文摘
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一个侵略性的肿瘤与有限的常规治疗的反应。本研究的目的是评估一个DNA甲基转移酶抑制剂的抗癌效果,5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR),和两个蛋白脱乙酰基酶抑制物,丙戊酸(VPA)和suberoylanilide异羟肟酸(萨哈)。
人类间皮瘤细胞与每个表观遗传治疗药物,单独或组合。细胞毒性影响治疗细胞和特定的肿瘤抗原的表达。对细胞的识别一个特定的CD8 + t细胞克隆也是衡量。此外,联合治疗的效果进行了测试在一个小鼠模型的间皮瘤。
我们表明,VPA和萨哈把5-azaCdR杀死MPM细胞和诱导肿瘤抗原表达在剩下的活的肿瘤细胞。因此,肿瘤细胞表达这些抗原被认可和细胞溶解由特定CD8 +细胞毒性t细胞。在活的有机体内5-azaCdR / VPA治疗抑制肿瘤生长,促进淋巴细胞浸润和免疫反应对肿瘤细胞。
适当的表观遗传药物组合,除了会导致间皮瘤细胞死亡,也会影响这些细胞的免疫原性地位。这个属性可以被利用在临床调查开发MPM治疗结合化疗和免疫治疗方法。
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一个激进的胸膜肿瘤通常是与慢性接触石棉(1]。在世界范围内,MPM的发病率正在增加,预计将在2020年达到顶峰2]。MPM的治疗包括化疗、放疗和手术,但有限的有效性,需要发展新的治疗策略。大量的临床前和临床研究证明,hypomethylating药物,如5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR;decitabine),组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂,如丙戊酸(VPA;depakine)和suberoylanilide异羟肟酸(萨哈;vorinostat),具有强力的抗癌活性和有前途的治疗潜力3- - - - - -11]。
DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂decitabine允许沉默基因的表达通过脱甲基CpG岛。这种药物最近显示出临床疗效治疗造血的恶性肿瘤(12]。HDAC抑制剂的使用旨在阻止染色质压实由于组蛋白脱乙酰作用,从而提高基因表达(13]。HDAC抑制剂、depakine和vorinostat目前正在评估,单独和组合,作为MPM的细胞毒性药物治疗(8,9,14]。在这些临床研究MPM,和许多其他癌症类型,decitabine和HDAC抑制剂被评估的能力延缓肿瘤进展通过诱导细胞周期阻滞,分化和/或凋亡。
此外,这些药物也可能影响免疫应答。自发的回归已经观察到在间皮瘤患者肿瘤特异淋巴细胞浸润[15),免疫疗法的治疗策略应考虑MPM (16]。然而,MPM的候选抗原,可以针对性差的定义。一种绕过MPM缺乏识别抗原是促使肿瘤细胞表达肿瘤相关抗原(taa)。目的是支持TAA表达式,它已经表明,hypomethylating药物和/或HDAC抑制剂,除了恢复正常的表观遗传状态在肿瘤细胞,也能导致肿瘤抗原表达(17- - - - - -21]。
我们调查的目的是为了演示的表观遗传药物的综合效应,DNMT HDAC抑制剂、细胞毒性和新的表达taa,激活细胞毒性t细胞反应。因此,我们调查5-azaCdR的毒性,VPA和萨哈,独自在顺序组合,对人类MPM细胞系。这些药物的影响在一些癌症睾丸抗原的表达(cta)(如NY-ESO-1(纽约食道癌)和MAGE-A1 A3(与黑素瘤相关抗原)),增加的利息作为免疫治疗目标,也分析,以及识别处理细胞的细胞毒性t细胞。我们的研究表明,VPA和萨哈触发MPM细胞死亡,并把5-azaCdR诱导NY-ESO-1表达式在剩下的活细胞,溶解由NY-ESO-1-specific成为敏感细胞毒性t细胞。此外,使用间皮瘤的小鼠模型,我们报告在活的有机体内肿瘤回归与顺序5-azaCdR和VPA治疗后淋巴细胞浸润。这些包含CD8a +浸润淋巴细胞能够分泌干扰素(IFN) -γ针对肿瘤细胞。
材料和方法
细胞培养
人类上皮样的间皮瘤细胞系建立了从胸腔积液在我们实验室22]。联合国提供的人类黑色素瘤细胞系M117 Labarriere (INSERM, U892、南特、法国)。在rpmi - 1640细胞培养介质补充heat-inactivated 10%胎牛血清,2毫米l谷氨酰胺,100 IU·毫升−1青霉素和0.1 mg·毫升−1链霉素(完全培养基)。人类从正常胸膜间皮的细胞分离酶解集,在完全培养基培养的补充和氢化可的松(0.4μg·毫升−1ng)、表皮生长因子(10毫升−10.5)、胰岛素(μg·毫升−1)和非必需的氨基酸。5 azacdr VPA和细胞培养试剂购自Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier,法国)。萨哈是由p·伯特兰(CNRS UMR 6514年,普瓦捷大学普瓦捷,法国)。药物治疗后,细胞生存能力评估TO-PRO-3碘标记(- pontoise表达载体,法国)和流式细胞术分析。
人类白细胞抗原(HLA) - * 0201 -限制,NY-ESO-1(157 - 165)特殊CD8 + t细胞克隆M117.32H得到tumour-infiltrating淋巴细胞的黑色素瘤患者117和培养被Fonteneauet al。(23]。
RNA提取和实时rt - pcr
总RNA提取与RNeasy迷你包(试剂盒、Courtaboeuf、法国)根据制造商的协议。1μg总RNA reverse-transcribed使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(表达载体)。PCR反应进行了使用10×QuantiTect底漆化验(试剂盒)和RT2实时SYBR-Green /火箭PCR反应混合液(Tebu-bio、Le-Perray-en-Yvelines、法国),根据制造商的指示。
激活抗原* 0201 -限制NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞
肿瘤细胞被NY-ESO-1-specific培养CD8 + t细胞在完全培养基含有10μg·毫升−1brefeldin (Sigma-Aldrich) 5 h在37°C和清洗。细胞被沾allophycocyanin-conjugated鼠标反CD8和藻红蛋白(PE)共轭鼠标反IFN-γ单克隆抗体(BD生物科学,Le Pont de Claix法国)使用方法所描述的年代igalottiet al。(19]。CD8和IFN-γ表达被流式细胞术分析。
细胞毒性试验
肿瘤细胞与Na孵化251阴极射线示波器4(PerkinElmer Courtaboeuf、法国)1 h在37°C和脉冲或不是10μM NY-ESO-1(157 - 165)在4°C肽1 h。细胞随后于培养* 0201 -限制NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞4 h在37°C,一式三份。每个上层清液收集并添加到闪烁液体鸡尾酒(OptiPhase Supermix;PerkinElmer)在液体闪烁计数。特定的细胞溶解的百分比计算100×(实验释放——自发释放)/(最大释放——自发释放)。自发释放51Cr决心从目标t细胞单独培养。的最大释放51Cr是获得目标t细胞细胞溶解介质中含1% Triton x - 100。
动物实验
这里的实验报告进行了符合欧盟的指导方针的动物保健和使用研究协议。5×106每只老鼠(AK7鼠间皮瘤细胞24腹腔内服用]以C57BL / 6小鼠四组(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle法国)(0)。第1组不接受任何进一步的治疗。组2和4有三个连续的i.p。注射5-azaCdR(4毫克公斤−17)天,9和14。VPA(5毫米)添加到饮用水的老鼠在组3和4天10到20天。所有的动物都在22天尸体剖检。
组织病理学和免疫组织化学
肿瘤和组织固定在4%甲醛在PBS,嵌入在石蜡,切成和彩色haematoxylin-eosin-saffron 5-μm部分。
免疫组织化学进行肿瘤切片(石蜡包埋)使用标准的技术。主要的抗体,anti-Foxp3 (Abcam,巴黎,法国),使用稀释的1/100。N-Histofine简单鼠标马克斯过氧化物酶染色(Nichirei生物科学、东京、日本)作为检测试剂。
有关酶联免疫斑点试验IFN-γ
脾脏以及AK7肿瘤,汇集了每组的老鼠(控制和5-azaCdR / VPA),分离使用gentleMACS分离器(Miltenyi生物技术,法国巴黎),根据制造商的优化协议。细胞悬浊液是70 -μm过滤、无菌,红血球细胞溶解与BD制药溶解(BD生物科学)的解决方案。活细胞与anti-CD8a标签(Ly-2)微(Miltenyi生物技术)。CD8a +细胞被积极使用mac列排序和mac分离器(Miltenyi生物技术)。CD8a +脾细胞(5×105每口井的细胞)和CD8a + tumour-infiltrating淋巴细胞(1×105每)在完全培养基培养细胞补充50μM 2-mercaptoethanol(默克,诺丁汉,英国)37°C的有关酶联免疫斑点板96 - 36 h。刺激细胞AK7细胞(5×104细胞每口井),预处理的0.5μM 5-azaCdR (72 h)和5毫米VPA有关酶联免疫斑点试验(48小时)。根据制造商的说明进行了一式三份(BD生物科学)。有关酶联免疫斑点板斑点数自动使用一个读者(Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg,德国)。
统计分析
统计显著性计算使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。组间比较了使用Mann-Whitney紫外线测试或克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析邓恩的测试后(多重比较)紧随其后。小动物——一张长有p值< 0.05被认为是重要的。
结果
5-azaCdR有毒和增殖的影响,VPA和萨哈MPM细胞
致癌基因异常和表观遗传修饰的组合结果导致失调的基因参与细胞周期控制和细胞凋亡。修改染色质取决于酶的活动,如组蛋白乙酰转移酶(帽子),hdac DNMTs,被认为是良好的癌症治疗的目标。因此,我们首先研究了HDAC抑制剂的毒性VPA和萨哈和hypomethylating药物5-azaCdR MPM肿瘤细胞,使用TO-PRO-3碘染色和流式细胞术。这些药物是用于浓度已知兼容他们的生物活性。48小时后,VPA或萨哈MPM引起肿瘤细胞死亡中抑制浓度(IC50)分别为10毫米,10μM (图1)。这种有毒效应与MPM细胞凋亡增加,所表示的膜联蛋白V染色(数据未显示)。相反,5-azaCdR没有毒性和对MPM细胞增殖没有明显的影响。
影响5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR),丙戊酸(VPA)和suberoylanilide异羟肟酸(萨哈)恶性胸膜间皮瘤(MPM)肿瘤细胞生存和增殖。MPM细胞系服用不同剂量的5-azaCdR, b) VPA或c)萨哈48 h。细胞数量是衡量计数活细胞的治疗。细胞生存能力是衡量TO-PRO-3合并和流式细胞术。数据意味着±扫描电镜的四个细胞系进行测试。
5-azaCdR的影响,VPA和萨哈TAA表达式
MPM显示多个表观遗传异常导致肿瘤抑制基因的沉默25]。这样的观察表明,MPM可能是一个很好的目标表观遗传药物,将有利于表达的新肿瘤相关基因。因此,我们研究了5-azaCdR的影响,VPA和萨哈的表达三个taa (NY-ESO-1 MAGE-A1和MAGE-A3)。使用定量rt - pcr (RT-qPCR),我们表明,NY-ESO-1 mRNA无法在所有未经处理的MPM细胞系,MAGE-A1和a3 mRNA也探测不到一半的细胞系进行测试。治疗后,5-azaCdR诱导或调节三种抗原的表达进行剂量依赖性的方式(图2)。浓度为0.5μM 5-azaCdR足以达到最佳感应水平。相比之下,VPA或独自萨哈TAA的mRNA表达测试没有影响(数据没有显示)。
对癌症的影响5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR)睾丸抗原表达。恶性胸膜间皮瘤细胞系(n = 4)服用不同剂量的5-azaCdR 48 h。Suberoylanilide异羟肟酸和丙戊酸没有影响(数据没有显示)。一)纽约- - - - - -ESO- - - - - -1,b)法师- - - - - -A1和c)法师- - - - - -A3通过实时rt - pcr基因表达测定。对于每一个基因,结果正常化内生参考基因,RPLP0(×1000)。数据意味着±扫描电镜的四个细胞系进行测试。统计显著性计算利用克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析邓恩的测试后紧随其后。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
VPA和萨哈增强taa的表达与5-azaCdR MPM肿瘤细胞预处理
许多研究评价综合治疗的癌症细胞的影响hypomethylating代理(尤其是5-azaCdR)和HDAC抑制剂(26,27]。由于这些药物类型影响两种合作表观遗传机制,我们试图确定最好的药物组合安排。因此,为了提高治疗效率,我们首先评估VPA治疗5-azaCdR之前或之后是否会更有效率。两种不同的治疗计划5-azaCdR和VPA测试。MPM细胞系处理0.5μM 5-azaCdR其次是5毫米VPA、或5毫米VPA其次是0.5μM 5-azaCdR (图3)。RT-qPCR NY-ESO-1 mRNA表达分析显示感应后这两个序贯治疗。然而,5-azaCdR / VPA治疗与VPA / 5-azaCdR相比,与更高NY-ESO-1 mRNA表达水平在所有MPM细胞系进行测试。最优调度顺序5-azaCdR / VPA治疗研究(图3 b)。的最佳诱变NY-ESO-1表达观察序贯治疗后0.5μM 5-azaCdR(48小时)/ 5毫米VPA(48小时)和0.5μM 5-azaCdR (72 h) / 5毫米VPA(48小时)。
影响不同的时间表5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR)和丙戊酸(VPA)管理纽约- - - - - -ESO- - - - - -1表达恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞和间皮的正常细胞(nmc)。一)纽约- - - - - -ESO- - - - - -1表达式是由定量rt - pcr (RT-qPCR)评估在不同的MPM细胞系(n = 5)治疗顺序为0.5μM 5-azaCdR 48 h和5毫米VPA 24 h (5-azaCdR / VPA),或与5毫米VPA 24 h和0.5μM 5-azaCdR未来48 h (VPA / 5-azaCdR)。b) NY-ESO-1表达式被RT-qPCR评估在两个MPM细胞系处理0.5μM 5-azaCdR VPA和5毫米,单独或结合在一起,不同的时间安排。c) nmc初等文化(n = 2)治疗顺序为0.5μM 5-azaCdR 72 h和5毫米VPA 48 h。纽约- - - - - -ESO- - - - - -1表达在nmc获得5 MPM细胞系相比,和黑素瘤细胞系M117作为积极的控制。纽约- - - - - -ESO- - - - - -1表达式是正常化内生参考基因,RPLP0(×1000)。数据意味着±扫描电镜。统计显著性计算)利用克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析之后,邓恩的测试后或c) Mann-Whitney紫外线测试。ND:不确定。* *:p < 0.01。
基因的表观遗传修饰异常,染色质变更导致致癌作用的特征。因此,表观遗传药物抑制剂应该对正常细胞没有影响。最有效的组合的影响,5-azaCdR / VPA NY-ESO-1表达在正常间皮的细胞(nmc)进行评估。NMC主要文化得到从胸膜活检的患者接受心脏手术。NMC文化是积极的正常间皮标记calretinin cytokeratins-5和6(数据未显示)。NY-ESO-1 mRNA在nmc发现,治疗前后5-azaCdR / VPA (图3 c)。相反,NY-ESO-1在MPM-treated诱导细胞,但比观察到一个较低的水平M117黑色素瘤细胞系。类似的结果MAGE-A1和a3(数据没有显示)。
在另一组实验中,我们比较的影响组合5-azaCdR / VPA和5-azaCdR /萨哈TAA表达和细胞增殖。MPM细胞治疗0.5μM 5-azaCdR和VPA 5毫米或2.5μM萨哈(图4)。没有治疗后观察5-azaCdR对细胞增殖的影响。相反,结合5-azaCdR VPA或萨哈(使用剂量低于IC50)细胞增殖抑制了50% (40% HDAC抑制剂单独使用时)。然而,如前所述,HDAC抑制剂,没有完整的毒性和联合治疗观察。此外,5-azaCdR / VPA治疗与TAA mRNA水平高于治疗5-azaCdR单独或5-azaCdR /萨哈的组合。因此,我们专注于组合5-azaCdR / VPA对后续实验。
影响组合5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR) /丙戊酸(VPA)和5-azaCdR / suberoylanilide异羟肟酸(萨哈)细胞增殖和癌症睾丸抗原表达。恶性胸膜间皮瘤细胞系治疗顺序为0.5μM 5-azaCdR 72 h和5毫米VPA或2.5μM萨哈48 h . a)活细胞的数量测量结束时治疗。每个曲线代表均值±扫描电镜增长的六个细胞系进行测试。b)纽约- - - - - -ESO- - - - - -1c)MAGE-A1和d)MAGE-A3通过实时rt - pcr基因表达测定。对于每一个基因,结果正常化内生参考基因,RPLP0(×1000)。数据意味着±扫描电镜。使用)双向方差分析统计显著性计算,或罪犯)克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析邓恩的测试后紧随其后。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
抗原* 0201 -限制NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞回复所有抗原* 0201 + 5-azaCdR / VPA-treated MPM细胞系
NY-ESO-1 T-cell-based免疫疗法(被认为是一个非常有价值的目标28]。因此,我们评估是否NY-ESO-1表达式中观察到5-azaCdR / VPA-treated抗原* 0201 + MPM细胞能够促进他们认可的NY-ESO-1(157 - 165) /抗原* 0201 -特定的CD8 + t细胞克隆。M117.32H这t细胞克隆,获得了来自limiting-dilution文化tumour-infiltrating淋巴细胞的黑色素瘤病人和认可自体肿瘤细胞系M117 (n . Labarriere;个人沟通)。此外,这个克隆展出100%染色PE-conjugated NY-ESO-1(157 - 165) /抗原与抗原* 0201 * 0201,没有染色四聚物含有一个无关紧要的肽(数据未显示)。
在第一组实验中,IFN-γ生产的CD8 + t细胞克隆,在回应一个MPM细胞系治疗,不信,5-azaCdR / VPA测试(图5)。治疗和治疗肿瘤细胞被洗,然后培养NY-ESO-1-specific t细胞克隆。没有观察t细胞克隆的反应与肿瘤细胞没有5-azaCdR / VPA治疗。IFN-γ生产的克隆是由胞浆内染色观察只针对5-azaCdR / VPA-treated细胞。在一些情况下,IFN-γ与VPA添加到培养基中,为了增加HLA类的表达我在MPM细胞表面的分子(数据未显示),因此,他们的CD8 + t细胞识别。正如预期的那样,稍微更好的观察活化的克隆(如。≤32.3%的细胞与26.2% MPM细胞系meso96)肿瘤细胞与外生IFN-γ预处理。
承认5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR) /丙戊酸(VPA)治疗,人类白细胞抗原(HLA) - * 0201 +恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞系抗原* 0201 / NY-ESO-1(157 - 165)特殊CD8 + t细胞克隆。)干扰素(IFN) -γNY-ESO-1-specific生产的CD8 + t细胞克隆在回应meso96治疗与否与0.5μM 5-azaCdR 72 h和5毫米VPA 48 h有或没有500 IU·毫升−1IFN-γ48 h。IFN-γ生产以胞浆内染色CD8 IFN-γ和表面染色,紧随其后的是流式细胞术分析。b) IFN-γNY-ESO-1-specific生产的CD8 + t细胞克隆的自体黑素瘤细胞系(M117)于* 0201 - MPM细胞系(meso13)和三个抗原* 0201 + MPM细胞系(meso34 meso96和meso122)治疗或不与0.5μM 5-azaCdR (72 h) / 5毫米VPA(48小时),有或没有IFN-γ(48小时)和阻塞anti-HLA-A * 0201单克隆抗体。c)的细胞毒性活动NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞克隆的自体黑素瘤细胞系(M117)和一个抗原* 0201 + MPM细胞系(meso96)治疗或没有(控制)与0.5μM 5-azaCdR (72 h) / 5毫米VPA(48小时)和脉冲或不是10μM NY-ESO-1(157 - 165)肽。效应(抗原* 0201 -限制,NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞)的目标(肿瘤细胞)比例的5/1,10/1和20/1。细胞毒性活性测定51Cr释放。为每个数据点的实验进行了一式三份。APC: allophycocyanin;体育:藻红蛋白。
克隆的激活水平以应对5-azaCdR / VPA-treated MPM细胞系和识别的水平控制自体M117黑色素瘤细胞系相比。所有5-azaCdR / VPA-treated hla a2 + MPM细胞系被克隆,但水平低于承认M117水平(图5 b)。控制,也证明了抗原* 0201 - MPM细胞株并不认可,因为它没有表达NY-ESO-1(157 - 165)呈现抗原* 0201分子。有趣的是,所有治疗t细胞反应IFN-γ生产抗原* 0201 +细胞系证实5-azaCdR / VPA-treated细胞系表达足够NY-ESO-1蛋白质高效流程和现在肽表面并诱导他们认可的NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞克隆。最后,所有的克隆反应部分抑制(意味着±扫描电镜56.6±7.7%)的存在阻塞anti-HLA-A * 0201马伯(克隆BB7.2) t细胞克隆/ MPM细胞株培养。
此外,我们测试是否应对0.5 t细胞IFN-γ生产μM 5-azaCdR (72 h) / 5毫米VPA(48小时)治疗肿瘤细胞抗原* 0201 + MPM伴随着NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞的肿瘤细胞裂解。在未经处理的MPM细胞,细胞毒性无法评估51Cr版本(图5度)。正如所料,MPM细胞细胞溶解预处理时10μM NY-ESO-1(157 - 165)肽或当他们与5-azaCdR / VPA治疗。总的来说,克隆的细胞毒性与IFN-γ生产相关活动,表明5-azaCdR / MPM VPA治疗肿瘤细胞诱导足够NY-ESO-1表达导致实质性的识别和裂解肿瘤细胞的NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞。
VPA协同5-azaCdR,抑制肿瘤生长在小鼠模型的间皮瘤
为了评估在活的有机体内5-azaCdR和VPA效率,我们使用C57BL / 6小鼠与AK7细胞的道。在试验研究中,我们发现这些细胞,类似于人类MPM细胞,表达taa相当于人类cta,如肿瘤排斥抗原P1A, 5-azaCdR / VPA治疗(数据未显示)。此外,我们还发现i.p。注入5×106AK7细胞代表最好的致瘤的剂量。5-azaCdR进度管理是基于所描述的Guoet al。(29日),他发现i.p。注射5-azaCdR(1毫克公斤−1体重)连续5天每天两次与轻微的毒性和P1A的感应。在我们的实验中,小鼠注射了只有三个5-azaCdR,但高剂量(4毫克公斤−1),没有明显增加毒性。符合我们在体外发现,VPA(5毫米)交付给老鼠5-azaCdR前两个注射后。老鼠体重每天,没有指出两组之间的差异。完成治疗后,小鼠的治疗和治疗组被杀,收集和肿瘤组织。所有的结果总结表1为每个组和代表的插图所示图6。老鼠从组1(控制;n = 10),入侵了网膜AK7细胞,并构成了一个困难,white-coloured组织很容易孤立从棕色/黄色软胰腺组织。肿瘤治疗的动物之间的质量差异很大(意味着±扫描电镜261.7±43.5毫克),淋巴细胞的存在是罕见的。在动物组2 (n = 6),只有5-azaCdR,肿瘤质量略减少(199.2±32.5毫克)和一些地区显示积累non-organised淋巴细胞。单独使用VPA(集团3;n = 6),肿瘤质量更减少(135±18.7毫克)和淋巴细胞的重要焦点观察(包含几个调控t细胞与Foxp3标签)。最后,老鼠接受联合5-azaCdR / VPA (n = 6)显示,肿瘤最显著减少质量(99.8±22.1毫克;p < 0.05),大量淋巴细胞的聚集。然而,第三组相比,肿瘤细胞被排除在淋巴细胞疫源地,含有罕见Foxp3 +细胞局部边缘。
AK7肿瘤植入老鼠的组织病理学检查。5×106AK7鼠间皮瘤细胞腹腔内注入C57BL / 6小鼠。老鼠从一个)第1组(n = 10)没有治疗。老鼠从b组)2 (n = 6)和d, f) 4 (n = 6)收到三个注射5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR)(4毫克公斤−1)。丙戊酸(VPA)(5毫米)添加到饮用水的小鼠组c, e) 3 (n = 6)和d, f) 4。模拟)沾haematoxylin-eosin-saffron肿瘤部分。e、f)免疫组织化学染色的肿瘤部分小鼠接受VPA e)单独或结合5-azaCdR f),使用anti-Foxp3抗体。Foxp3 +细胞出现核染色棕色。比例尺条= 250μm(插图40μm)(放大4×20×(嵌入)。
在第二个系列的实验中,我们确定是否5-azaCdR / VPA治疗对AK7细胞诱导特定的t细胞反应。我们从小鼠的脾脏孤立CD8a + t细胞收到,不信,联合治疗(n = 5)。然后我们刺激这些CD8a + t细胞纯化AK7肿瘤细胞(图7)。有关酶联免疫斑点试验确定,IFN-γ-secreting细胞的数量是在从5-azaCdR / VPA-treated小鼠脾脏:意味着±扫描电镜每5×10 80±6点5细胞与18±4点/ 5×105未经处理的小鼠细胞,表明肿瘤特异性免疫反应的诱导治疗。此外,这种反应主要是指向treatment-induced肿瘤抗原。事实上,IFN-γCD8a + t细胞反应翻了一番治疗小鼠的脾脏与AK7细胞刺激以前处理0.5μM 5-azaCdR 72 h和5毫米VPA 48 h每5×10(154±9点5与未经处理的AK7细胞(细胞),相比每5×10 80±6点5细胞)。没有观察到景点仅在包含介质井每5×10和12±4位5细胞中观察到井只包含t细胞。最重要的是,我们成功地隔离CD8a +淋巴细胞肿瘤的老鼠收到5-azaCdR / VPA治疗,但不是从未经处理的动物。至于与脾细胞实验执行,我们观察到的数量的增加t细胞产生IFN-γAK7细胞治疗的反应(28±2点/ 1×105与未经处理的AK7细胞(细胞),相比10±2每1×10点5细胞)(图7 b)和介质(4±2点/ 1×105细胞)。
t细胞抗肿瘤反应在活的有机体内后5-aza-2′脱氧胞苷(5-azaCdR) /丙戊酸(VPA)治疗。CD8a + t细胞从一个)脾t细胞和b) CD8a + tumour-infiltrating C57BL / 6小鼠轴承肿瘤(或不是5-azaCdR / VPA治疗)刺激了36 h和未经处理的AK7细胞或5-azaCdR / VPA-treated AK7细胞。分泌的interferon-γCD8a +细胞测定有关酶联免疫斑点试验使用。均值±扫描电镜点一式三份的油井数量计算,每5×10点数目表示5或1×105CD8a +细胞。显著差异的反应测定使用)Kruskall-Wallis方差分析邓恩的测试后,或b) Mann-Whitney测试。代表对每个条件下显示对应的直方图的酒吧。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。
讨论
Hypomethylating药物和HDAC抑制剂在临床上用于促进经济增长的能力逮捕、分化和凋亡的肿瘤细胞13,30.]。DNMTs Decitabine (5-azaCdR)抑制剂,是最常用的hypomethylating药物(31日]。Depakine (VPA)和vorinostat(萨哈)是两个HDAC抑制剂目前评估MPM治疗(8,9,14]。组蛋白乙酰化作用机制涉及到两个酶家族:帽子,hdac。帽子在组蛋白乙酰基转移到伴赖氨酸残留物,而hdac催化乙酰基,导致染色质缩合和转录镇压[32,33]。
除了他们的固有毒性,我们的工作表明,表观遗传药物单独使用,或在组合,可以对taa的表达产生影响,因此,可以提高识别肿瘤细胞的细胞毒性t细胞。我们集中我们的注意力在cta,越来越感兴趣的是免疫治疗,因为他们的目标在活的有机体内免疫原性属性,不同类型的肿瘤中表达,在正常组织(28,34]。
符合之前的观察由Sigalottiet al。(19),我们表明,5-azaCdR单独使用可以诱发或增加NY-ESO-1的表达式,MAGE-A1和MAGE-A3 MPM细胞上皮样的亚型的剂量没有细胞毒性。5-azaCdR相比,其关闭模拟5-azacytidine (vidaza),优先纳入RNA但不是DNA, cta的不是有效的诱导表达分析(数据未显示)。相反,VPA或萨哈单独显示在这些细胞毒性相对较高但不影响CTA表达式。然而,我们表明,这两种药物,使用剂量低于最优毒性,增强CTA表达式与5-azaCdR MPM细胞预处理。此外,联合治疗的总体毒性略增加相比,HDAC抑制剂。在增殖细胞中,预处理与5-azaCdR诱发脱甲基的CpG岛位于沉默基因的启动子,如编码CTA,作为NY-ESO-1报道在神经胶质瘤细胞模型(35),因此,允许他们的表情。因此,VPA或萨哈的后续使用,可直接抑制HDAC活性和离开开放的染色质构象,提高cta的表达诱导5-azaCdR通过更好的可访问性DNA的转录因子。同样重要的是,nmc治疗没有表达cta,如NY-ESO-1,表明这种治疗不影响正常的免疫原性地位,nonproliferating细胞。
此外,我们观察到所有抗原* 0201 + MPM细胞系5-azaCdR对待/ VPA(或5-azaCdR /萨哈)认可的CD8 + t细胞克隆抗原* 0201 -限制和特定于NY-ESO-1 (157 - 165)。因此,新创合成NY-ESO-1抗原功能处理和在肿瘤细胞表面通过主要组织相容性复合体类分子。因此,我们已经表明,除了HDAC抑制剂引起的细胞毒性,顺序5-azaCdR / VPA治疗诱发特定MPM细胞株的细胞溶解NY-ESO-1-specific CD8 + t细胞。
间皮瘤的最后,用小鼠模型,我们表明,这样的顺序和5-azaCdR VPA治疗协会可以抑制肿瘤进展∼60%后3周。这种效果是由于治疗本身的毒性(活跃caspase-3染色治疗小鼠的肿瘤内(数据没有显示))和抗肿瘤免疫反应的激活。事实上,尽管AK7已知细胞分泌大量的转化生长因子(TGF) -β和促进宽容肿瘤(36),我们看到大量淋巴细胞浸润在肿瘤治疗小鼠但很少Foxp3 +细胞。此外,我们表明,池CD8a + t细胞分离的肿瘤(和脾脏)治疗,与未经处理的相比,老鼠包含更多的t细胞能够识别AK7细胞。作为TGF-βIFN-γ有相反的免疫调节作用,这种细胞因子可能发挥重要作用的抗肿瘤反应5-azazCdR / VPA治疗后观察。
虽然不同的临床试验已经显示出抗肿瘤活性5-azaCdR,萨哈或者VPA独自在白血病(3,6,7,11),很少有数据有关这些药物患者的活动MPM (4]。年代chrumpet al。(4)评估的可行性和毒性连续注入5-azaCdR仅35 72 h的肺和食管的癌症患者或MPM第一阶段的临床试验。作者确定的最大耐受剂量5-azaCdR是60 - 75 mg·m−2,有趣的是,长期输注诱导CTA基因表达(NY-ESO-1和MAGE-A3)在36%的病人。
萨哈是第一个HDAC抑制剂批准用于治疗癌症,特别是皮肤t细胞淋巴瘤(5]。正在评估其安全性在众多第一阶段临床试验固体肿瘤的治疗。收集安全数据显示,萨哈在联合疗法的使用,通常在400毫克每日14天,一般耐受性良好,抗癌活性的初步证据已经观察到的一系列恶性肿瘤(11]。有趣的是,在第一阶段的一项研究中,两位患者13先进MPM的一线化疗后进展表明部分临床反应后口服萨哈几个周期的治疗(9]。
HDAC抑制剂,VPA比异羟肟酸是不活跃的,如萨哈,但其药代动力学特性和生物利用度有利于其作为临床治疗。例如,VPA半衰期较长的比萨哈(分别为16 - 17 h和19-47 min),其作为一种抗癫痫药物广泛使用几十年来证明,长期的副作用是可以接受的。VPA目前正在测试作为一种抗癌剂,单独或结合其他代理,主要在血液学的疾病(7]。在I / II期研究中,53晚期白血病患者治疗的固定剂量5-azaCdR (15 mg·m−2·天−1注射。10天)管理与50毫克公斤−1·天−1VPA,口服了10天37]。这个组合5-azaCdR / VPA治疗被证明是安全的和活跃,也与重要的DNA hypomethylation,诱导组蛋白乙酰化和基因激活。临床研究与VPA单独或结合其他代理也在进行固体肿瘤(38]。例如,在研究的第一阶段中,先进的固体肿瘤患者接受VPA静脉输液:符合观测在白血病患者中,剂量≤60 mg·公斤−1·天−1连续五天耐受性良好,显示检测到生物活性,即。积累hyperacetylated H3和H4组蛋白在细胞溶解产物的外周血淋巴细胞(39]。MPM的上下文中,它最近已被证明,VPA提高培美曲塞/顺铂的proapoptotic效果,通常的一线治疗方案对于这个肿瘤,肿瘤细胞从患者的活检和MPM的小鼠模型8]。VPA +阿霉素的临床效益是最近在第二阶段试验评估(见协议在01062年www.elcwp.org)。目前很少使用的数据5-azaCdR和VPA组合(顺序或同时)治疗恶性肿瘤。只有一个临床试验(第一阶段)nonsmall细胞肺癌患者的治疗正在进行(见协议NCT00084981在www.clinicaltrials.gov)。值得注意的是,在所有这些研究中,患者接受5-azaCdR,萨哈或者VPA静脉输液或口服剂量低于使用。然而,其他政府协议可以提出,如灌注入胸膜腔直接接触MPM肿瘤细胞。这条路线的注入,已成功地用于临床试验与白介素2 (40),可能允许使用更高剂量的药物不兼容系统管理和在其他器官也可以减少副作用。
,这些临床试验允许测量5-azaCdR,萨哈和VPA毒性,但考虑到我们这里给出结果,这些分子对免疫应答的影响对癌细胞应该进一步评估。我们的调查表明,顺序5-azaCdR / VPA或5-azaCdR /萨哈治疗代表潜在的新策略来促使MPM细胞死亡和调节剩余的免疫原性,耐药肿瘤细胞。这项工作为额外的MPM的发展开辟了新的机会使用化疗药物组合的治疗策略,如5-azaCdR / VPA或5-azaCdR /萨哈,诱导MPM细胞凋亡和cta neo-expression NY-ESO-1等其余apoptosis-resistant肿瘤细胞。这些后者细胞然后成为目标的细胞毒性和TAA-specific免疫反应。而且,这种策略可能绕过抗原耐受机制的发展发生在cta期间表达的癌细胞肿瘤进展。化疗和免疫治疗等治疗协会在未来应该评估。
确认
我们感谢n Labarriere (INSERM, U892、南特、法国)提供M117黑色素瘤细胞系和M117.32H t细胞克隆,以及p·伯特兰(CNRS UMR 6514年,普瓦捷大学普瓦捷,法国)萨哈。我们还要感谢m . Robard和c Deleine (IFR26, Plateforme de Morphologie南特大学,南特)与组织学分析,他们的帮助和诉Dehame (INSERM, U892、南特、法国)技术援助。
脚注
支持声明
联赛本研究支持INSERM拉Interregionale靠le癌症(缅因州买受人,Morbihan卢瓦尔河,Sarthe和两个塞夫勒),洛杉矶de l基金会未来,La pour La医学基金会和南特大学医院。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年5月25日。
- 接受2011年3月29日。
- ©2011人队