摘要
呼吸道平滑肌细胞(Asmcs)分泌Eotaxin和Rantes(调节在激活,正常T细胞上表达和分泌)响应于肿瘤坏死因子(TNF)-α,其被核因子(NF)-κB抑制剂二甲基umarate抑制(DMF)。NF-κB/IκB(NF-κB的抑制剂)谷胱甘肽和染色质重塑的变化可以抑制NF-κB活性。在这项研究中,我们确定了NF-κB/IκB谷胱甘肽和还原的组蛋白H3磷酸化是否可能提高DMF对NF-κB活性的抑制作用,并且兴奋剂和乐曲分泌。
在TNF-α刺激之前,先用DMF、二胺和/或谷胱甘肽(GSH)乙基酯(OEt)处理初步的人asmc,随后通过ELISA、电泳迁移位移法、免疫荧光、共免疫沉淀或免疫印迹法进行分析。
DMF降低细胞内GSH和诱导的IκBα谷胱甘肽(IκBα-SSG),其抑制IκBα降解,NF-κBP65核进入和NF-κB/ DNA结合。此外,DMF抑制组蛋白H3的磷酸化,这可能是通过DMF对促丝胶和应激活化蛋白激酶(MSK)-1的抑制作用介导的。然而,DMF不抑制MSK-1上游的P38丝裂解剂活化蛋白激酶(MAPK),细胞外信号调节激酶MAPK和MAPK磷酸酶-1。重要的是,通过添加GSH-OET反转对NF-κB,组蛋白H3,eTataxin和Rantes的DMF介导的效果。
我们的数据表明DMF通过随后诱导IκBα-SSG和组蛋白H3磷酸化的抑制,DMF通过降低GSH抑制NF-κB依赖性的肠蛋白和Rantes分泌。我们的研究结果提供了新的潜在药物目标,以减少哮喘中的气道炎症。
哮喘是呼吸道的一种慢性炎症性疾病。哮喘患者的气道特征是嗜酸性粒细胞增多,痰嗜酸性粒细胞计数增多与哮喘严重程度相关[1].趋化因子eotaxin和RANTES(激活调控,正常t细胞表达和分泌)主要参与嗜酸性粒细胞募集到炎症的气道组织,这两种趋化因子在哮喘供体的支气管活检中均升高[2].
两种趋化因子均在气道平滑肌中检测到体内[3.,4]肿瘤坏死因子(TNF)-α增加人类气道反应性[5].在哮喘中,局部细胞因子分泌可能导致嗜酸性粒细胞浸润沿梯度进入粘膜下[6].在培养的人气道平滑肌细胞(ASMC)中,TNF-α激活转录因子核因子(NF)-κB并诱导细胞因子的表达[7].在体外研究表明,通过抑制NF-κB,通过抑制TNF-α诱导的肠曲线和ASMC的rantes分泌[7,8].
NF-κB形成二聚体,由p50、p52、p65 (RelA)、RelB和c-Rel亚基组成。在未受刺激的细胞中,NF-κB以与IκB (NF-κB抑制剂)蛋白形成复合物的形式保留在胞质中。细胞刺激诱导IκB的降解,使自由的、有活性的NF-κB迁移到细胞核,在那里它与DNA结合,启动基因转录[9].
IκB蛋白IκBα含有半胱氨酸硫醇,其易受氧化催化后改性的翻译后修饰的影响[10.].其中一种可逆修饰是蛋白质谷胱甘肽酰化(protein- ssg),即蛋白质的半胱氨酸硫醇(protein- sh)与半胱氨酸硫醇谷胱甘肽(GSH)形成二硫键。蛋白- ssg可通过降低细胞内谷胱甘肽水平诱导[11.],并已被证明能抑制NF-κB核进入并与DNA结合[12.,13.].富马酸二甲基酯(DMF)可降低许多不同细胞类型中的细胞谷胱甘肽[14.- - - - - -16.],并且还被证明抑制NF-κB的核置入,随后在ASMC中与DNA结合[7].因此,IκBα-SSG是DMF抑制NF-κB活性的可能机制。
组蛋白H3磷酸化对于染色质弛豫和转录因子对其相应的DNA序列的最佳结合是至关重要的[17.].Ser10的组蛋白H3磷酸化发生在NF-κB调节细胞因子的启动子中,例如Rantes [18.],并已被证明可增加NF-κB结合侧的可及性[19.].促丝孔和应激活化的蛋白激酶(MSK)-1在SER10的组蛋白H3 [20.],在asmc和角质形成细胞中DMF抑制msc -1 [7,21.].因此,通过DMF对MSK-1介导的组蛋白H3磷酸化的抑制可能有助于其对NF-κB依赖性趋化因子分泌的抑制作用。
在本研究中的人体ASMCS中,我们旨在确定NF-κB/IκBα的谷胱甘肽和减少的组蛋白H3磷酸化基础DMF对NF-κB依赖性肠昔姻和Rantes分泌的抑制作用。
材料与方法
材料
除非另有说明,所有化学品均购自Sigma (St Louis, MO, USA)。
人asmc的分离和培养
从获得的癌症或肺移植接受外科手术切除的患者的支气管中分离出人的ASMC,获得书面知情同意,由悉尼西南部卫生服务和悉尼大学(悉尼,澳大利亚)和人道主义由大学医院巴塞尔的当地伦理委员会(瑞士巴塞尔)。初级ASMC系列被隔离并如前所述的[7,22.].在通道5和8之间使用ASMC,并且在至少三种不同供体的ASMC中进行实验;综述了患者的人口统计数据表格1.
细胞内谷胱甘肽水平
汇合ASMC被剥夺血清(24小时),然后用DMF(50μM)或药物载体二甲基磺砜(DMSO; 0.05%)处理1或3小时。根据制造商的方案(谷胱甘肽测定套件; Biovision,San Diego,CA,USA)进行GSH测定。
B我κα江源发展促进会
在TNF-α刺激(10 ng·mL)前,将融合asmc去除血清(24 h),用二胺(100-500 μM)孵育30分钟,或用DMF (50 μM)孵育1小时和/或GSH乙基酯(1 mM)孵育90分钟−130分钟;研发系统,明尼阿波利斯,Mn,USA)。捕获和释放版本2.0可逆免疫沉淀系统(Millipore,Billerica,MA,USA)用于对NF-κB/IκB络合物进行共免疫沉淀(IP)。简而言之,裂解ASMC(50mM Tris-HCl,pH 7.5; 120mM NaCl; 1%NP-40; 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒),并将样品与针对NF-κBP65(4μg; C-20的抗体一起温育(4μg;)或NF-κBP50(4μg; H-119),或正常的兔免疫球蛋白(Ig)G阴性对照(4μg;4μg;所有Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)含有0.5毫升IP捕获的旋转柱树脂。将IP洗脱液与稠合的十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液混合,补充有5毫米NG.ydF4y2Ba- 乙基马来酰亚胺阻断未反应的硫醇基团,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行尺寸分级并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与针对NF-κBP65(C-20),NF-κBP50(H-119),IκBα(C-21)(所有Santa Cruz Biotechnology)或GSH(Virogen,Watertown,MA,USA)的抗体一起温育。通过增强化学发光(PerkinElmer,Wellesley,MA,USA),使用辣根过氧化物酶 - 缀合的IgG抗体(Cell Simition Technology,Danvers,Ma,USA)和蛋白质带来检测初级抗体(细胞信号传导技术,Danvers,Ma,USA)和蛋白质条带。
NF-κB/ DNA结合和NF-κBP65核入口
汇合ASMCS是血清剥夺(24小时),然后在TNF-α刺激之前用DMF(50μm持续1小时)和/或GSH-OET(1mm持续90分钟)预孵育(10 ng·mL−130分钟)。如前所述,通过电泳迁移率位移法(EMSA)分析NF-κB/DNA结合[7].为了确定NF-κBP65核进入,细胞被胰蛋白酶化,将细胞沉淀重悬于低盐缓冲液(10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪磺酸(HEPES),10mM KCl,0.1MM乙二醇四乙酸(EGTA),0.25%Nonidet P-40和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒20分钟。通过SDS-PAGE在高盐缓冲液(20mM HEPES,400mM NaCl,1mM EDTA,1mM EDTA,1×蛋白酶抑制剂含量的蛋白酶抑制剂鸡尾酒中,将核在40分钟内孵育40分钟,并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜与针对NF-κBP65(C-20)或Lamin A / C(细胞信号传导技术)的抗体一起温育,以确认等于蛋白质负载。
对于免疫荧光分析,在盖板上铺板,如上所述处理ASMC。用冰冷的100%甲醇(5分钟为-20℃)固定ASMC,含有10%甜血清(20分钟),并与针对NF-κBP65(C-20)或正常兔IgG的抗体孵育1小时。通过加入Alexa488缀合的驴抗兔IgG抗体(Invitrogen Corporation,Carlsbad,Ca,USA)检测初级抗体1小时。为了可视化核,4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI;分子探针,Eugene或,USA)(15分钟),随后在激光扫描显微镜上检查盖板。
MAPK/ msc -1/组蛋白H3通路激活
分离血清24小时后,在TNF-α (10 ng·mL)刺激前,用DMF (50 μM)和/或GSH-OEt (1 mM)孵育融合asmc−1), 0,5,10,15,30,60或120min。收集细胞总裂解液,用SDS-PAGE对大小进行分级,并转移到硝酸纤维素膜上。然后用针对phospho-MSK-1 (Ser360), phospho-MSK-1 (Ser376), phospho-MSK-1 (Thr581), MSK-1, phospho-histone H3 (Ser10) (D2C8), histone H3, phospho-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK), p38 MAPK,磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK), ERK MAPK (all Cell Signaling Technology)的抗体孵育膜。MAPK磷酸酶(mmp)-1或α-微管蛋白(DM1A;圣克鲁斯生物技术)。
趋化因素分泌物
在用TNF-α刺激之前,在用TNF-α刺激之前,在单个药物(DMF为1小时或90分钟)之前,在单一药物(DMF为1小时或GSH-OET)之前,添加融合的ASMC,或组合药物(10ng·ml−124小时)。收集上清液,ELISA(DUO集; R&D系统)测量eotaxin和Rantes。
数据分析
采用Mann-Whitney u检验进行统计分析;p值≤0.05为显著性。
结果
细胞表征
在图1 -ⅰ,我们发现从人支气管分离的细胞至少表达了两种ASMC标记物(平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)),而纤维连接蛋白表达阴性。这种ASMC标记的表达模式一直维持到第10代,没有显著变化,并且依赖于在细胞培养基中添加维生素(未发表的观察结果)。相比之下,人支气管肌成纤维细胞表达了显著水平的纤维连接蛋白,但没有SMMHC,只有低水平的α-SMA (图1 -ⅰ).
a-f)第3和第10代气道平滑肌细胞(ASMC)的细胞特征。第3代使用人肺成纤维细胞。SMMHC:平滑肌肌球蛋白重链;α-SMA:平滑肌α-actin。比例尺= 10 μm。j-n)富马酸二甲酯(DMF)降低细胞内谷胱甘肽(GSH)并诱导IκBα谷胱甘肽化。j)用DMF (50 μM)或载体(二甲基亚砜;0.05%), 1和3 h后测定细胞内谷胱甘肽。数据以平均值±表示扫描电镜五个复制。*: p<0.05 (Mann-Whitney U-test)。用GSH乙酯(OEt) (1 mM作用90 min)和/或DMF (50 μM作用1 h)预处理ASMCs,然后用肿瘤坏死因子(TNF)-α (10 ng·mL)刺激ASMCs−1)30分钟。裂解细胞,核因子(NF)-κB/IκB(NF-κB的抑制剂)复合物被免疫沉淀(IP)与抗NF-κBP65或NF-κBP50或正常兔免疫球蛋白(Ig)g的抗体。在非还原条件下的免疫印迹之后,将膜与针对GSH(IκBα-SSG)的抗体(IκBα-SSG)或总IκBα或NF-κBP65或P50孵育。
DMF降低ASMC GSH水平
DMF在其他细胞类型中降低细胞内GSH [14.- - - - - -16.].在该研究中,与车辆处理的细胞相比,用DMF(50μm)与DMF(50μm)的ASMC孵育1和3小时,通过〜50%减少GSH水平(图1 -ⅰ).
酰胺在ASMC中引起IκBα-SSG的酰胺
尚不清楚谷胱甘肽是否发生在培养的ASMC中。因此,我们首先确定了众所周知的谷胱甘肽诱导酰胺的效果[11.在NF -κB /我κB。ASMC经二胺(100-500 μM)处理30 min后,NF-κB/IκB由NF-κB p65或NF-κB p50 (无花果。1K.和l)。酰胺未诱导NF-κBP65-SSG或NF-κBP50-SSG(数据未显示)。重要的是,与未处理的细胞相比,酰胺(500μm)处理后IκBα-SSG水平增加(无花果。1K.和l).为了证实NF-κB/IκB复合物成功共免疫沉淀并显示相同的蛋白载量,将膜与抗NF-κB p65、NF-κB p50或IκBα (图1 b).NF-κB/IκB未被正常兔IgG沉淀,显示抗体的特异性(图1 b).
DMF诱导IκBα-SSG并抑制I-κBα降解
为了确定IκBα-SSG是否通过DMF介导NF-κB抑制[7[我们评估了对IκBα-SSG和IκBα降解的DMF影响。NF-κB/IκB用针对NF-κBP65或NF-κBP50的抗体免疫沉淀(无花果。1K.和l)。在未刺激asmc中,IκBα水平较高,但未检测到IκBα- ssg (无花果。1M和n)。在TNF-α治疗的ASMC中,IκBα完全降解,因此,没有检测到IκBα-SSG(无花果。1K.和l)。重要的是,当将DMF加入到TNF-α刺激的ASMC中时,诱导IκBα-SSG,抑制IκBα降解(无花果。1M在GSH-OEt存在时,DMF没有诱导IκBα-SSG (无花果。1Mn),提示ASMC GSH的降低介导了dmf诱导的IκBα-SSG。最重要的是,GSH-OEt的加入也逆转了DMF对IκBα降解的抑制作用(无花果。1M否)表明IκBα-SSG介导对IκBα降解的抑制作用。TNF-α-诱导的IκBα降解和IκBα-SSG的水平在单独的GSH-OET存在下没有改变(无花果。1K.和l)。通过将膜与针对NF-κBP65或NF-κBP50的抗体一起孵育来确认等于蛋白质载荷(无花果。1K.和l)。
DMF介导的NF-κB的抑制通过添加GSH-OET来逆转
接下来,我们评估了GSH-OET的DMF诱导的IκBα-SSG的逆转还逆转DMF对NF-κBP65核入口和NF-κB/ DNA结合的抑制[7].免疫印迹和免疫荧光分析表明,与载体控制相比,用TNF-α刺激后核NF-κBp65的量增加(图2 a e).TNF-α诱导NF-κB p65核积累(平均值±扫描电镜DMF至0.73±0.06(P≤0.05)显着抑制NF-κBp65 /嵌晶A / C 1.15±0.09)(图2 a e),这种抑制作用通过添加GSH-OET逆转(图2 a e).EMSA分析表明,未经刺激的细胞中未检测到NF-κB/ DNA结合(图2 f).TNF-α诱导NF-κB至DNA的结合,而GSH-OET不会改变(图2 f).用DMF治疗抑制TNF-α-诱导的NF-κB/ DNA结合,重要的是,通过GSH-OET逆转(图2 f).
富马酸二甲酯(DMF)及其被谷胱甘肽(GSH)乙酯(OEt)逆转对NF-κB p65核因子(NF -κB)入核和NF-κB/DNA结合的影响a - d)在肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激(10 ng·mL)之前,经GSH-OEt (1 mM)和/或DMF (50 μM)处理的气道平滑肌细胞的代表性荧光免疫染色显示NF-κB p65的核进入−1)30分钟。比例尺= 10 μm。e)通过使用核蛋白提取物免疫印迹确认刺激后30分钟的NF-κBP65的核置入。条形图总结了30分钟的NF-κBp65核置入的密度分析,归一化为Lamin A / C.数据显示为平均值±扫描电镜在四种不同的细胞系中进行的实验,并使用Mann-Whitney U-Test进行分析。#: TNF-α p≤0.05与TNF-α+ DMF。**:P <0.01。F)代表性的NF-κB特异性电泳迁移率变速区段。另外三个独立实验显示出可比的结果。
DMF可抑制组蛋白H3磷酸化,GSH-OEt可逆转这一作用
DMF在ASMC中抑制了MSK-1活动[7],在组蛋白H3的上游[20.],对最佳NF-κB/DNA结合非常重要[19.].在这里,我们表明TNF-α在15-60分钟之间诱导组蛋白H3磷酸化,在30分钟内具有最大效果,其被DMF抑制(无花果。3A).由于DMF对NF-κB/DNA结合的抑制被GSH- oet完全逆转,我们想知道DMF对组蛋白H3的作用是否也依赖于GSH。有趣的是,添加GSH-OEt可完全逆转DMF对TNF-α诱导的组蛋白H3磷酸化的抑制作用,而单独GSH-OEt对TNF-α诱导的组蛋白H3磷酸化没有影响(无花果。3B.).TNF-α、GSH-OEt或DMF单独或联合使用对总组蛋白H3表达均无影响(无花果。3A和b)。
谷胱甘肽(GSH)乙酯(OET)对组蛋白H3磷酸化(P-组蛋白H3)的影响及其逆转.a)在用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激之前,用GSH-OET(1mm持续90分钟)和/或DMF(50μm)和/或DMF(50μm)处理气道平滑肌细胞(n = 3)(10 ng·毫克−1)对于指示的时间。显示由TNF-α诱导的SER10的组蛋白H3磷酸化动力学的代表性免疫印迹及其DMF抑制。b)在30分钟内将外源GSH-OET对DMF依赖性组蛋白H3(SER10)抑制的逆转作用的代表性免疫印迹。
DMF独立于上游分子P38和ERK MAPK禁止MSK-1
DMF抑制asmc中MSK-1 [7],这在本研究中得到证实,DMF在10 - 30分钟内抑制TNF-α诱导的msc -1在Ser376位点的磷酸化(无花果。4A).相比之下,TNF-α诱导的msc -1在10 - 30分钟的Ser360和Thr581位点的磷酸化不受DMF处理的影响(无花果。4A).TNF-α和DMF都没有对全MSK-1蛋白表达的影响(无花果。4A).P38和ERK MAPK可以磷酸化,从而激活,MSK-1 [20.].在这里,我们证明dmf诱导的msc -1抑制不是由p38或ERK MAPK抑制介导的。TNF-α可在5 - 30分钟内激活p38 MAPK磷酸化,DMF处理可增强和延长这一过程(无花果。4B.).通过TNF-α在10至30分钟之间诱导ERK磷酸化,并且DMF不会改变这一点(无花果。4B.).总P38和ERK MAPK蛋白表达不受TNF-α或DMF的影响0至120分钟(无花果。4B.).TNF-α在60分钟后上调内源性MAPK抑制剂MKP-1,如前所述[23.],这不受DMF的影响(无花果。4B.).通过用α-微管蛋白原代抗体孵育膜来确认等于蛋白质载荷(无花果。4B.).
二甲基富马酸(DMF)对丝裂原和应激激活蛋白激酶(MSK)-1、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化和MAPK磷酸酶(MKP)-1表达的影响。a)气管平滑肌细胞系(n=3)在肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激0 - 120分钟前1小时用DMF处理。msk1在Thr581、Ser360和Ser376位点磷酸化(p-MSK1)动力学的代表性免疫印迹,以及msk1总表达。b)具有代表性的p38 MAPK磷酸化(p-p38 MAPK)、p38 MAPK总表达、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2 MAPK磷酸化(p-ERK1/2 MAPK)、ERK1/2总表达、MAPK和MKP-1表达以及负载控制α-微管蛋白的免疫印迹。在另外两个细胞系中也得到了类似的结果。
GSH-OEt逆转DMF对eotaxin和RANTES的抑制作用
接下来,我们评估GSH-OEt是否也能逆转DMF对eotaxin和RANTES的抑制作用。与对照相比,TNF-α显著诱导eotaxin和RANTES分泌,而DMF (无花果。5A和b)如前所述[7].重要的是,GSH-OEt的加入显著逆转了DMF对eotaxin和RANTES的抑制作用(无花果。5A,5B.).单独GSH-OEt对TNF-α诱导的eotaxin或RANTES的分泌或两种趋化因子的基线水平均无影响(无花果。5A和b)。
谷胱甘肽(GSH)乙酯(OET)反转二甲基umarate(DMF)对ETAXIN和RANTES(COMENTIOATION,正常T细胞表达和分泌的)分泌的效果,通过气道平滑肌细胞(ASMC)分泌.在用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24小时和a)Eotaxin之前,在刺激肿瘤坏死因子(TNF)-α之前,用GSH-OET(1mM持续90分钟)和/或DMF(50μm)处理ASMC线。b)通过ELISA测量rantes分泌。数据显示为平均值±扫描电镜6-7个重复,采用Mann-Whitney u检验进行分析。#: TNF-α p≤0.05与肿瘤坏死因子-α+药物。*: p < 0.05。
讨论
在这项研究中,我们表明,IκBα-SSG和减少的组蛋白H3磷酸化有助于DMF对NF-κB依赖性肠蛋白和Rantes分泌的抑制作用。DMF在ASMC中降低细胞内GSH,此前已被证明诱导蛋白质谷胱甘肽[11.].在这项研究中,我们首次表明IκBα-SSG在培养的ASMC中诱导。此外,我们表明DMF抑制了IκBα和随后的NF-κBP65核进入的降解,其由IκBα-SSG介导。此外,我们发现组蛋白H3磷酸化,其增强了促进剂内NF-κB结合侧的可达性[19.,被DMF抑制。这种作用很可能是由dmf诱导的对MSK-1的抑制介导的,MSK-1是组蛋白H3的上游。重要的是,添加GSH- oet不仅可以逆转DMF介导的NF-κB和组蛋白H3的抑制作用,还可以逆转DMF对eotaxin和RANTES的抑制作用,这表明DMF通过改变ASMC GSH水平来抑制这些因素。综上所述,我们的研究揭示了ASMCs抑制eotaxin和RANTES分泌的新机制。针对这里描述的途径开发的新药物可能有助于限制哮喘中的嗜酸性炎症。
NF-κB被认为是免疫反应最重要的调节因子之一,并显示在炎症性气道疾病中发挥关键作用[24.].NF-κB调节许多促炎因子的表达,其抑制在ASMCs中被证明具有抗炎作用[7].早期的研究表明,细胞内GSH的降低水平可以抑制NF-κB活性[25.,26.].这与我们的研究一致,表明DMF介导其对NF-κB的抑制作用通过细胞内GSH的减少。谷胱甘肽,其诱导的细胞内GSH水平诱导[11.],是可逆的氧化还原调节机制,并且许多研究表明,NF-κB途径被谷胱甘肽抑制多水平抑制。在气管上皮细胞中,IκB激酶复合物的谷胱甘肽溶解导致NF-κBP65核进入和NF-κB/ DNA结合的抑制作用[27.].在HeLa细胞中,二胺诱导IκBα- ssg,降低IκBα磷酸化和泛素化在体外[10.].NF-κBP65亚基的谷胱甘肽在肉桂醛处理的内皮细胞中诱导,导致NF-κBp65核易位的抑制作用[12.].在体外, NF-κB p50-SSG抑制NF-κB结合DNA的能力[13.].因此,DMF通过DMF诱导IκBα-SSG的诱导可能有助于其对NF-κB核进入和NF-κB/ DNA结合的抑制作用。
以前,显示DMF抑制SER376的MSK-1的磷酸化,导致下游CREB的磷酸化降低(环状腺苷一磷酸响应元件结合)和NF-κBP65[7,21.].MSK-1也可使组蛋白H3在Ser10位点磷酸化[20.],增加不同启动子内NF-κB结合位点的可访问性[19.].在本研究中,我们发现DMF抑制组蛋白H3的磷酸化,这很可能是由DMF抑制msc -1介导的。有趣的是,DMF对msc -1的抑制作用并不是通过减少MSK-1上游的p38或ERK MAPK的激活介导的。此外,MSK-1在Ser360和Thr581磷酸化位点的磷酸化被p38或ERK MAPK直接靶向[28.],不受DMF治疗的影响。这些发现与角蛋白细胞的另一个研究一致,表明DMF独立于P38或ERK MAPK抑制SER376的MSK-1磷酸化[21.].MKP-1是MAPK的内源性抑制剂,可以通过减少GSH水平来上调[29.[除了抑制MAPK P38和ASMC中的ERK之外还[23.]据据报道,在Ser10下去磷酸化组蛋白组蛋白H3 [30.].然而,在我们的研究中,DMF处理并没有影响mmp -1的水平,提示它并没有介导DMF对组蛋白H3磷酸化的抑制作用。重要的是,DMF对组蛋白H3磷酸化的影响被GSH- oet的加入所逆转,这表明DMF诱导的细胞内GSH的变化也介导了DMF对msc -1/组蛋白H3通路的影响。然而,DMF抑制MSK-1/histone H3通路的确切机制尚待进一步研究。
dmf依赖性下调eotaxin和RANTES证实了我们之前的研究[7,并且特别重要,因为这些趋化因子吸引嗜酸性粒细胞进入炎症的气道,从而改变ASMC的功能[1].早些时候,我们发现DMF通过抑制NF-κB抑制eotaxin和RANTES [7].在这里,我们表明这两种影响都依赖于DMF诱导的细胞内GSH的减少。类似地,DMF在人外周血单核细胞中抑制白细胞介素(IL)-1β,TNF-α和IL-6分泌,该细胞被GSH补充救出[16.].此外,DMF降低GSH水平并抑制胶质细胞中的脂多糖诱导的IL-1β,TNF-α和IL-6分泌[15.].
总之,本研究证实了TNF-α诱导的趋化因子分泌在asmc中被抑制的新分子机制。针对这里描述的途径可能有助于减少哮喘中的嗜酸性炎症。
脚注
支持声明
本研究得到了瑞士国家基金会拨款(320030-116022)的补助金,并由Gottfried和Julia Bangerter-Rhyner Stiftung(瑞士伯尔尼)获得。
兴趣表
没有宣布。
- 已收到2010年8月12日。
- 接受2011年6月14日。
- ©ers 2011.