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呼出呼吸冷凝液(EBC)有望作为一种无创收集气道内壁液体的方法,尽管其稀释程度未知[1].而使用核磁共振(NMR)波谱对EBC的代谢组学研究此前已显示出在哮喘诊断和分型方面的前景[2,3.这项研究最近发表在欧洲呼吸杂志未能从一次性系统的EBC集合中找到可用的NMR特征[4].这导致作者得出结论,核磁共振代谢组学缺乏足够的敏感性代谢指纹EBC。有趣的是,他们能够从相同的样品中获得高质量的结果,他们建议未来使用的质谱。由于这是一个新兴和技术复杂的领域,我们提出了我们非常不同的早期经验,这表明,可复制的,有效的和有用的核磁共振代谢指纹EBC确实是可能的。具体来说,我们发现,在核磁共振光谱中,在7ppm处存在或不存在一个三叉戟峰,可以可靠地区分从正常和哮喘受试者采集的EBC样本。这个峰值可能代表铵离子,哮喘中铵离子的损失与谷氨酰胺酶(一种将谷氨酰胺转化为谷氨酸和氨的酶)的表达减少一致[5].
机构委员会批准了所有的研究方案。受试者包括成人(>21岁)和儿童(6-15岁)。成人哮喘受试者(n=7)经内科诊断,符合美国胸科学会/欧洲呼吸学会标准[188bet官网地址6都不吸烟。对照组为健康、不吸烟的成年人(n=10)。这些儿童是正在收集的多维基因型和表型数据的前瞻性哮喘队列的一部分(n=58)。这个队列的目标是发现哮喘亚表型,队列中没有对照。另外收集两份来自无个人或家族呼吸疾病史的非哮喘儿童的EBC样本。EBC样品采用完全一次性采集系统(Rtube;呼吸研究,奥斯汀,德克萨斯州,美国),超过10分钟的标准制造商协议[7].
1H-NMR光谱是在德国Bruker配备三共振反(TCI)探头的600 MHz NMR谱仪上获得的。采用改进的核Overhauser效应光谱(NOESY)序列进行了水抑制。1首先获得了RTube收集管(一次性塑料管)中的水的H-NMR谱,以确定来自收集管本身的任何污染物。哮喘患者和对照患者的光谱如图所示图1.结果表明:1)一次性试管中人体样品的EBC具有核磁共振谱特征;2)这与从管本身获得的实验控制光谱不同;3)在7 PPM附近有一个三叉戟峰,这在哮喘受试者和对照组之间是不同的。7个成年哮喘受试者中只有1个(14%)出现了高峰期,这与10个对照组受试者中8个(80%)形成了鲜明对比。这在统计学上有显著意义(在哮喘受试者中出现峰值/无峰值与控制;1/6 vs 8/2, OR 24;p = 0.01)。关于儿童,我们有主要的哮喘受试者和只有两个对照受试者,但结果仍然具有统计学意义(在哮喘受试者中出现峰值/没有峰值与控制;4/54与2/0;P =0.0085),更重要的是,与研究结果一致的是,在成年人中,约90%的哮喘受试者没有出现峰值,而正常受试者出现了峰值。在EBC谱中没有发现主要的年龄相关差异,在机器学习系统中进一步分析亚表型发现正在进行中。进一步确定了7 ppm时差异的生物学意义。
呼气冷凝液(EBC)的核磁共振(NMR)谱在7ppm处没有三叉戟峰与哮喘有关。110例正常人和7例哮喘成人EBCs的H-NMR谱图。来自采集系统(RTube)的实验控制(顶部痕量)与EBC光谱明显不同。椭圆形方框突出显示7ppm的三叉形峰,在大多数正常受试者中可见(低10个痕迹),但在大多数哮喘受试者中缺失(中间7个痕迹)。哮喘受试者出现峰值/无峰值与控制(1/6与8/2或24;p = 0.01)。
在7ppm的三叉戟峰被发现是由于铵离子,并已被加入氯化铵的样品确认。在健康受试者中,谷氨酰胺酶介导的氨合成通过缓冲游离氢离子(NH)来维持气道pH3.+ H+= NH4+).H螺母et al。[5]与正常受试者相比,急性哮喘加重患者的气道酸性更强,氨含量更低[5].在慢性哮喘中,是否由于谷氨酰胺酶活性降低而丧失酸中和能力尚不清楚。H螺母et al。[5)发现在体外在人肺腺癌细胞株中谷氨酰胺酶的酸依赖表达的证据,它被炎症细胞因子抑制。在一些模型中,血清谷氨酰胺酶活性反映了组织谷氨酰胺酶活性[8,我们测定了哮喘受试者和对照组血清中谷氨酰胺酶的活性。采用elisa法(USCNK生命科学,中国武汉),我们发现正常人谷氨酰胺酶水平显著高于哮喘受试者(图2).
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/39/2/500/F2.medium.gif)
哮喘患者血清谷氨酰胺酶降低。血清谷氨酰胺酶水平,由ELISA测定,显示为正常和哮喘受试者。*: p < 0.05。
综上所述,我们首次发现EBC核磁共振谱中7 ppm处与铵相关的三叉戟峰的缺失与哮喘有关。氨的损失反映了由于谷氨酰胺酶下调导致的氨合成减少,导致酸中和受损。令人惊讶的是,尽管在我们的研究中有很强的相关性,但Carraroet al。[2他首先描述了EBC在哮喘中的核磁共振波谱应用。他们的研究只显示了1到4 ppm之间的光谱。观察到的差异的一种可能是Carraroet al。[2使用可重复使用的收集系统。这是可能的,正如我所建议的zquierdo- g弧我一个et al。[4,在可重复使用的收集系统中使用消毒剂可能会产生人工制品,而清洗这些人工制品反过来可能会掩盖光谱的某些部分。由于我们使用完全一次性的EBC收集管,只有一个冷却的外部金属套管被重复使用,因此我们的数据中不存在这种污染的可能性。此外,还证实了包括7ppm峰在内的EBC光谱与从相同管道收集的氘水冷凝物不同。此外,先前关于哮喘中氨和铵减少的独立报告证实了我们的发现[5,9].在我们的研究中,控制组的数量较少,特别是儿童,限制了我们的研究,需要进一步的研究来确定我们的发现的有效性。此外,呼吸道上的酸性负荷可能会增强铵态氮的特征,这可能在不同的地理区域有所不同。这项研究是在印度德里进行的,那里的空气中含有高浓度的硫酸和一氧化氮。我们的研究结果是否适用于污染较少的地区还有待检验。然而,尽管如此,我们的数据有望消除任何进一步辩论的必要性,即是否可以为EBC获得有效和有用的NMR谱[4].这一新兴领域具有很大的翻译潜力,需要许多研究者的共同努力。
致谢
作者感谢CSIR项目MLP5501提供的研究资金支持。他们感谢德里全印度医学科学研究所儿科系的成员,特别是M.B. Meenakshi、A.P. Anibha、B.J. Bipin和H.P. Hrishikesh收集的患者样本,并感谢印度加尔各答国际医学研究院结构生物学和生物信息学系,特别感谢E.P. Padmanabhan在核磁共振光谱方面的帮助。
脚注
支持声明
这项研究由印度政府科学和工业研究理事会(CSIR)的卓越中心项目MLP 5501资助。阿格拉瓦尔感谢塔塔夫人纪念信托基金的支持。
感兴趣的语句
没有宣布。
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