增殖/凋亡进行全面研究。本结果显示出,对于第一次,COPD患者表现出CD57的滤泡密度的增加显著+细胞相比,非吸烟者和吸烟者无COPD。此外,LF型材与细胞凋亡的百分比也显著COPD患者增加。
本研究的主要目的是量化的主要细胞类型中的LF以它们的密度临床组间比较。重要的是,结果显示,CD57的毛囊密度显著和具体增加+在慢性阻塞性肺病患者中。这一发现增加了关于LFs在疾病中可能发挥作用的新知识,因为有证据表明CD57是肺炎症的标志16.或甚至作为全身免疫功能障碍的标记物,独立于基础疾病的17..此外,最近的研究表明,CD57抗原也是终末分化细胞的标记物,具有很高的细胞溶解潜能18..事实上,将等等。18.报道,CD57表达与促凋亡分子如粒酶A,粒酶B和穿孔素的同时表达相关。因此增加的滤泡CD57的密度+细胞在COPD患者可以解释的LF型材在中度和极重度COPD组观察到细胞凋亡的比例很高。
除了它们的细胞毒性,金等等。19.表明CD57的一个子集+人淋巴组织的发芽中心存在于生发中心诱导B细胞分化和免疫球蛋白产生。此外,劳伦丹等等。20.证明了自然杀伤细胞通过杀死引流淋巴结中的异基因树突状细胞在同种异体移植中作为异源反应性t细胞启动的调节者。
最近,人们对更好地理解LFs在COPD中的病理生理作用越来越感兴趣。有几项观察表明,这些结构可能是对慢性细菌和病毒定植的反应,甚至是对新抗原或自身抗原的反应,这些抗原被假设存在于COPD患者的肺部7.在这方面,卵泡CD57的较高密度+在COPD组中发现的细胞值得注意,因为在慢性免疫激活过程中许多细胞表达CD57抗原21.或在临床条件下,例如感染或免疫功能障碍17..
相比之下,普拉姆的虽然以前的数据等等。5表示CD4增加+中等COPD患者的实质性LFS中的T细胞,目前的结果不会显示临床组中B细胞,T细胞,巨噬细胞或成熟树突细胞的滤饼密度的任何显着差异。
本研究的另一个目标是检查LFs的结构和定位,以发现COPD患者和非COPD患者之间存在的差异。我们已经指出,如前所述,LFs位于气道外膜和肺样本实质2- - - - - -6,14..但在小叶间隔结缔组织和小动脉外膜也可见LFs的存在,COPD患者LFs最常占据的是后腔室。这一发现表明,LF的发育并不局限于气道的结缔组织和实质间质,其他肺室也容易受到这些细胞聚集物的浸润。
霍格等等。3.报告了含有LFs的小气道数量与COPD严重程度之间的关联。然而,当比较每个腔室(小气道、小动脉和实质)的LF谱的数量和分布时,在临床组之间没有显著差异。在数据分析后,我们认为干扰这些结果的一个因素可能是大多数COPD患者接受的吸入皮质类固醇治疗(见表1).相应地,高清等等。22.,发现类固醇疗法和含气道LF类的百分比之间的负相关性。
虽然关于吸入类固醇激素对CD57渗透效果无据可查+已经表明,类固醇疗法大大减少了气道中的淋巴细胞数23..此外,复发缓解型多发性硬化症、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎患者的CD57水平似乎受到皮质类固醇治疗的影响,皮质类固醇治疗降低了这些淋巴细胞计数24..因此,如果吸入类固醇激素可能影响目前的成绩,他们的假想效果就会使CD57的毛囊密度中发现的差异+细胞更加显着。
PECAM的免疫定位显示,COPD患者和非COPD患者的LFs表现出明确的血管化模式,为先前报道吸烟者肺淋巴团块中存在大量血管结构的研究提供了进一步的信息25.,具有特发性肺纤维化的受试者26.与哮喘患者14..相反,平足蛋白的免疫定位表明,大多数LF配置文件并没有提出淋巴管内,这表明这些LF类缺乏自己的淋巴引流。这可能与不存在纤维覆盖物是叔淋巴组织的特性27..
的地址素PNAD和的MAdCAM-1在淋巴结和淋巴集结,混合动力电动汽车的分别表达,并且起到淋巴细胞归巢中起关键作用,从而允许淋巴细胞的通道从血液进入次级淋巴组织28..据我们所知,这是第一次研究,以提供关于全国住户抽样调查和的MAdCAM-1在COPD患者的LF的表达数据。结果显示的LF型面35%是PNAD+,非常严重的COPD患者中,PNAd中央染色显示LF谱最多。相反,没有一个LF谱显示MAdCAM-1阳性。这些结果为先前报道特发性肺纤维化患者LFs中PNAd表达的研究增加了新的认识26.以及其他报告在小鼠支气管相关淋巴组织中MAdCAM-1表达缺失的研究29..PNAD的该特定表达相关与它是异位淋巴组织的特性在慢性炎性疾病中发现30.,31..
最后,对COPD患者和对照组的LFs进行详尽分析后发现,除CD57外,该异位淋巴组织的患病率、空泡化和细胞组成均无显著差异+细胞。因此,患病受试者的LF内这些免疫细胞的特异性的增加使我们得出这样的结论CD57+细胞可以在COPD发病机制中发挥关键作用。
致谢
作者感谢胸外科医院的Vall d'Hebron城的部门(西班牙巴塞罗那)谁提供的生物标本的人员。他们还感谢M.塞维利亚诺(德系细胞BIOLOGIA,Facultat德BIOLOGIA,巴塞罗那大学,巴塞罗那,西班牙)的技术援助和G. Gannaway(系德Didàctica我Organització教育培训(Facultat德Pedagogia,巴塞罗那大学)的语言的建议。
脚注
支持声明
这项研究得到了卫生研究基金(西班牙马德里;FIS 04/0635),加泰罗尼亚肺学会(巴塞罗那,西班牙;Beca SOCAP 2006)和西班牙肺科和胸外科学会(西班牙巴塞罗那;2005)。J. Olloquequi是由加泰罗尼亚总督府(西班牙巴塞罗那)创新、大学和企业部大学和研究委员会和欧洲社会基金(比利时布鲁塞尔)的研究人员培训奖学金资助的。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到2009年12月22日。
- 接受2010年5月12日。
- ©ers 2011.