摘要
细胞因子白介素(IL)-15、主要组织相容性复合体(MHC) I类分子和MHC I类链相关蛋白(MIC) A和B参与病毒感染的细胞免疫应答,但它们在呼吸道合胞病毒(RSV)感染中的作用尚未研究。我们的目的是确定RSV感染如何调节呼吸道上皮细胞中IL-15的产生、MHC I类和MICA的表达、病毒诱导IL-15产生的分子途径以及干扰素(IFN)-γ如何改变RSV诱导的IL-15的产生、MHC I类和MICA的表达。
我们用RSV感染呼吸道上皮细胞(A549和BEAS-2B细胞)和原代支气管上皮细胞,检测IL-15的产生、MHC I和MICA的表达以及转录因子核因子(NF)-κB的作用。
我们在此报告RSV增加呼吸道上皮细胞中的IL-15通过病毒复制和NF-κ b依赖机制此外,RSV感染上皮细胞上调细胞表面MICA的表达和可溶性MICA的水平。IFN-γ上调RSV诱导可溶性IL-15,但抑制MICA的诱导。
IL-15、MHC I和MICA的上调可能是上皮细胞激活RSV免疫应答的重要机制。
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿、儿童和老年人严重呼吸道疾病的常见病因。呼吸道上皮细胞的RSV感染调节参与干扰素(IFN)-γ产生和自然杀伤细胞(NK)和t细胞毒性活性的表面和可溶性分子[j]。1- - - - - -3.]。白细胞介素(IL)-15启动子中病毒诱导区域的存在[4表明IL-15是宿主抗病毒防御机制的重要组成部分,通过诱导IFN相关转录因子核因子(NF)-κB、IFN调节因子和1型IFN, 1型效应分子(IFN-γ、颗粒酶和穿孔素)的合成以及NK和效应/记忆CD8+ t细胞的存活和活化[5- - - - - -7]。IL-15还上调肠上皮细胞上的主要组织相容性复合体(MHC) I类链相关蛋白(MIC) A和B [8]。表面MIC分子(由人MHC内的基因编码并与MHC I类人白细胞抗原(HLA)-B分子遗传相关)通过非特异性激活NKG2D+ NK和CD8+ t细胞来调节先天免疫[9,10]。
因此,IL-15可能在RSV感染的免疫应答中发挥关键作用,但没有关于RSV调节人呼吸道上皮细胞IL-15产生和MICA/B表达的数据。
我们的目的是确定RSV感染如何调节呼吸道上皮细胞中IL-15的产生,以及病毒诱导IL-15产生的分子途径。此外,由于RSV感染诱导以IFN-γ产生增加为特征的1型免疫反应[11],我们确定了IFN-γ如何改变rsv诱导的IL-15产生以及上皮细胞中MHC I类和MICA分子的水平。
材料与方法
呼吸道上皮细胞的细胞培养与RSV感染
RSV A2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)在Hep-2细胞中培养,通过空斑试验测定病毒滴度。为了评估活RSV介导应答的特异性,以紫外线灭活、热灭活和过滤后的RSV作为对照[2,3.]。支气管(BEAS-2B)和肺泡(A549)上皮细胞系(欧洲收集细胞培养,索尔兹伯里,英国)和人原代支气管上皮细胞(HPBEC) (Clonetics, Cambrex BioScience, Walkersville, MD, USA)用RSV培养。2,3.]。半流畅细胞单层暴露于RSV不同感染倍数(MOI;传染性单位·细胞−1)或轻摇灭活RSV 1小时后,将病毒洗净,加入或不加入IFN-γ (50 ng·mL)的新鲜培养基−1;R&D Systems Ltd, Abingdon, UK)加入。时间零被认为是病毒被移除的时刻。收集上皮细胞进行流式细胞术,上清液、RNA或蛋白裂解液保存在-80°C。
流式细胞术
在不同的时间点收集上皮细胞,并按照其他地方的描述进行处理[2,3.]。采用小鼠抗人单克隆抗体:植红蛋白(PE)标记的人MICA (R&D Systems Ltd)和异藻蓝蛋白标记的人HLA I类(BD Bioscience, Oxford, UK)直接染色检测呼吸上皮细胞表面MHC I类和MICA。
我们使用BD LSR流式细胞仪(BD Bioscience)获得了至少10,000个事件。结果用平均荧光强度(MFI)表示,减去用适当的同型对照抗体染色的对照细胞的MFI。刺激实验表示至少三个单独实验中,实验条件下的MFI比中等处理的细胞增加了一倍。
ELISA检测IL-15和可溶性MICA
采用市售配对抗体(R&D Systems Ltd)和重组IL-15 (Biosource UK Ltd, London, UK), ELISA法测定培养上清液中IL-15的水平。检测的灵敏度下限为0.25 pg·mL−1[12]。可溶性MICA水平测定采用Human MICA ELISA开发试剂盒,DuoSet (R&D Systems Ltd;灵敏度31.25 pg·mL−1).
RNA提取,反转录和实时PCR
总RNA用RNeasy Mini Kit (Qiagen Ltd, Crawley, UK)提取,2 μg用于cDNA合成(Omniscript RT Kit;试剂盒有限公司)。定量RT-PCR (TaqMan;使用作者设计的IL-15特异性引物和探针[12]。
使用ABI Prism 7000 SDS软件(Applied Biosystems, Warrington, UK) 1.4版分析数据。将IL-15基因表达水平正常化为18S rRNA(作为内源性负载对照),并相对于培养基呈倍增长。
NF -κB激活
NF-κB活化对rsv诱导的IL-15产生的影响使用先前描述的i -κB激酶(IKK)2抑制剂(AS602868)进行评估[13]。AS602868抑制IKK激酶的激活,IKK激酶负责NF-κB抑制剂的降解,从而降低细胞内NF-κB的水平[13]。我们使用IKK2抑制剂AS602868,其浓度先前被证明是鼻病毒诱导的肿瘤坏死因子-α抑制的最佳浓度,没有细胞毒性[13]。
IL-15启动子活性的功能分析
含有全长IL-15启动子和分泌性碱性磷酸酶(seAP)报告子的质粒(hIL-15-seAP)、含有IL-15-seAP缺失的质粒和NF-κB突变质粒(mtNF-κB-897-seAP)是N. Azimi [14]。
为了确定IL-15启动子发生RSV上调的区域,通过磷酸钙法(CalPhos哺乳动物转染试剂盒;BD Biosciences Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)。在不同时间点收集上清液,测定蛋白质含量(BioRad protein Assay, Bradford法);BioRad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, UK),并通过标准seAP测定(seAP报告基因测定;罗氏诊断有限公司,伯吉斯山,英国)。采用β-半乳糖苷报告结构共转染,对转染效率进行归一化处理。启动子活性表示为与阴性对照相比的倍数诱导。
统计分析
使用GraphPad Prism version 4.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)分析结果。至少三个独立实验的结果以均数±表示扫描电镜。不同实验条件之间的比较采用方差分析,适当时采用配对t检验。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
RSV上调上皮细胞中IL-15的产生
肺泡A549和支气管BEAS-2B细胞组成性表达低水平的IL-15, RSV感染后A549细胞IL-15水平显著升高(图1一个)及BEAS-2B (图1 b感染后72小时内,细胞上清液以浓度和时间依赖的方式(图1c和d).呼吸道合胞病毒感染也增加了人乳头状瘤病毒(图1 e).
呼吸道合胞病毒(RSV)在呼吸道上皮细胞中以剂量和时间依赖的方式增加白细胞介素(IL)-15的产生。a) A549细胞和b) BEAS-2B细胞分别在不同感染倍数(MOI)下感染RSV,培养48 h和72 h,收集上清液,ELISA检测IL-15水平。c) A549细胞和d) BEAS-2B细胞感染RSV,在随后的时间点(6-72 h)收集上清液,ELISA检测IL-15水平。e) RSV感染人原代支气管上皮细胞(HPBEC), 24 h收集上清液,ELISA检测IL-15水平。所有结果均以平均值±表示扫描电镜, n = 3 - 6。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;#: p < 0.005。
为了确定诱导IL-15是否需要病毒复制,我们接下来测定了rsv感染呼吸道上皮细胞上清液中IL-15蛋白的释放情况,以及用非复制病毒(紫外线或热灭活)或通过分子量过滤去除病毒的接种剂处理的细胞。感染后48小时,RSV诱导的IL-15水平明显高于用紫外线灭活病毒、热灭活病毒、滤过病毒或仅用培养基处理的A549上皮细胞(图2一个),表明IL-15在支气管上皮细胞中的诱导是由于活病毒的活跃复制,而不是由于病毒接种物中的可溶性因子。
呼吸道合胞病毒(RSV)诱导白细胞介素-15通过病毒复制和增加基因表达。a) RSV失活48 h后,A549细胞中IL-15的诱导消失(n=3)。b) A549细胞(n=3)和c)人原代支气管上皮细胞(HPBEC;n=6)感染RSV后,分别从细胞裂解液中提取总RNA (b) 6 - 72 h和c) 24 h后,用定量RT-PCR法检测IL-15 mRNA。结果显示,感染细胞的mRNA拷贝数比未感染的对照增加了两倍。所有数据均为平均值±扫描电镜。*: p < 0.05与住RSV;* *: p < 0.01与住RSV;#: p < 0.05与未感染的控制。
RSV增加上皮细胞IL-15基因表达和启动子激活,IL-15的诱导依赖于NF-κB
为了研究RSV是否通过转录前机制增加IL-15蛋白通过通过上调mRNA水平或增加组成细胞内蛋白的释放,我们测量了IL-15 mRNA的表达。在rsv感染的A549细胞中,IL-15 mRNA水平在感染后12、48和72 h较对照组升高(图2 b).RSV感染24 h后,HPBEC中IL-15 mRNA也升高。图2 c).
据报道,IL-15在其他系统中的诱导依赖于NF-κB [15],我们接下来研究了NF-κB在rsv诱导的上皮细胞产生IL-15中的作用。加入IKK2药理学抑制剂AS602868后,rsv诱导的A549细胞中IL-15的表达呈浓度依赖性显著降低(图3),抑制IKK2也显著抑制了HPBEC的诱导(图3 b).这些数据表明RSV诱导IL-15依赖于IKK2,可能涉及典型的NF-κB途径。
呼吸道合胞病毒(RSV)增加白细胞介素(IL)-15启动子激活通过核因子-κB活化。a)在IκB激酶(IKK)抑制剂AS602868浓度增加的条件下培养8 h的A549细胞感染RSV 1 h,清洗后再次加入IKK抑制剂。感染后14h收集培养上清液,ELISA检测IL-15水平。b)用10 μM AS602868处理人原代支气管上皮细胞(HPBEC)感染RSV,于感染后24 h收集培养上清,ELISA检测IL-15水平。c) A549细胞转染含有分泌性碱性磷酸酶(seAP)报告基因的质粒,构建完整的IL-15启动子(-897-seAP);将几乎缺失整个IL-15启动子的质粒(-15-seAP)和含有NF-κB连接位点突变的IL-15启动子报告结构的质粒(mtNF-κB-897-seAP)感染RSV,并在24 h收集上清液,测量seAP活性,结果以RSV感染细胞与未感染细胞的比例表示。所有RSV感染均为感染1个感染单位·细胞的多重感染−1。数据均为平均值±扫描电镜, n = 3。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;#: p < 0.005;ns:不重要的。
为了研究RSV诱导IL-15是否与IL-15启动子激活有关,并证实NF-κB在RSV激活IL-15启动子中的作用,我们使用了含有全长IL-15启动子(-897-seAP)的质粒、几乎不含IL-15启动子的质粒(-15-seAP)和含有-75/-65 NF-κB结合位点突变的全长启动子质粒(mtNF-κB-897-seAP)。RSV感染诱导全长IL-15启动子结构的激活(增加4.45±0.92倍;P <0.01)。转染启动子-15-seAP和mtNF-κB-897-seAP的细胞感染RSV后,IL-15启动子的表达未显著增加(图3 c).这些数据证明RSV诱导IL-15涉及IL-15启动子激活,并进一步证明NF-κB连接位点是RSV激活IL-15启动子所必需的。
RSV和表面MHC I类和MICA/MICB分子
由于MHC I类分子与MIC分子相关,我们研究了RSV如何调节这些分子。MHC I类分子在先天免疫(通过控制NK细胞活性)中发挥重要作用,通过抗原呈递,获得性抗病毒免疫。
RSV感染使A549、BEAS-2B和HPBEC的MHC I类分子表面水平分别升高(p<0.05、p<0.05和p<0.01) (图4),以复制依赖、剂量反应和时间依赖的方式(数据未显示)。
呼吸道合胞病毒(RSV)的复制增加了主要组织相容性复合体(MHC) I类水平。a) A549细胞,b) BEAS-2B细胞和c)人原代支气管上皮细胞(HPBEC)用感染1感染单位·细胞的RSV多重性培养−1紫外灭活RSV或过滤RSV 24h,采集细胞,流式细胞术测定人白细胞抗原I类表面分子。数据均为平均值±扫描电镜平均荧光强度比培养基增加1倍,n=3。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;ns:不重要的。
我们有兴趣确定RSV如何调节MICA和MICB分子。据报道,表面MICA分子增强了NKG2D+ NK细胞和CD8+ t细胞的非特异性激活,并且在某些情况下释放的可溶性MICA会抑制免疫反应[16]。
使用抗MICA抗体(识别MICA和MICB分子);6 d4.6抗体;格罗的礼物)[17],我们发现HPBEC、A549和BEAS-2B细胞组成性地表达MICA/MICB分子(HPBEC的代表性直方图见图5),如先前报道[18,19]。
呼吸道合胞病毒(RSV)在呼吸道上皮细胞中诱导主要组织相容性复合体I类链相关蛋白(MIC) A的表面和可溶性表达。a)人原代支气管上皮细胞(HPBEC)组成性表达MICA/B表面分子。数据来自三个有代表性的实验中的一个。b和c) BEAS-2B细胞用过滤过的RSV培养基培养,RSV感染倍数(MOI)分别为0.03、0.1和1个感染单位·细胞−1在b) 24和48 h和c) 48 h收获细胞,通过流式细胞术检测表面MICA。数据显示平均荧光强度比介质增加了几倍。d)在24、48和72 h收集上清液,用ELISA法测定可溶性MICA。数据均为平均值±扫描电镜, n = 3。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;#: p = 0.08;¶: p = 0.06;+: p < 0.005。
使用一种特殊的MICA抗体,我们发现RSV感染以时间和剂量依赖的方式增加了BEAS-2B细胞中MICA的表面水平(图5 b和c)。RSV感染也增加了BEAS-2B细胞产生的可溶性MICA水平,并呈剂量和时间依赖性(图5 d).
IFN-γ增加RSV诱导的IL-15水平,但下调RSV诱导的MICA
据报道,IFN-γ可增加肺癌患者支气管上皮细胞和BEAS-2B细胞系中IL-15的水平[20.,21]。因此,我们研究了IFN-γ是否单独或联合RSV感染影响IL-15水平、MHC I类表达或MICA表面或可溶性水平。培养环境中IFN-γ的存在显著增加了24 h BEAS-2B细胞中IL-15的分泌,并提高了rsv诱导的可溶性IL-15水平(p<0.01) (图6).
干扰素(IFN)-γ增加呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的白细胞介素(IL)-15和表面主要组织相容性复合体(MHC) I类水平。a)用IFN-γ (50 ng·mL)预处理BEAS-2B细胞−1),感染与否RSV感染多重性为1个感染单位·细胞−1培养72 h,检测IL-15。所示数据为平均值±扫描电镜在24小时的四个单独实验中,b) A549细胞(n=3), c) BEAS-2B细胞(n=5)和d)人原代支气管上皮细胞(HPBEC;n=5)分别用培养基、IFN-γ、RSV和RSV+IFN-γ处理,24 h用流式细胞术检测MHC I类表面分子。数据为平均荧光强度比培养基增加2倍。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;#: p = 0.09;¶: p < 0.005。
单独用IFN-γ处理上皮细胞也显著增加了24 h上皮细胞表面MHC I类的表达(BEAS-2B和HPBEC分别为p<0.01和p<0.001) (图6 c和d)。在rsv感染的细胞培养中,IFN-γ的存在对上皮细胞系或HPBEC的MHC I类没有影响。相比之下,IFN-γ处理在24 h和48 h显著降低了BEAS-2B细胞的表面和可溶性MICA (图7).IFN-γ也在24 h抑制rsv诱导的BEAS-2B细胞表面MICA的增加,并阻断可溶性MICA的释放。48 h (图7).
干扰素(IFN)-γ下调呼吸道合胞病毒(RSV)对表面和可溶性主要组织相容性复合体I类链相关蛋白(MIC) a的诱导水平并抑制其表达。a和c)用流式细胞术测定表面MICA, (b和d)在(a和b) 24 h和(c和d) 48 h用ELISA测定可溶性MICA。数据均为平均值±扫描电镜, n = 3 - 5。*: p < 0.05;* *: p < 0.01;#: p < 0.005。
讨论
我们在这里展示了证据在体外RSV感染上调气道上皮细胞IL-15的产生通过病毒复制、转录因子NF-κB的激活和IL-15基因的上调。RSV感染也上调了表面MHC I类分子和表面和可溶性MICA分子。在富含IFN-γ的1型细胞因子环境中,RSV感染呼吸道上皮细胞增加了IL-15的产生和MHC I类分子,但下调了表面和可溶性MICA水平。
IL-15已被证明在记忆/效应CD8+ t细胞的存活中发挥重要作用,并通过NKG2D激活效应CD8+ t细胞中独立于t细胞受体特异性(nk样杀伤)的细胞溶解功能[8],帮助消灭目标细胞。IL-15基因和蛋白在呼吸道上皮细胞中的表达已有报道[22,23]并在健康对照者和炎症性肺病患者的支气管活检中检测到[22]。RSV在单核细胞系中上调IL-15 mRNA,但RSV对呼吸道上皮细胞中IL-15产生的影响尚未报道。我们发现RSV感染增加了呼吸道上皮细胞系和原代支气管上皮细胞中IL-15 mRNA和蛋白的产生。通过构建小分子IKK抑制剂和启动子,我们还确定了典型的NF-κB通路在rsv诱导的IL-15表达中起重要作用。呼吸道上皮细胞对RSV感染的反应上调IL-15可能在激活先天免疫系统的细胞成分中发挥重要作用。我们曾报道哮喘患者IL-15分泌不足[12这可能是哮喘患者对呼吸道病毒感染易感性增加的一种机制。
我们还发现呼吸道上皮细胞的RSV感染上调MHC I类和MICA分子。呼吸道上皮细胞上的MHC I类分子在激活抗原特异性CD8+ t细胞中具有重要作用,但可能抑制NK细胞,对控制病毒复制有负面影响。
MICA在上皮细胞上的表达导致NKG2D+ NK和CD8+ t细胞的细胞毒性增加[j]。17和被感染细胞的裂解有报道称,人肿瘤细胞表面MIC的表达足以克服MHC I类表达对NK细胞杀伤的抑制作用,即使MHC I类表达也会发生NKG2D+细胞毒性[24]。因此,应答RSV感染时上皮细胞MICA的上调将确保激活局部细胞毒性NKG2D+ NK和t细胞,并根除病毒感染的细胞。然而,RSV感染也上调了呼吸道上皮细胞产生的可溶性MICA的水平。可溶性NKG2D配体,如MICA,通过受体内化、受体掩蔽或表面NKG2D降解,损害NK和t细胞介导的NKG2D介导的细胞毒性[10,16]。因此,较高水平的可溶性MICA可能会损害病毒清除。可溶性MICA的上调可能在防止nkg2d介导的过度细胞毒性中起作用,从而避免了旁观非感染细胞的细胞溶解,但这一假设需要进一步研究。
RSV诱导IFN-γ水平升高的1型免疫应答,IFN-γ与I型IFN、IL-15和共刺激分子在病毒根除和终止急性感染中起重要作用。IFN-γ存在于在体外RSV感染呼吸道上皮细胞可抑制病毒对表面MICA的上调。在存在IFN-γ的RSV感染下,可溶性MICA水平也被下调,这表明IFN-γ导致MICA表面水平下降不是由于细胞表面分子的蛋白水解脱落,IFN-γ可能抑制了细胞表面运输。IFN-γ下调呼吸上皮细胞MICA的生物学意义尚不清楚。我们假设感染RSV的气道上皮细胞最初上调表面MICA,导致细胞毒性NKG2D+ NK和CD8+ t细胞的激活。这些活化细胞释放的IFN-γ随后作为负反馈下调MICA表达,从而终止NKG2D+细胞的非特异性激活,防止过度的非特异性免疫激活,并允许切换到抗原特异性抗rsv适应性免疫。这一假设需要在RSV感染的动物模型中进一步研究。慢性升高的IFN-γ水平的影响尚不清楚,但是,如果与MICA对RSV感染的上调受损相关,可能导致病毒清除受损。最近有报道称,在人类肿瘤细胞中,在表面MHC I类上调的同时,IFN-γ下调了表面MICA的水平[25,26]。有趣的是,慢性阻塞性肺疾病(COPD)与过度的1型免疫细胞炎症浸润相关[7,27]。慢性呼吸道合胞病毒感染在COPD中有报道[28]和急性COPD加重与呼吸道合胞病毒感染有关[29,30.]。Borchers同事们[18,31研究表明,NKG2D配体在肺上皮细胞上表达是对氧化应激的反应,吸烟的COPD患者细胞相关MICA蛋白水平显著升高。需要进一步研究IFN-γ、表面和可溶性MICA与COPD RSV感染之间的关系。
总之,我们报道呼吸道上皮细胞的RSV感染与IL-15的产生增加和MHC I类和MICA的上调有关。这些可能对RSV感染的充分免疫反应至关重要,这些机制的失调可能导致病毒清除受损。
脚注
支持声明
这项工作得到了惠康信托基金(伦敦,英国;为呼吸道感染中心(伦敦帝国理工学院)提供063717和083567/Z/07/Z补助金,并为M.T. Zdrenghea提供Wellcome Trust旅行补助金063967);欧洲呼吸188bet官网地址学会(M.T. Zdrenghea、A.G. Telcian、C.M. Bellettato和A. Nikonova的奖学金);Asthma UK(资助02/027和05/067);英国肺脏基金会(赠款P04/13和P06/3)和英国肺脏基金会/Severin Wunderman家庭基金会项目赠款00/02;医学研究理事会(伦敦);MRC grant G0601236);英国医学协会罗斯科奖学金Telcian, V. Laza-Stanca和P. Mallia);国家卫生研究所生物医学研究中心(伦敦)资助计划; the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI; Zurich, Switzerland; C.M. Bellettato, M.R. Khaitov and A. Nikonova); Imperial College London; and Union Chimique Belge (UCB) Institute ofAllergy fellowships (Brussels, Belgium).
利益声明书
- 收到了2011年6月10日。
- 接受2011年7月28日。
- ©2012人队