摘要gydF4y2Ba
我们确定了p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)在臭氧和皮质类固醇调节后气道平滑肌(ASM)收缩反应增加中的作用。gydF4y2Ba
小鼠暴露于空气或臭氧(3ppm的3小时)和支气管环,以乙酰胆碱(ACh)等距收缩反应在p38蛋白抑制剂的存在下,SB239063使用肌动描记测量(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)或地塞米松(10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba由于MAPK磷酸酶(MKP)-1是p38 MAPK的负调节因子,我们也在MKP-1中研究了这些效应gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
暴露于臭氧的野生型和MKP-1的支气管环gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠的收缩反应增强,mcp -1的剂量-反应曲线向左移动gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。SB239063抑制支气管收缩空气和臭氧暴露的C57 / BL6和MKP-1同样gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。地塞米松抑制乙酰胆碱诱导的在两个空气和臭氧暴露的C57 / BL6小鼠的支气管收缩,但不是在空气或臭氧暴露MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。乙酰胆碱刺激的p38蛋白和热休克蛋白(HSP)27磷酸化,如通过Western印迹测量,并且该效果是通过在SB239063 C57 / BL6和MKP-1抑制gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠,但不是通过地塞米松在空气或臭氧暴露的MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
p38蛋白起着最大的乙酰胆碱引起的等距收缩反应,并通过臭氧引起的增加收缩的作用。地塞米松抑制通过p38蛋白和热休克蛋白27磷酸化乙酰胆碱诱导的ASM收缩。gydF4y2Ba
- 乙酰胆碱gydF4y2Ba
- 气道平滑肌gydF4y2Ba
- 地塞米松gydF4y2Ba
- 热休克蛋白27gydF4y2Ba
- p38丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba
- 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1gydF4y2Ba
丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族,由p38 MAPK、c-Jun n-末端激酶(JNK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)三个成员组成。MAPKs是通过特定的酪氨酸和苏氨酸残基在其活性区域的磷酸化而激活的。p38 MAPK被炎症细胞因子和细胞应激(包括氧化应激)激活,参与细胞增殖、凋亡和炎症等细胞过程gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。其在气道平滑肌(ASM)收缩反应中的作用尚不清楚。p38 MAPK在ASM等平滑肌(如胃肠道平滑肌)中表达,并在乙酰胆碱(ACh)诱导的收缩过程中被激活gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。随后,p38 MAPK的活化是MAPK活化蛋白激酶2 (MK2)的下游活化,进而导致热休克蛋白(HSP)27的磷酸化。HSP27可能与肌动球蛋白和原肌球蛋白等参与ASM收缩的蛋白有关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。p38蛋白的抑制已被报道提高力波动诱导的最大激活的缩短牛relengthening气管平滑肌条,其涉及细胞骨架重构的稳定化的效果gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。此外,p38 MAPK在臭氧引起的支气管高反应性中起重要作用gydF4y2Ba8gydF4y2Ba或过敏炎症gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。支气管高反应过程可继发于增强的ASM收缩反应,特别是暴露于臭氧后gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。这是类似于炎性细胞因子的白介素1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α增加ASM收缩对ACh的直接作用gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,也通过预曝光防止对糖皮质激素地塞米松的更改gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
MAPKs的诸如抑制p38的失活是部分地依赖于MAP激酶磷酸酶(MKPs),也被称为双特异性磷酸,特别是MKP-1,这也停用其它MAPK成员,包括JNKgydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。mcp -1被环境污染物臭氧和促炎细胞因子上调,从而通过反馈机制限制MAPK的激活。此外,皮质激素(CS)非常迅速地上调炎性细胞和ASM中MKP-1的表达gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,提出了MKP-1可能通过介导MAPKs(尤其是p38)的激活,介导对ASM收缩反应的弛缓作用的可能性。gydF4y2Ba
在本研究中,我们通过研究p38 MAPK抑制剂、MKP-1基因敲除和MKP-1的作用,探讨了p38 MAPK在臭氧暴露引起的支气管等长收缩反应中的作用以及CSs对这些反应的影响gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。我们的数据表明,基线和增强的最大等容收缩胆碱能反应都依赖于p38 MAPK的激活,而CSs的弛缓作用可能是通过MKP-1介导的。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
试剂gydF4y2Ba
乙酰胆碱,5-羟色胺(5-HT),吲哚美辛,SB239063(p38蛋白抑制剂),PD98059(ERK抑制剂),SP600125(JNK抑制剂)和地塞米松购自Sigma-Aldrich公司(英国普尔)获得。SD282,另一p38蛋白抑制剂,来自Scios公司公司(弗里蒙特,CA,USA)的赠品。兔抗磷酸化p38 MAPK和抗p38 MAPK和兔抗 - 磷酸化HSP27和抗HSP27购自Cell Signaling Technology公司(贝弗利,MA,USA)获得。从Dakocytomaton(Glostrup的,丹麦)得到的辣根过氧化物酶(HRP) - 缀合的抗 - 兔免疫球蛋白。ECL加上由通用电气医疗集团(英国斯劳)和再印迹加上温和解来自Millipore(州Billerica,MA,USA)获得。gydF4y2Ba
老鼠gydF4y2Ba
无致病性,男性,10 - 14周龄,MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠来自肯尼迪风湿病研究所(帝国理工学院,伦敦,英国)。MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠混合C57/BL6-129/Sv基因背景,9代后进行回交,然后与杂合子杂交gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba以pcr为基础,对小鼠尾尖基因组DNA进行筛选,鉴定小鼠。无致病性,雄性,10 - 14周龄C57/BL6小鼠,购自Harlan(比斯特,英国),作为野生型对照。动物被安置在帝国理工学院的生物科学设施中,在控制温度(20°C)和湿度(40-60%)的条件下,在12小时的光照/12小时的黑暗循环中,提供食物和水gydF4y2Ba自由采食gydF4y2Ba。在研究中使用的协议和规程是由帝国学院的动物伦理委员会遵守英国内政部的规定批准。gydF4y2Ba
臭氧接触gydF4y2Ba
小鼠暴露于经过滤的空气或臭氧发生器(模型500;桑德臭氧发生器,伍珀塔尔,德国),混合在一个密封的有机玻璃容器中浓度为3ppm过滤空气,如前所述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。臭氧浓度持续监测使用臭氧探测器(ATi技术,奥尔德姆,英国)内的盒子。gydF4y2Ba
支气管环的准备和肌电图gydF4y2Ba
暴露后24个小时,将小鼠通过颈脱位法处死。肺迅速从胸部取出并浸在生理盐水溶液(PSS; 119毫的NaCl,4.7毫米氯化钾,2.5mM的氯化钙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 1.17毫米MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 25mm NaHCOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba, 1.18 mM KHgydF4y2Ba2gydF4y2BaPOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba,0.027毫摩尔EDTA,和5.5mM葡萄糖)。从左侧肺叶内支气管在显微镜下解剖,实质和结缔组织小心取出gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。支气管段,200-400微米的直径和2mm的长度,被安装在一个导线肌动描记的金属插脚(610M;丹麦缪技术,奥尔胡斯,丹麦),悬浮在器官浴,填充用5mL PSS的,通入95%的氧气,并保持在37℃。的等长张力记录,并使用图表软件(AD Instruments有限公司,哈斯丁,UK)进行分析。在在该增加的拉伸的点拍摄的每张支气管环的最佳长度停止从有效长度张力应答得到提高活性张力。简言之,支气管首先拉伸至0.5的Mn,然后依次通过200-μm的长度增量(被动张力)拉伸和刺激以合同主动地(积极张力)与124毫米钾PSS(KPSS)。最佳长度被定义为增加拉伸停止增加活性张力的点。然后支气管被允许平衡在PSS 30分钟;3μM吲哚美辛加入到器官浴抑制上皮前列腺素的释放。所述第一支气管收缩反应用10产生gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−3gydF4y2BaM ACh或10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM 5。试验化合物对暴露于空气和臭氧的小鼠支气管收缩反应的影响进行了评估。用PSS冲洗支气管4次,分别与p38 MAPK inhibitor SB239063或SD282、ERK inhibitor PD98059、JNK inhibitor SP600125或地塞米松孵育1 h,然后进行第二次收缩反应试验。我们还研究了MK2的抑制剂PF-3644022,它是p38激酶的直接下游底物,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。浓度 - 响应曲线拟合为非线性回归与希尔方程(的GraphPad Prism 4.03,圣地亚哥,CA,USA)以提供估计的最大收缩(EgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)和有效浓度的负对数,引起50%的最大收缩反应(pECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
西方墨点法gydF4y2Ba
将肺内支气管切开,置于两根金属尖上,浸泡于PSS中。与KPSS达到最佳张力后,用SB239063 (10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米)、地塞米松(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)或者两者都不做,在风琴浴中1小时,然后10小时gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba加入M - ACh 5min,支气管标本于液氮中快速冷冻。将冷冻样品在提取缓冲液(50 mM tris-(羟甲基)-氨基甲烷(tris), 0.5% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Na)中均质gydF4y2Ba3.gydF4y2BaVOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)通过超声在冰上几秒钟。超声及离心后(8000×)gydF4y2BaggydF4y2Ba(15000转);15 min),收集上清液。等量的蛋白质(10μg每车道)被加载到10% Bis-Tris凝胶(NuPAGE;表达载体,佩斯利,英国)。电泳150 V (40 mA),电泳45 min,分离的蛋白通过干燥吸湿系统(iBlot)转移到硝基膜上;表达载体,佩斯利,英国)。5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 4℃孵育兔抗磷-p38 MAPK或抗磷- hsp27抗体(1:10 00稀释)过夜。孵育后,用hrp标记的抗兔免疫球蛋白在室温下孵育2小时,然后用ECL Plus显影。使用密度计和Grab-It和Gel Work软件(UVP, Cambridge, UK)对频带密度进行量化。膜用Re-Blot +温和溶液剥离,用抗p38 MAPK或抗hsp27抗体(1:10 00)重新检测。 Densitometric results for p38 MAPK or HSP27 phosphorylation were expressed as a ratio of phosphorylated p38MAPK or HSP27 to nonphosphorylated p38 MAPK or HSP27, respectively.
为了探测MKP-1,我们使用了一个兔子反MKP-1 (V-15;美国加州圣克鲁斯生物技术公司;(1:10 00),于4℃下孵育过夜。膜被剥夺了与Re-Blot加上温和的解决方案和reprobed兔子anti-α-tubulin抗体(细胞信号技术、贝弗利、CA、美国;1:1,000)。密度测量结果MKP-1表示为MKP-1α-tubulin比。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
日期以平均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。非配对t-检验,并用Bonferroni校正双向ANOVA被用于制造不同的基团适当地之间的比较。p值<0.05被认为是统计学上显著。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在乙酰胆碱诱导的收缩反应的臭氧暴露MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
在C57/BL6和mcp -1中,支气管收缩对ACh 2小时间隔的反应gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠是相同的(数据未显示)。在臭氧暴露C57 / BL6小鼠,EgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba与暴露于空气中的小鼠相比(7.73±0.31gydF4y2Ba与gydF4y2Ba分别为10.06±0.37 mN,;p < 0.05),但压电陶瓷gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值保持不变。在臭氧暴露MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠中,E的类似增强gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba(7.76±0.27gydF4y2Ba与gydF4y2Ba分别为9.62±0.40 mN,;(p <0.05),剂量-反应曲线左移(pEC)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba5.69±0.14gydF4y2Ba与gydF4y2Ba5.25±0.11;P <0.05)(gydF4y2Ba图。1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
![图1 -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/4/933/F1.medium.gif)
乙酰胆碱(ACh)诱导的支气管等距收缩张力在空气(•)和臭氧暴露的(○)一)C57 / BL6在空气小鼠(12和9臭氧暴露)和b)促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠(11只暴露在空气中,9只暴露在臭氧中)。数据以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。*:P <0.05,与暴露于空气的组相比;**:P <0.01,与暴露于空气的组相比。gydF4y2Ba
SB230963与地塞米松对achc所致支气管收缩的影响gydF4y2Ba
我们使用SB239063研究了p38 MAPK在臭氧作用后增加收缩反应中的作用。SB239063对最大收缩张力的抑制呈浓度依赖性,在10时的抑制率为9.8±3.6%gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM, 20.7±7.4%gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM(数据未示出)。SB239063(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)暴露于空气中的C57/BL6小鼠支气管收缩受抑制29.1±4.0%,pEC无变化gydF4y2Ba50gydF4y2Ba(p < 0.01;gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。因为吲哚美辛存在于沐浴液中,我们试图确定它是否会影响SB239063对收缩反应的调节。然而,当沐浴液中不含吲哚美辛时,我们获得了与SB239063相同的抑制效果,这表明前列腺素的影响不明显(数据未显示)。在与另一受体介导的缩窄剂5-HT收缩后,也观察到SB239063的这种抑制作用,约为30.9±5.0% (p<0.01;gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。使用另一种p38 MAPK抑制剂,SD282 (10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM),对ACh最大反应也减少23.6±5.3%(P <0.01;gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
对SB239063的影响(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)上乙酰胆碱(ACh)诱导在空气露出的)C57 / BL6小鼠的支气管收缩反应的(N = 12)和b)促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1-gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠(n = 11)和臭氧暴露的小鼠(c) C57/BL6小鼠(n = 9)和d) MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠(n = 9)。数据以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。□:空气;▴:空气加SB230963;•:臭氧;▵:臭氧加SB230963。*:与未处理组比较,p<0.05;**:与未治疗组比较,p<0.01。gydF4y2Ba
5-羟色胺(5-HT)的抑制作用A)p38促分裂原活化蛋白激酶诱导的支气管收缩张力(MAPK)抑制剂SB239063(10gydF4y2Ba−6gydF4y2Bab) p38 MAPK抑制剂SD282对乙酰胆碱(ACh)诱导的支气管收缩的抑制作用(10)gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM;n = 3), c)细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059 (10)gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM;N = 6)和d)的c-Jun N-末端激酶抑制剂SP600125(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM;n = 6)暴露于空气中的C57/BL6小鼠。e) mapk活化蛋白激酶2抑制剂PF3644022对暴露于空气中的C57/BL6小鼠achi诱导的支气管收缩张力的影响。数据以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。□:空气;▴:空气+ SB239063;▵:空气+ SD282;▾:空气+ PD98059;▿:空气+ SP600125;▪:控制;♦:10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM PF3644022;•:10gydF4y2Ba−5gydF4y2BaM PF3644022;○:10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba中号PF3644022。*:与未处理组比较,p<0.05;**:与未治疗组比较,p<0.01。gydF4y2Ba
SB239063还可使暴露于臭氧的C57/BL6小鼠的支气管收缩率降低24.4±3.8% (p<0.01;gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。SB239063也降低了EgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba通过在空气和臭氧暴露的25.8±3.1%(P <0.01)和21.8±3.9%(P <0.01)MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠,分别为(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba和d)。gydF4y2Ba
我们还使用ERK抑制剂PD98059(10)研究了ERK和JNK在achc诱导的支气管收缩中的作用gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)和JNK抑制剂SP600125(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM),分别。既不PD98059也不SP600125抑制最大支气管响应(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba和d)。此外,我们调查是否PF-3644022gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,MK2,p38激酶的直接下游底物,抑制剂具有的效果。PF-3644022(10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−5gydF4y2BaM)剂量依赖性也能抑制最大achr诱导的支气管收缩(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM地塞米松在空气中暴露的小鼠(P <0.01抑制支气管收缩了21.6±4.0%;gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),而在10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM,无影响(数据未显示)。地塞米松也降低了EgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba通过在臭氧暴露C57 / BL6小鼠(P <0.01 19.9±3.9%;gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。然而,在既不空气和臭氧暴露的MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba地塞米松对小鼠是否有明显的抑制作用(分别为8.9±2.5%和5.9±1.6%);不显著的;gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba和d)。gydF4y2Ba
![图4 -gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/4/933/F4.medium.gif)
地塞米松的作用(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)对乙酰胆碱(ACh)诱导的支气管收缩张力的抑制作用a)暴露于空气中的C57/BL6 (n = 11)和b) MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠(n = 11)和臭氧暴露的小鼠(c) C57/BL6小鼠(n = 9)和d) MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠(n = 9)。数据以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。□:空气;▴:空气+地塞米松;•:臭氧;▵:臭氧+地塞米松。*:与未处理组比较,p<0.05;**:与未治疗组比较,p<0.01。gydF4y2Ba
p38蛋白和HSP27激活由乙酰胆碱gydF4y2Ba
Air-exposed老鼠gydF4y2Ba
在暴露于空气中的C57/BL6小鼠的支气管制剂中,ACh增加了p38 MAPK (Thr)gydF4y2Ba180gydF4y2Ba/酪氨酸gydF4y2Ba182gydF4y2Ba)和HSP27(丝氨酸gydF4y2Ba82gydF4y2Ba)磷酸化,如磷酸化p38 MAPK和HSP27与总p38蛋白和HSP27,分别(比率测定gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba和c)。无论SB239063和地塞米松抑制p38蛋白HSP27和磷酸化的C57 / BL6小鼠。在暴露于空气的MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba在小鼠中,磷酸化的p38 MAPK与总p38 MAPK、磷酸化的HSP27与总HSP27的比值在achh刺激的支气管制剂中升高(p<0.05和p<0.01);gydF4y2Ba图。5gydF4y2Ba)。SB239063,但不是地塞米松,抑制乙酰胆碱诱导的p38蛋白激酶和HSP27磷酸化MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠(gydF4y2Ba图。5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
的比率,b)中的Western印迹分析磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)到nonphosphoryated p38蛋白和c,d)磷酸化的热休克蛋白(HSP)27至nonphosphoryated HSP27在于为未刺激(CON)支气管制剂,乙酰胆碱(ACh)刺激,或乙酰胆碱刺激的,并与经预处理的SB239063(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)或地塞米松(Dex;10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)从空气中暴露A,C)C57 / BL6和b,d)MAPK磷酸酶(MKP)-1-gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。每个面板显示了磷酸化的p38 MAPK和非磷酸化的p38 MAPK,或磷酸化的HSP27到非磷酸化的HSP27的代表性的Western blots,每组的个体结果为n = 6-7。*:与ACh单独比较p<0.05;**:与ACh单独比较p<0.01;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:不重要。gydF4y2Ba
臭氧暴露的小鼠gydF4y2Ba
在暴露于空气和臭氧的小鼠中,p38 MAPK和HSP27磷酸化的基线水平没有显著差异。在臭氧暴露的C57/BL6小鼠中,ach刺激支气管制剂中p38 MAPK和HSP27磷酸化水平升高(p<0.01和p<0.05);gydF4y2Ba图。6gydF4y2Ba),但与暴露于空气中的C57/BL6小鼠相比,差异无统计学意义。SB239063和地塞米松降低了p38 MAPK和HSP27的激活。臭氧暴露的MKP-1支气管制剂中ach刺激的p38 MAPK和HSP27磷酸化gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠(P <0.01和p <0.05;gydF4y2Ba图。6gydF4y2Ba)。在臭氧暴露MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba在小鼠中,SB239063降低了p38 MAPK和HSP27的磷酸化(p<0.01),而地塞米松则没有(gydF4y2Ba图。6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
的比率,b)中的Western印迹分析磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)到nonphosphoryated p38蛋白和c,d)磷酸化的热休克蛋白(HSP)27至nonphosphoryated HSP27在于为未刺激(CON)支气管制剂,乙酰胆碱(ACh)刺激,或乙酰胆碱刺激的,并与经预处理的SB239063(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)或地塞米松(Dex;10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)来自臭氧暴露的a, c) C57/BL6和b, d) MAPK磷酸酶(MKP)-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。每个面板显示了磷酸化的p38 MAPK和非磷酸化的p38 MAPK,或磷酸化的HSP27到非磷酸化的HSP27的代表性的Western blots,每组的个体结果为n = 6-7。*:与ACh单独比较p<0.05;**:与ACh单独比较p<0.01;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:不重要。gydF4y2Ba
地塞米松对mcp -1表达的影响gydF4y2Ba
我们确定支气管组织的地塞米松治疗是否会导致在MKP-1的表达的任何变化。我们发现从与乙酰胆碱野生型小鼠支气管组织是保温(10gydF4y2Ba−3gydF4y2BaM)导致MKP-1表达无明显变化。但与地塞米松孵育后(10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)和乙酰胆碱(10gydF4y2Ba−3gydF4y2BaM) 1 h时,MKP-1表达显著增加(gydF4y2Ba图。7gydF4y2Ba)。我们发现,从臭氧暴露的小鼠获得的支气管组织了类似的结果。gydF4y2Ba
![图7gydF4y2Ba](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/37/4/933/F7.medium.gif)
丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1和下控制(CON)条件α微管蛋白,乙酰胆碱加入后胆碱(ACh的代表性的Western印迹分析; 10gydF4y2Ba−3gydF4y2BaM),和ACH后(10gydF4y2Ba−3gydF4y2BaM)和地塞米松(Dex;10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)从支气管组织中)空气和b)臭氧暴露的小鼠。*:P <0.05。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们已经证明,p38 MAPK抑制剂可以抑制离体小鼠支气管对乙酰胆碱的最大等容收缩反应,这表明p38 MAPK的激活有助于最大的ASM等容收缩。测量p38磷酸化证实了p38 MAPK活化的增加。其他mapk,如JNK和ERK,似乎与此响应无关。CSs抑制最大收缩反应,这种效应在mcp -1中不存在gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba在小鼠中,p38 MAPK的激活不会被mcp -1调节,mcp -1被CSs上调。地塞米松确实降低了ACh诱导的p38 MAPK活化程度,但在MKP-1中gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba在小鼠中,地塞米松对p38 MAPK活化无影响。这些结果支持了一个观点,即CSs对收缩反应的影响来自于mcp -1表达的调节。gydF4y2Ba
我们还表明,胆碱能收缩反应的臭氧引起的增强,存在类似的情况。这种增强的反应是由一个p38蛋白抑制剂由于增加在MKP-1的表达抑制和CS的抑制效果也可以是,由于在臭氧增强收缩反应在MKP-1观察到的gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠并没有受到CSS。在MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠暴露于臭氧不仅使最大收缩反应增强,而且使ACh剂量-反应曲线显著左移,表明收缩反应敏感性增强。这表明除了p38 MAPK外,在MKP-1控制下可能还有其他激酶可以测定等轴收缩反应的敏感性。gydF4y2Ba
我们的研究涉及到对臭氧暴露导致气道高反应机制的理解gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。他们表明,增加了ASM收缩反应可能是一个重要的促成因素。如,在先前的研究中,我们已经表明,与抗氧化剂,N-乙酰半胱氨酸,臭氧暴露之前防止前处理的小鼠增加的等距收缩反应(未发表的观察)这可以通过氧化应激的激活发生。此外,本研究表明,p38蛋白可有助于增强收缩反应,受p38的ASM中的增加的激活和由p38蛋白抑制剂的抑制效果所证明。必须指出的是,在基线状态,已经有p38蛋白是在调节最大等长收缩反应通过乙酰胆碱或5-HT诱导的受体介导的收缩重要的活化。gydF4y2Ba
由p38蛋白可调控ASM收缩反应的机制尚不清楚。这种激活在基线状态下观察到当肌肉被最大程度地由乙酰胆碱收缩并且还通过其它受体介导的蟒蛇,如5-HT。这将支持这一概念的收缩反应本身可激活P38 MAPK通路。小鼠暴露于臭氧后,观察到的增强的最大收缩响应于乙酰胆碱,和p38 MAPK激活underlied此增强。HSP27可能是p38蛋白的下游效应之一,由于p38蛋白抑制剂,我们使用抑制HSP27磷酸化。在血管平滑肌的研究中,p38蛋白的肌动蛋白调制组织,和HSP27显示抑制肌动蛋白磷酸化依赖的方式聚合和介导的肌动蛋白的重排gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。HSP27在ASM中对胆碱能激动剂carbachol的磷酸化反应已经被证实gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,以及p38 MAPK的酪氨酸磷酸化。p38 MAPK还可以磷酸化其他非肌肉蛋白,如肌动蛋白和肌球蛋白结合蛋白caldesmon,后者在内皮细胞骨架重构和迁移中具有重要作用gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,并在尿酶诱导的平滑肌细胞迁移gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。有趣的是,有人提出p38 MAPK可能通过非磷酸化的HSP27促进肌动蛋白丝的封盖和缩短gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。因此,p38 MAPK与ASM功能相关,包括组织力学、细胞迁移与增殖、基因表达等gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
活化的p38 MAPK直接磷酸化并激活MK-2、MK-3和MK-5gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。我们现在证明,在p38 MAPK下游,至少MK-2可以通过选择性抑制剂MK-2调节气道对ACh的收缩反应。类似的结果已经证明了的抑制作用lipopolysaccharide-induced TNF-α生产由单核细胞gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
我们在这里已经证明了SB239063对p38 MAPK磷酸化的抑制作用,这在以前的其他研究中已经得到了证明gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。额外的研究已经证明,p38αautophosphorylategydF4y2Ba31gydF4y2Ba和transphosphorylategydF4y2Ba32gydF4y2BaSB203508,另一个p38 MAPK抑制剂,可以抑制酶活性的激活和未激活的p38α形式gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
CSs已被证明对平滑肌功能有多种影响,如h1 -组胺受体的解偶联gydF4y2Ba34gydF4y2Ba或在毒蕈碱受体表达降低gydF4y2Ba35gydF4y2Ba;此外,他们还可以通过与β干扰增加ASM放松gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素受体途径gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。在本研究中,地塞米松通过p38 mapk依赖途径抑制了野生型小鼠在基线状态和暴露于氧化应激后对乙酰胆碱的最大等轴收缩反应。我们发现,在孵育1小时内,地塞米松可上调支气管环内的MKP-1,从而可能反过来调节p38 MAPK活性。但地塞米松对mcp -1支气管平滑肌收缩无抑制作用gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba小鼠,支持的概念,即p38蛋白可以是由其中的CS可以抑制收缩反应的重要机制。这可能是由于地塞米松未能从MKP-1诱导支气管平滑肌MKP-1的表达gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。地塞米松通过促进暴露于空气和臭氧的小鼠中MKP-1的表达,可以抑制p38 MAPK的活性。我们证实地塞米松可抑制暴露于空气和臭氧的野生型小鼠中p38 MAPK的磷酸化,但不抑制暴露于空气和臭氧的MKP-1小鼠中p38 MAPK的磷酸化gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。这也可以解释为什么地塞米松不能抑制HSP27磷酸化,这是与平滑肌收缩有关。CS的电位直接作用也被证明在犬ASM细胞,在CS的增加的力的波动引起的通过p38蛋白激酶的抑制和增强的relengthening MKP-1gydF4y2Ba37gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
综上所述,SB239063和地塞米松对p38 MAPK激活的抑制可能导致ACh引起的最大ASM等长收缩的减少,而这依赖于MKP-1的表达。某些肌肉和非肌肉蛋白的p38 MAPK磷酸化可能导致最大的收缩反应。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢辉瑞制药公司(英国桑威奇)提供的MK-2抑制剂PF-3644022,以及百时美施贵宝公司(美国纽约)提供的MKP-1gydF4y2Ba-/-gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
这项研究由惠康信托基金拨款(083905)资助钟嘉辉,并由中国留学基金委奖学金资助李丰华。gydF4y2Ba
利益声明gydF4y2Ba
对这项研究感兴趣的声明可以在网站上找到gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtmlgydF4y2Ba
- 收到gydF4y2Ba2010年2月7日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2010年7月12日。gydF4y2Ba
- ©2011人队gydF4y2Ba
参考gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba