摘要
内皮功能障碍是香烟烟雾对血管系统的毒性作用的主要后果之一。越来越多的证据表明,小g蛋白RhoA及其下游效应物rho激酶(ROCKs)参与了香烟烟雾引起的全身内皮功能障碍。本研究旨在评估RhoA/ROCKs通路在目前肺功能正常的吸烟者肺动脉内皮功能中的作用。
肺组织来自非吸烟者和因肺癌接受肺叶切除术的吸烟者。在离体肺动脉环中评估乙酰胆碱(ACh)对动脉弛缓的反应。研究了内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、岩石和肌球蛋白磷酸酶亚基1 (MYPT-1)的蛋白表达和活性。
与非吸烟者相比,吸烟者对乙酰胆碱的反应弛缓显著降低(每组n = 8),与前者相比后者eNOS活性降低一致。然而,在两组中eNOS蛋白表达保持不变。与对照组相比,吸烟者的rock、鸟苷三磷酸rhoa和磷酸化的MYPT-1表达显著增加。
肺功能存在肺内皮功能障碍,其肺功能尚未受损。至少部分地减少eNOS账户的活性,部分内皮功能障碍。通过直接或间接抑制rho-a /岩石途径通过抑制肌蛋白酶磷酸酶,通过直接或间接抑制rho-a /岩石途径的直接或间接抑制来增加岩石的表达和活性。
烟草烟雾与心血管疾病有关的高死亡率和发病率有关1目前,它是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要病因。2。COPD患者最显著的病理改变是进行性气流受限、外周气道炎症和肺血管重构3.那4.。然而,肺血管结构的改变并不仅限于重度COPD患者,因为在轻度气道阻塞的患者中,甚至在没有气流限制的重度吸烟者中也发现了这种变化5.。与其对外围气道的有害影响,烟草烟雾也会导致主动和被动吸烟者的全身内皮功能障碍6.那7.在这种情况下,内皮功能障碍往往先于肺血管的结构改变8.那9.。
在吸烟者中,内皮功能障碍可能是由吸烟产生的自由基引起的炎症介质的释放直接或间接引起的10。烟草烟雾相关内皮功能障碍的确切机制尚不完全理解,但是假设在吸烟者肺脉管系统中的一氧化氮(NO)的生产或降低的生物利用度降低11。
最近的研究表明,小g蛋白RhoA及其下游效应因子rho激酶(ROCK-1或ROCK-β和ROCK-2或ROCK-α)也参与了内皮功能障碍的发病机制12。在平滑肌细胞(SMC)中,鸟苷三磷酸(GTP)-RHOA的rhO-激酶的激活导致肌苷磷酸酶(MPT)的霉菌素结合亚基的磷酸化,也称为肌苷磷酸酶亚基1(Mypt-1)。由此产生的MPT抑制延长肌动蛋白 - 肌球蛋白相互作用并维持预先存在的血管收缩13。此外,RhoA/ rho激酶下调内皮NO合成酶(eNOS)的表达,并损害NO的产生,从而降低了一种有效的对抗机制,以增加血管张力14。
增加的RhoA/ rho激酶活性与系统性内皮功能障碍有关,但仍缺乏证据表明其在肺内皮功能障碍中的作用。本研究的目的有两方面;首先,评估肺功能正常的吸烟者是否存在(或不存在)内皮依赖性舒张受损,其次,确定eNOS/NO减少和RhoA/ rho激酶增加各自在烟草吸烟相关内皮功能障碍中的作用。
方法
受试者和组织制剂
经当地伦理委员会(法国人身保护委员会,法国巴黎)批准,接受肺癌肺切除术的患者在给予知情同意后纳入本研究。他们被分为两组:不吸烟和正在吸烟。除了两名不吸烟的人之外,所有人都从未吸烟。剩下的两名受试者是戒烟20年和25年的前吸烟者(5包和10包)。所有患者肺功能正常,定义为缓慢用力肺活量(FVC)、总肺活量和1秒用力呼气量(FEV)1)≥预测值的80%。无气流阻塞定义为FEV的比值1/FVC≥0.7.15。
从肺肿瘤的宏观症状,小心地解剖外周肺组织和近端肺动脉。切割2-3毫米的外径和4-6毫米长度的环,并立即置于冷克雷斯 - HiseLeit溶液(4°C)中,用于在后续30分钟内进行血管反应性研究。将肺动脉和肺实质的其他标本储存在-80℃以进行蛋白质印迹,或者它们在4%福尔马林中固定过夜,并嵌入在石蜡中用于免疫组化评估。
化工产品
eNOS抗体购自BD Transcuction Laboratories(Lexington,美国,美国)。Santa Cruz Biotechnology,Inc(美国圣克鲁斯,CA)提供了岩石-1,Rock-2和RhoA的一部分抗体。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗购自Pierce Biotechnology,Inc(Rockford,IL,USA)。RHO激活试剂盒用于拉压测定从Rengegen Bioreagent Corp.购买(维多利亚,BC,加拿大)。Rho-Kinase测定套件由Cyclex Co.,Ltd(Tera-Sawaoka Ina,Negano,Negano)提供。一氧化氮合成酶测定试剂盒购自Cayman Chemical Europe(法国大众)。通过GE Healthcare Life Sciences(英国小Chalfont)提供循环鸟苷胺单磷酸酶(CGMP)酶免疫测定Biotrak(EIA)系统。所有其他化学产品均购自Sigma-Aldrich(德国Steinheim)。
肺动脉血管环的等距张力测量
每个肺动脉环安装在两个平行的不锈钢线之间,用于测量器官室(Emka Technologies,巴黎,法国)的等距张力。单个器官浴缸填充20毫升克雷斯 - Henseleit溶液(葡萄糖10mm,丙酮酸2mm,Hepes 10 mm,EDTA 0.03mm,NaCl 118mm,Kcl 4.7mm,CaCl22.5毫米,kh2阿宝4.1.2毫米,MgSO4.1.2毫米,NaHCO3.15毫米),在37°C加热,并持续以95% O充气2和5%的co2。环段产生的等距力由Macintosh Performa 630软件(Apple)测量和记录。肺动脉环最初在1-1.5克之间稳定30分钟,其静息张力已被确定为张力发展的最佳长度。
随着苯肾上腺素浓度的增加(10-8-10年-5Mol·L.-1)如前所述16。对于每个环,计算了实现最佳收缩所需的脱氧肾素的有效浓度。吲哚美辛(10.-5Mol·L.-1)在去苯肾上腺素前30分钟加入器官浴,以排除环氧合酶途径产物的影响17。在苯肾上腺素收缩系列后,用新鲜的克雷布斯溶液冲洗浴槽三次,让环在静息张力下稳定1小时。
将肺动脉环暴露于高浓度的乙酰胆碱(Ach;10-9-10年-4Mol·L.-1)。每个病人至少有四个环被研究以获得结果。
eNOS,Rock-1和Rock-2的免疫组化评估
对于eNOS免疫组织化学染色,如前所述,切片准备以阻止一、二抗体的非特异性结合和非特异性反应18。切片与特异性eNOS抗体孵育(1 / 100滴)。所有结合抗体切片与酶标二抗孵育。切片与金属增强的3,3 ' -二氨基联苯胺过氧化物酶底物孵育,直至获得所需染色。用苏木精对组织进行反染,并用光镜检查。阴性对照部分单独在无一抗的封闭缓冲液中孵育。检测肺动脉环内皮细胞中eNOS的免疫染色表达。采用强度评分法测定染色表达。对每个病人至少进行了10次计数图像。
对于Rock-1和Rock-2免疫染色,部分用免疫菌染色系统染色。通过在血清嵌段中滴定测定,将原发性抗体(山羊多克隆免疫球蛋白(Ig)G)稀释至5分钟,如下)。与一抗初抗体孵育2小时后,将切片在PBS中洗涤,并与生物素化的二抗和HRP-链霉抗生物素蛋白复合物孵育30分钟。在将HRP底物混合物加入部分后,在60秒内得到所需的染色。然后进行备受染色,脱水和安装载玻片的最后一步。在肺动脉的SMC中测量岩石-1和岩石-2过氧化物酶染色的表达。为每个受试者进行十个放大的视野。
Western blot检测eNOS、ROCK-1、ROCK-2、RhoA和p-MYPT-1蛋白的半定量
将等量调整为蛋白质含量的肺动脉匀浆进行7.5% SDS-PAGE (eNOS, ROCK-1, ROCK-2和磷酸化的MYPT-1 (p-MYPT-1))或12%凝胶(RhoA)电泳,然后转移到PVDF膜(Immobilon-P, Millipore SA,法国)。膜被封闭在5%脱脂牛奶,0.1%吐温-20 PBS在室温下1小时。膜与抗体杂交过夜以挪士(稀释1 100年),岩石(稀释1 500年),RhoA(稀释1 100年)和p-MYPT-1(稀释1 200年),然后孵化与HRP-linked山羊anti-mouse(5000年以挪士,稀释1)抗体或驴IgG-HRP二级抗体为45分钟岩石(稀释1 10000年),RhoA和p-MYPT-1(稀释1 5000年)。用β-肌动蛋白确定等量的样品。根据制造商的说明,使用增强化学发光试剂在薄膜上形成蛋白带。用成像软件系统(Genius 2;Syngene,剑桥,英国)和标准化的β-肌动蛋白密度。
以挪士活动
eNOS的活性测定使用比色法NO合成酶测定试剂盒(开曼化学欧洲)。该试剂盒用于评价NO的生产L.- 通过烯醇的作用在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯存在下,这是该酶的基本协同因子。总共产生的最佳指数是亚硝酸盐的总和(没有2-)和硝酸盐(NO3.-)浓度,间接表示总eNOS的活性。化验的所有步骤都按照生产商的说明进行。反应的最终产物为NO3.-。结果以540nm的吸光度读取。没有的浓度3.-用所提供的硝酸盐标准品的标准曲线进行测定。
CGMP浓度
根据制造商说明,采用酶免疫分析Biotrak (EIA)系统(GE Healthcare Life Sciences)测量肺动脉cGMP浓度。它结合使用过氧化物酶标记的cGMP偶联物,一种可以固定在预涂层微孔板上的特异性抗血清,以及一锅稳定底物溶液。该试验是基于未标记的cGMP和用过氧化物标记的固定数量的cGMP之间的竞争,在cGMP特异性抗体上的有限数量的结合位点。结果通过450 nm吸光度比色法读取。用cGMP蛋白标准品校正后的标准曲线内插入吸光度读数来定量样品的浓度。
下拉法测定RhoA活性形态
Rho活化使用Rho活化试剂盒(stress bioagent Corp.)确定。测定RhoA的活性形式(GTP-RhoA)。该试验使用谷胱甘肽S.- 转移酶 - 融合蛋白,含有小鼠镇的rho结合结构域与亲和力沉淀活性Rho(GTP-rhO),从肺动脉匀浆(500μg总蛋白)。在下拉测定后,将25μL洗脱样品分离12%SDS-PAGE凝胶,转移到PVDF膜中并用抗rhOA探测。如前所述检测和量化蛋白质条带。
ELISA测定Rho-激酶的活性
ELISA通过ELISA使用Rho-kinase测定试剂盒(Cyclx Co.,Ltd)来评估肺动脉中的Rho-kinase活性。用与MBS的重组C-末端对应的基材预涂覆板(肌苷磷酸酶或MyPT-1的肌素结合亚基),其含有由Rho-kinase磷酸化的苏氨酸残基。特定检测器抗体是HRP缀合的抗磷酸-MBS(AF20),其仅在MBS上仅检测磷酸化形式的苏氨酸-696。通过将其与AF20的HRP结合,测量磷酸化底物的量,然后将其从无色溶液中催化了发色基质四甲基苯胺的转化。然后通过分光光度法量化,并反映了肺动脉SMC磷酸盐磷酸化上的RHO-激酶活性的相对量。
统计分析
结果以平均值±表示SEM.。SPSS-V3.0(SPSS,Chicago,IL,USA)的软件用于所有统计分析。用未配对的T检验进行组特性之间的比较。通过ANOVA分析了对弛豫响应的剂量反应曲线的比较进行了反复测量。P <0.05的值被认为是统计学意义。
结果
依赖于ach的内皮依赖性弛豫
内皮依赖性肺动脉舒张对乙酰胆碱的反应(10-9-10年-4Mol·L.-1)与对照组相比,吸烟者显著减少(p<0.001;图。1)。
![图1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/2/349/F1.medium.gif)
患有肺动脉环的内皮依赖性松弛。依赖于乙酰胆碱(Ach;浓度在Mol·L中的内皮依赖性弛豫-1不吸烟者和肺功能正常的吸烟者的肺动脉环。值显示为平均值±SEM.。每组n = 8。□:不吸烟者;▪:吸烟者;* * *: p < 0.001。
以挪士蛋白表达
肺动脉过氧化物酶阳性染色和Western blotting蛋白密度半定量分析显示,吸烟者与非吸烟者eNOS表达差异无统计学意义(p>0.05;图。2A-C.)。
非吸烟者和吸烟者内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。a) eNOS染色的内皮肺动脉和b) Western blot检测eNOS蛋白表达样本。标尺= 200μm。c)通过免疫组织化学和Western blot检测不吸烟者(□)和吸烟者(▪)的肺动脉eNOS蛋白表达。蛋白密度以eNOS/β-actin比值表示。ns:没有显着差异。每组n = 8。d)硝酸盐的浓度(μmol·ml-1)和环磷酸鸟苷(cGMP;μg·L-1×0.1)采用ELISA法测定不吸烟者(□)和吸烟者(▪)的肺动脉匀浆。值显示为平均值±SEM.。每组n = 8。**:P <0.01。
浓度的3.-和cgmp.
无3.-吸烟者的肺动脉匀浆浓度明显低于非吸烟者(p<0.01)。同样,吸烟者从肺动脉匀浆中获得的cGMP浓度显著低于非吸烟者(p<0.01;图2 d)。
岩石1和岩石2免疫染色和蛋白质表达
过氧化物酶染色评分和蛋白密度显示ROCK-1 (图。3A-C.)和摇滚2(图3 d-f)吸烟者肺动脉显着高于非闻名者(P <0.01)。
rho-kinase(岩石)-1在非吸烟者中的表达。a)用岩石-1和b)染色的肺动脉染色的平滑肌细胞,通过Western印迹测量的岩石-1蛋白表达样品。c)通过免疫化学和蛋白质印迹测量的岩石1蛋白表达,从非助药器(□)和吸烟者(▪)。蛋白质密度呈岩石-1 /β-肌动蛋白比。每组n = 8。d)用岩石-2和e)染色的肺动脉染色的平滑肌细胞,通过Western印迹测量的岩石-2蛋白表达的样品。f)通过免疫组织化学和非肺动脉(□)和吸烟者(▪)测量的岩体-2蛋白表达。蛋白质密度呈现为岩体-2 /β-肌动蛋白比。每组n = 8。值显示为平均值±SEM.。标尺= 200μm。* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001。
GTP-RhoA及总RhoA蛋白表达
Western blot分析两组肺动脉总RhoA蛋白差异无统计学意义(p>0.05;图。4.)。下拉测定结果显示出吸烟者GTP-RhoA蛋白表达明显高于非闻名者(P <0.01;图。4.)。与Nonsmoker受试者相比,通过GTP-RhoA /总ROOA与GTP-RhoA /总ROOA的比例评估的肺动脉中RhOA活性显着高(P <0.01;图。4.)。
鸟苷三磷酸(GTP)-RhoA和RhoA在非吸烟者和吸烟者中的表达。a) GTP-RhoA和b) RhoA蛋白表达的样品。c)非吸烟者(□)和吸烟者(□)的肺动脉匀浆中,下拉法检测GTP-RhoA蛋白表达,Western blot检测RhoA蛋白表达。蛋白密度表现为GTP-RhoA/β-actin和RhoA/β-actin比值。GTP-RhoA/总RhoA表现为RhoA活性。值显示为平均值±SEM.。ns:没有显着差异。每组n = 8。**:P <0.01。
p-MYPT-1蛋白表达
Western blot检测的p- mypt1蛋白密度在吸烟者组明显高于非吸烟者组(p<0.01;图。5.)。ELISA定量检测p- mypt -1浓度显示,吸烟者比不吸烟者的p- mypt -1浓度更高(p<0.001;图。5.)。
非吸烟者和吸烟者磷酸化肌球蛋白磷酸酶亚基1 (p-MYPT-1)的表达。a) Western blot检测p-MYPT-1蛋白表达。b)非吸烟者(□)和吸烟者(▪)的肺动脉匀浆用Western blot和ELISA检测p-MYPT-1蛋白表达。Western blot检测的蛋白密度为p-MYPT-1/β-actin。值显示为平均值±SEM.。每组n = 8。**:P <0.01。
讨论
在无症状吸烟者的体循环中,已报道香烟烟雾对内皮功能的有害影响6.那7.那11。迄今为止只有几份报告才调查了轻度COPD吸烟者肺内型功能障碍的潜在机制9.那10或正常的肺功能19。本研究的主要结果,评估肺功能正常的吸烟者与不吸烟者肺内皮功能的比较,可以总结为:1)肺内皮依赖性舒张反应在ACh吸烟者明显受损;2)这种损害与eNOS的活性降低有关,但与eNOS的表达无关;3) rhod -激酶(ROCK-1和ROCK-2)活性和表达增加。
如果目前的研究结果表明肺动脉弛豫的肺动脉弛豫的显着损害,尚未报道肺功能的吸烟者的ACH,几项研究表明,若干研究表明系统性内皮功能障碍的可能性6.那7.那11和肺循环10健康的吸烟者。这一观察结果与肺内皮功能障碍不仅发生在终末期肺部疾病患者这一假设相一致20.,但也可以在轻度COPD患者中看到5.那9.那10以及被认为是健康的吸烟者10那19。由于内皮功能障碍不限于肺循环,因此潜在机制可能与烟草吸烟引起的全身氧化应激有关21.那22.。
降低的生产和/或降低的生物利用度可能占内皮功能障碍8.那11那19。在本研究中,eNOS的蛋白表达没有显著差异(图。2A-C.),但eNOS活性,通过硝酸盐测量和cGMP (图2 d)与非闻人相比,吸烟者显着减少。因此,弛豫的损伤可能不是由于脑表达的减少,而是抑制eNOS活性(硝酸盐)和吸烟者肺动脉中的生物利用度(CGMP浓度)。本研究的结果与之前的报道不同,显示健康吸烟者的肺动脉中的脑脊液中的脑内表达受损19。然而,本研究中发现的eNOS活性降低,与之前的所有研究结果一致,表明no介导的肺舒张功能受损19,或适度9.那10或严重20.肺病。
RhoA/ rho激酶通路在引起内皮依赖性舒张损伤中的作用最近已在吸烟者的体循环中得到证实12。外周白细胞中的增强Rho-激酶活性与流动介导的血管舒张有关23.主动脉硬化增加24.在吸烟者。越来越多的证据表明,RhoA/ rho激酶和NO/cGMP通路之间存在重要而复杂的交叉作用。rhod -激酶可下调eNOS的表达和活性,而无生物利用度25.,而eNOS mRNA的稳定性增加了rho激酶抑制剂26.。此外,后者可以消除对Akt上rho激酶的抑制,这是一种通过钙依赖途径刺激eNOS活性的蛋白激酶,从而导致NO产量的增加27.那28.。
还在本研究中评估了与Rho-kinase的蛋白质表达,rhO-激酶的表达,rhOA(rhOA-gtp)的活性形式(RhoA-gtp)和rho-kinase的活性评估)。结果表明,吸烟者依赖于内皮依赖性放松的损害与RhoA-GTP表达的显着增加有关(图。4.)及p-MYPT-1 (图。5.)。由于rho-kinases引起的Mypt-1的磷酸化导致MPT的抑制,从而维持肌动蛋白 - 肌球蛋白相互作用并延长预先存在的血管收缩13可以想到,增加的RHOO / RHO-激酶活性进一步加剧了肺血管收缩剂和扩张器对健康吸烟者肺循环中增加的血管间调之间的不平衡。与Rho-激酶在肺血管间调调节中的核心作用是最近的初步证明,rho-激酶抑制剂,显着改善的实验性肺动脉高血压在更大程度上,而不是内皮素受体拮抗剂和磷酸二肽酶的抑制剂29.。
结论
本研究的局限性包括每个研究组中具有不同男性/女性比率的相对少量少数患者,以及在RHO激酶抑制剂存在下缺乏对内皮依赖性弛豫的评估。尽管如此,我们的研究提供了与肺功能正常的吸烟者中的肺内皮功能障碍和eNOS活性的减少,与RhoA / Rho-kinase途径的上调有关的证据。应该研究rhOA / rho-kinase途径与eNOS / No信号在吸烟者中的相互作用。
脚注
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年4月12日。
- 公认2010年5月20日。
- ©2011人队