文摘
中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSPs),尤其是弹性蛋白酶,是肺癌的主要代理人毁灭在囊性纤维化(CF)的病人。本研究调查SerpinB1 NSPs的高效抑制剂,在CF肺部疾病。
支气管肺泡灌洗液(BALF) 31日与CF和24控制孩子检查以SerpinB1的分子种类和数量及其作用机理进行了研究。
CF BALF SerpinB1比控制BALF(几何平均数3.9 (95% CI 2.60 - -5.62)与1.37(1.20 - -1.55)μg·毫升−1;p < 0.001)。BALF SerpinB1水平更高的感染与未受感染的CF (5.5与2.7μg·毫升−1;p < 0.04)和elastase-positive更高与- CF (8.41与1.89μg·毫升−1;p < 0.001)。大多数SerpinB1 CF BALF被裂解。增加重组SerpinB1 CF BALF化学计量的抑制内源性弹性蛋白酶,表明CF微环境中的抑制剂的功能。在体外模拟比较SerpinB1和α1抗胰蛋白酶(SerpinA1)显示,迅速形成不可逆抑制共价复合物与弹性蛋白酶,这些不同的生存时间。SerpinB1-elastase复杂幸存下来只有短暂由于碎片的弹性蛋白酶,释放SerpinB1裂解,CF BALF的分子形式。
研究结果在CF航空SerpinB1定义一个天生的角色。
中性粒细胞和嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSPs)抗菌肺防御中起重要作用,但在蛋白酶过剩的情况下,他们作为炎症和损伤的主要代理商。NSPs、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和proteinase-3说酶进行循环中性粒细胞1。主要保护功能是杀死细菌,虽然网(中性粒细胞胞外陷阱)扮演一个角色2,杀死细菌的NSPs主要发生在细菌细胞融合与NSP-containing颗粒的时间了3。NSPs由坏死时释放中性粒细胞布满或死亡。发布可以迅速灭活NSPs蛋白酶抑制剂,这是通常的结果在等离子体,但在血管外的空间,当地条件,如抑制剂不足或过剩NSPs,可以扩展其功能在时间和空间的生活。活跃NSPs,尤其是弹性蛋白酶,经常发现在囊性纤维化(CF)呼吸道液体,即使在患者轻微疾病4,5。细胞外的行为NSPs主要病理。NSPs降低结构蛋白导致bronchiolectasis和支气管扩张6通过增加粘蛋白释放,加剧气道功能障碍7,8通过诱导促炎细胞因子、传播炎症9,减少抗菌防御裂开白细胞受体,抗体,补充蛋白质和表面活性剂10- - - - - -14。
频繁的活跃的弹性蛋白酶CF表明天然蛋白酶抑制剂集体不足作为antiprotease盾牌。尽管如此,它是我们学习相关的内源性抑制剂,可以治疗水平调节和/或重组蛋白疗法。几个NSP抑制剂研究了CF,包括SLPI(分泌白细胞弹性蛋白酶抑制剂),弹力素,特别是α1抗胰蛋白酶(α1——;SerpinA1), SLPI和α1——以及合成新型干法抑制剂,研究了作为潜在的治疗了15,16)。大部分时间都没有出现在这些列表是SerpinB1,也称为MNEI (monocyte-neutrophil弹性蛋白酶抑制剂),特别是高水平的普遍表达抑制剂发现骨髓细胞。SerpinB1 / MNEI是最有效的天然抑制剂NSPs之一17。本研究的目的是确定在CF SerpinB1 NSP监管的贡献。
材料和方法
支气管肺泡灌洗的液体
支气管肺泡灌洗液体(BALFs)得到通知书面同意和机构审查委员会(美国丹佛市儿童医院)批准的横断面研究气道炎症和感染的CF。支气管肺泡灌洗在小儿肺药(儿童医院)14,18通过灌输共有3毫升·公斤−1无菌生理盐水为老年患者婴儿和80毫升。整除BALF的利用总量和微分细胞计数,以及定量细菌和病毒文化如前所述18。其余BALF被离心澄清,立即冻结在-80°C整除。
研究SerpinB1 CF BALF(31例)和疾病控制BALF(24例)被随机的面板。疾病控制灌洗进行了临床适应症慢性咳嗽患者(n = 5),哮喘(n = 4)、间质性肺病n =(4),肺haemosiderosis (n = 2),免疫缺陷(n = 2)和慢性气喘、神经肌肉疾病、低氧血,肺炎、慢性愿望,疑似愿望和出血(n = 1为每个)。病人和临床标本中概括的信息表1。与尿素水平表明稀释因素两组相似。两个额外的BALF标本(CF-32和CF-33)抑制内源性SerpinB1弹性蛋白酶的研究;这些包含μg·15.8和34.3毫升−1分别弹性蛋白酶。
弹性蛋白酶试验
弹性蛋白酶活性量化BALF中标本的水解methoxysuccinyl (MeO-Suc) -Ala-Ala-Pro-Ala -p-nitroanilide (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),通过分光光度法在410海里18,在人类中性粒细胞弹性蛋白酶作为标准和MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-CH2Cl确认特异性。
Serpin抑制剂、蛋白酶和蛋白酶抑制化验
人类重组SerpinB1 (rSerpinB1)在昆虫细胞表达,纯化并存储在整除(2 mg·毫升−1在PBS) -80°C19。巯基乙醇(2毫米)添加之前使用。人类从脓性痰中性粒细胞弹性蛋白酶(弹性蛋白产品,Owensville,密苏里州,美国)和人类嗜中性粒细胞组织蛋白酶G从血液白细胞(美国佐治亚州雅典研究和技术,雅典)被存储为整除(1毫克·毫升−1在-20°C。α1雅典——纯化从人血浆(研究)是存储为2 mg·毫升−1在PBS整除2毫米巯基乙醇。为在体外研究弹性蛋白酶的抑制,rSerpinB1或纯化α1——是孵化与弹性蛋白酶或elastase-positive BALF在PBS 0.05% Tween-20 37°C 5分钟(或显示)。整除(30μL)化验与0.8毫米MeO-suc-Ala-Ala-Pro-Ala -弹性蛋白酶活性p-nitroanilide 1毫升20毫米三-(羟甲基)氨基甲烷(三)盐酸(pH值7.4),聚乙二醇500毫米氯化钠和0.1%。检测serpin复合物和其他产品,额外整除2毫米diisopropylfluorophosphate治疗,疗程2分钟在室温和水溶性电泳与5×dodecylsulfate钠在100°C (SDS)解决方案。
免疫印迹
BALF样品或rSerpinB1(10, 33岁或100 ng)和2×水溶性SDS溶液(2% SDS、5%甘油和1%巯基乙醇)在100°C 2分钟。样品(30μL)在Tris-Gly 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(美国Novex,圣地亚哥,CA)与Tris-HCl (pH值8.3)运行缓冲(Laemmli凝胶)20.(或与bis) - 2-hydroxyethyl -amino-Tris-HCl缓冲(pH值6.4)与2 - 10%聚丙烯酰胺(N吗啉代)-ethanesulfonic酸(pH值7.7)运行缓冲(Bis-Tris凝胶;Novex NuPAGE系统)。后者系统分离的42-kDa 38-kDa SerpinB1物种(见结果部分)。分离蛋白质转移到硝基,封锁与PBS牛奶固形物20% 0.05%渐变20 (PBS-Tween),孵化与兔子anti-SerpinB1 (anti-MNEI)抗血清21(1:50 0)0.1%的牛奶PBS-Tween 2 h, 0.3和1 hμg·毫升−1125年I-labelled山羊兔抗体免疫球蛋白g . SerpinB1乐队被测密度术使用rSerpinB1作为量化标准和用人风暴860 Phosphorimager和图像定量软件(通用电气医疗集团,小都,英国)。初步实验证实的存在内源性SerpinB1 BALF不会改变增量信号强度由于rSerpinB1标准(数据未显示)。为在体外研究纯蛋白质电泳凝胶被沾染了Coomassie蓝色和蛋白质带量化使用Bio-Rad凝胶文档系统(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。
统计评估
使用一个日志SerpinB1数据被转换10转换,提出了几何平均(95% CI)。细胞计数、白蛋白和尿素(非参数分布)进行分析的数据Mann-Whitney rank-sum测试并提出了中位数(四分位范围(差))。SerpinB1和细胞数量之间的相关性评估使用皮尔逊相关系数。0.05的α-value将确定统计学意义。分析SigmaStat V3.5(里士满Systat软件有限公司、港口、钙、美国)或SAS V9.2 (SAS研究所、凯里、数控、美国)。
结果
SerpinB1高架在CF航空公司
的特点,总结了参与者和BALF标本表1。平均年龄是9.3岁31 CF主题和8.9岁24疾病控制对象。中白细胞数量CF组比对照组高,很大程度上反映出中等嗜中性粒细胞计数高25倍。CF群、细菌性病原体分离出17 (54.8%)BALFs:八BALFs阳性铜绿假单胞菌和其他九个阳性CF病原体。BALF两个疾病控制受试者培养阳性,在这两种情况下链球菌引起的肺炎。
患者BALF SerpinB1的内容是由免疫印迹后Tris-Gly SDS电泳凝胶(Laemmli)。SerpinB1迁移42-kD乐队,这是相对于rSerpinB1量化标准(图1)。SerpinB1水平(“总SerpinB1”)升高BALF的CF患者与BALF的疾病控制(几何平均数3.9 (95% CI 2.69 - -5.62)与1.37(1.20 - -1.55)μg·毫升−1;p < 0.001)。CF群,培养阳性SerpinB1浓度较高(> 300生物·毫升−1)与culture-negative BALF(平均5.5 (3.10 - -9.84)与2.7(1.74 - -4.11)μg·毫升−1;p < 0.04),在BALF中含有活性更高的弹性蛋白酶(elastase-positive BALF)与elastase-negative BALF (8.41 (5.4 - -13.22)与1.89(1.46 - -2.44)μg·毫升−1;p < 0.001) (图1)。所有疾病控制BALF缺乏活跃的弹性蛋白酶。SerpinB1浓度没有不同铜绿假单胞菌阳性的CF BALF与CF BALF阳性其他微生物(3.38 (1.74 - -6.66)与8.95(3.39 - -23.64)μg·毫升−1;p = 0.08)。
定量的SerpinB1囊性纤维化(CF)支气管肺泡灌洗液(BALF)。SerpinB1 (42 kDa)量化了免疫印迹(Laemmli凝胶;减少条件)和微相对于重组SerpinB1标准(Std)。数据non-CF控制病人,culture-negative(文化)CF患者和培养阳性(文化+;> 300生物·毫升−1)CF患者所示。每个符号代表的意思是一式三份化验个别病人。NE -:中性粒细胞elastase-negative标本;东北+:中性粒细胞elastaste-positive标本。研究结果发布在抽象的形式的一个子集22。#:文化+ non-CF控制病人。
SerpinB1浓度将积极与BALF中中性粒细胞计数(r = 0.80;p < 0.001;图2一个)。图2还显示,正如预期的那样,自由弹性蛋白酶(图2 b)和α1-AT-elastase (图2 c)积极与中性粒细胞计数相关(r = 0.73 (p < 0.001), r = 0.76 (p < 0.001),分别)。SerpinB1水平相关的积极自由弹性蛋白酶(r = 0.70;p < 0.001)和α1-AT-elastase复杂(r = 0.82;p < 0.001;数据未显示)。没有相关检测与巨噬细胞SerpinB1号码(r = 0.03;p = 0.82)。
支气管肺泡灌洗液浓度的相关性)SerpinB1αb)活跃的弹性蛋白酶和c)1抗胰蛋白酶(α1——)与中性粒细胞弹性蛋白酶复杂。——:检测下限。
分子形式的SerpinB1 CF BALF
Laemmli SDS电泳凝胶图1提供定量,但相反的预测20.没有区分活跃的和不活跃的SerpinB1。检查这些不同分子形式,我们使用另一个SDS电泳系统。当与纯SerpinB1标准测试,Bis-Tris凝胶(图3,下半部分)分离三个主要种类:活跃SerpinB1 42 kDa, 66 kDa共价SerpinB1-elastase复杂,SerpinB1抑制弹性蛋白酶的主要产品,裂解post-complex SerpinB1 38 kDa。基于早期的测序结果17,38-kDa乐队代表SerpinB1 Cys344裂解后,specificity-determining残留的反应中心循环(称为“P1”命名Schechter和伯杰23)。一个中间物种代表部分退化的复杂也被检测到。
分子形式的SerpinB1囊性纤维化(CF)支气管肺泡灌洗液(BALF)。)比较Tris-Gly (Laemmli;顶部)和双/三羟甲基氨基甲烷SDS凝胶液(底部)。标准SerpinB1物种生成的反应rSerpinB1增加弹性蛋白酶。(分子形式分离bis) - 2-hydroxyethyl -amino-Tris (Bis-Tris)凝胶42-kDa活跃SerpinB1(底部,左车道),66 kda SerpinB1-protease复杂,部分退化的复杂(#)和38-kDa SerpinB1分开。b) Bis-Tris患者BALF的免疫印迹。在顶部面板中,车道1 - 9包含编码的CF患者BALF标本。除了elastase-positive标本6和7。巷10包含单一疾病控制标本分析(11)SerpinB1被这种方法。Std:标准的混合物。主要的物种在CF BALF 38-kDa裂解与变量少量的66 kda SerpinB1复杂。降解产物是在BALFs看到2、3和9。底部面板显示了重复分析来验证尺寸(38 kDa)在CF患者BALF的物种。组重组SerpinB1 (Std)、性病和CF BALF和CF BALF样本单独进行分析。 Lanes 2 and 3 contain a pool of four CF samples (two elastase-positive and two –negative sample), lanes 5 and 6 contain the CF BALF run in lane 4 of the top panel), lanes 8 and 9 contain an elastase-positive CF BALF, and lanes 11 and 12 contain the CF BALF sample run in lane 8 of the top panel.
识别分子物种在CF患者中,剩余的CF BALF Bis-Tris凝胶样品进行评估。这一分析显示38-kDa裂解SerpinB1作为主要的分子形式在16 17 CF标本分析(有一个标本是空白的;图3 b)。根据标本,发现小金额的66 kda SerpinB1-elastase复杂;活跃42-kDa SerpinB1本质上是无法探测(图3 b)。的单一疾病控制标本SerpinB1被这种方法(巷10)包含42,38-kDa SerpinB1分别活跃的和不活跃的。
缺乏活性抑制剂CF BALF和的存在38-kDa proteolytically裂解物种表明,高浓度的SerpinB1总额不足或几乎足以抑制NSPs病人气道的高水平。这一发现是一致的存在活跃的弹性蛋白酶的标本。66 kda的缺乏SerpinB1-elastase复杂的令人惊讶,因为古典serpin蛋白酶抑制机制24预测SerpinB1-elastase复杂,α1-AT-elastase复杂,将会是一个容易可检测产品。
rSerpinB1抑制内源性CF BALF中弹性蛋白酶
由于内源性SerpinB1 CF BALF是不活跃的,我们下一个质疑体内SerpinB1将功能添加。纯中性粒细胞弹性蛋白酶与匹配CF BALF活动检查标准(图4)。内源性弹性蛋白酶在每两个CF BALFs完全抑制rSerpinB1 (图4 b和c)。所需的rSerpinB1抑制50%的预测化学计量值,和完全抑制抑制所需不同,纯粹的蛋白酶。这些发现表明,SerpinB1有效抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的CF BALF的组成部分。
重组SerpinB1 (rSerpinB1)抑制内源性弹性蛋白酶在囊性纤维化(CF)支气管肺泡灌洗液(BALF)。)中性粒细胞弹性蛋白酶或elastase-positive BALF b) CF-32或c) CF-33(所有包含500 ng的弹性蛋白酶活动),被允许与不同数量的反应rSerpinB1 50-μL反应5分钟,和剩余弹性蛋白酶活动是化验。结果是重复化验的平均值。CF-32和CF-33 BALF包含μg·15.8和34.3毫升−1分别活跃弹性蛋白酶。
SerpinB1的作用机制
解释的缺乏在CF BALF SerpinB1-elastase复杂,我们模仿在活的有机体内情况与不同数量的弹性蛋白酶反应SerpinB1≤18 h。以前的研究证实SerpinB1抑制弹性蛋白酶极为迅速,与一个协会速率常数> 107米−1·年代−1因此,抑制浓度研究在几分钟内完成17。相比之下,我们研究了α的同样的快速反应1——与弹性蛋白酶(SerpinA1)。一个固定数量的抑制剂结合越来越摩尔比率的弹性蛋白酶,包括多余的弹性蛋白酶(蛋白酶抑制剂比1.25)来模拟条件的CF气道。正如预期的那样,最大数量的各自的共价复合物最早观察时间点为α(5分钟)1——(图5,前面板)和SerpinB1 (图5,下半部分)。这些复合物的产生反映了古典serpin机制:蛋白水解作用,弹性蛋白酶在暴露serpin P1残渣(Met358α1——在SerpinB1 Cys344),导致1)解理在P1键2)生成的酯键从P1到弹性蛋白酶活性部位丝氨酸和3)大规模构象serpin重排,反应的驱动力。弹性蛋白酶,共价结合serpin裂解,灭活是由于构象活性部位的变形25。进一步孵化,α1-AT-elastase复杂仍基本完整的30分钟、3 h,对弹性蛋白酶比率越低,即使在18 h。相比之下,SerpinB1-elastase复杂是短暂的,是部分(30分钟)或完全(3 h)退化,同时与一代38-kDa SerpinB1在两个更高的弹性蛋白酶比率和完全失去了18 h,即使在低弹性蛋白酶。弹性蛋白酶活动期间内没有改变任何serpin 5 min-18 h:蛋白酶组合(数据未显示),这表明抑制是不可逆转的即。活跃的弹性蛋白酶不释放复杂的在这种情况下),α与先前的研究一致1——25。微量化α1——和SerpinB1复合物反应弹性蛋白酶过剩还表明,SerpinB1-elastase复杂是短暂的(图5 b)。因此,预期的(主要)积累了产品的弹性蛋白酶抑制SerpinB1是38-kDa裂解形式。
α的)反应1抗胰蛋白酶(α1——)随着时间的推移和SerpinB1弹性蛋白酶和稳定的共价复合物。α1——或SerpinB1(1.3μM)被允许与不同摩尔比的反应弹性蛋白酶(由蛋白酶表示:抑制剂(P / I)比率从阈下多余的弹性蛋白酶。反应停止后5分钟,30分钟,3 h或18 h,产品分析Coomassie中Bis-Tris凝胶。α1——(前面板,左车道)迁移52 kDa及其复杂(cpx)在76 kDa弹性蛋白酶;纯SerpinB1(底部面板,左车道)迁移在42 kDa及其与弹性蛋白酶cpx 66 kDa。αb)定量1-AT-elastase和剩余SerpinB1-elastase复合物的反应过度弹性蛋白酶(P / I 1.25)。5分钟的值被认为是100%。数据意味着±扫描电镜三个实验。
讨论
研究的一个重要发现是,总SerpinB1浓度升高BALF CF的主题与疾病控制。在CF组,SerpinB1水平更高的感染与未受感染的受试者,elastase-positive更高与消极的主题。SerpinB1浓度相关的积极和中性粒细胞计数,自由弹性蛋白酶和α1-AT-elastase水平。由于中性粒细胞计数和自由弹性蛋白酶的建立生物标志物CF肺部炎症的研究结果表明,SerpinB1可以作为生物标志物在CF的炎症。
的主要分子形式SerpinB1 BALF的CF患者38-kDa SerpinB1,发现在以往的研究SerpinB1裂解活性中心的循环。虽然其他场景,包括直接由一个不同的蛋白质水解蛋白酶,不能消除,一个简单的解释是,38-kDa物种在CF BALF post-complex SerpinB1,主要的产物在体外抑制弹性蛋白酶和扩展过剩的条件下反应时间,条件,适用于CF肺。缺乏活跃的(42-kDa) SerpinB1 CF BALF的释放是一致的高水平的弹性蛋白酶在病人呼吸道,作为记录的自由弹性蛋白酶在CF标本的一半。进一步发现elastase-negative CF BALF包含38-kDa SerpinB1(尽管这不是证明)表明,过量的弹性蛋白酶在病人的肺部已经发布并成功通过SerpinB1抑制。α的存在1-AT-elastase复杂elastase-negative BALF也表明,过量的弹性蛋白酶已经发布并成功地抑制。
自由弹性蛋白酶是当前的一项指标在CF肺部炎症,治疗的目标。它最近被认定为最好的炎症相关诱导痰的肺功能26。这一发现并不令人意外,因为过多的弹性蛋白酶的有害行为:矩阵的破坏,炎性细胞因子的诱导,消炎抗菌蛋白的降解。此外,这一概念是最近先进,在气道炎症蛋白酶,中性粒细胞弹性蛋白酶占据了一个位置的顶点监管层次结构,弹性蛋白酶抑制剂的评估能力减少巨噬细胞的诱导metalloprotease-2和半胱氨酰蛋白酶组织蛋白酶B27。抑制弹性蛋白酶的研究表明,治疗可能废除超过自己的有害蛋白水解的影响。
内源性弹性蛋白酶在CF BALF被rSerpinB1化学计量的抑制,表明CF气道微环境的抑制功能。一个警告,BALF相对于呼吸道标本稀释液体。然而,rSerpinB1浓度仅略高于化学计量完全抑制内源性弹性蛋白酶在CF痰溶胶,只有最低限度稀释相对于痰21。完全的能力(附近)化学计量量抑制内源性弹性蛋白酶表明SerpinB1不是阻止其弹性蛋白酶抑制功能的组件CF气道。
交付的功能能力和有效性rSerpinB1也已被证明在模型大鼠的肺损伤和感染21,28。同时,在老鼠中,删除serpinB1减少,和交付rSerpinB1获救,抗菌和抗炎肺保护29日。
CF气道的高水平的SerpinB1流体介绍几个问题。首先,它是不清楚SerpinB1起源的地方。表达的基因广泛,水平最高的髓细胞,尤其是中性粒细胞30.造成这一状况,所以可能坏死中性粒细胞。缺少一个领袖SerpinB1,像所有支系b serpins序列31日,32,因此可能产生的积极可行的中性粒细胞,单核细胞、气道上皮细胞。表达的增加炎症的存在表明了核factor-κB监管元素在人类基因的启动子33。
最基本的发现本研究证明SerpinB1 anti-elastase盾是一个天然因素的正常和CF肺部,因此,加入之前特征抑制剂,如SLPI、弹力素、α1——。尽管SLPI和α1——存在于正常浓度在CF BALF中,大多数的α1——和SLPI不活跃的分子形式,复杂或退化5,符合自由弹性蛋白酶在CF的增加。在这里SerpinB1报道CF BALF的浓度的方法报道α1——。
SerpinB1和SerpinA1(α1——),这两个serpin弹性蛋白酶抑制剂在肺,分享几个特性。快速抑制每个NSPs(弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和proteinase-3;总结在17),但尽管如此共享能力,总科中的两个serpins远亲,及其活性中心序列是不同的,表明他们代表独立的趋同进化历程。有趣的是,SerpinB1和α1——易受氧化失活,这表明时间和/或空间限制为肺NSP抑制剂可能是必要的。的机制是不同的。α1——受氧化失活反应中心的蛋氨酸,过氧化氢和氧化酵素产生的炎症性中性粒细胞。SerpinB1,由于其反应中心半胱氨酸,可以可逆地灭活二聚在一个环境缺乏自由巯基(未发表的观察)。然而,SerpinB1,与α1——,由过氧化氢是高度抗失活(s . Van Patten Genzyme Corp .)、剑桥,妈,美国;个人沟通)。
总的来说,这些结果描述的内在作用SerpinB1 CF气道和潜在的治疗涉及SerpinB1提供基线信息。
确认
我们感谢p·艾美特和i .奥斯伯格(丹佛,儿童医院有限公司,美国),f·卢比奥和k Ronaszeki(美国免疫疾病研究所,波士顿,MA)寻求帮助与样本和数据收集。我们感谢c Benarafa(西奥多·Kocher研究所,伯尔尼,瑞士)深刻讨论的数据。
脚注
支持声明
这项研究是由美国国立卫生研究院的支持(赠款HL066548、HL41579 HL081335和RR0069)和囊性纤维化基金会。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年5月10日。
- 接受2010年8月11日。
- ©2011人队