摘要
囊性纤维化(CF)肺病严重程度在很大程度上独立于CF跨膜电导调节器(雌性生殖道)基因型,表明遗传改性剂的贡献。已发现趋化因子受体CXCR1和CXCR2在CF肺病的发病机制中起着基本作用。在这里,我们确定是否遗传变异CXCR1和CXCR2影响CF肺病严重程度。
分析了德国CF患者的基因组DNA(n = 442)以进行常见变化CXCR1和CXCR2使用单核苷酸多态性(SNP)标记方法。联想CXCR1和CXCR2SNP和单倍型具有CF肺病严重程度,CXCR1和CXCR2表达和中性粒细胞效应功能。
四个单核苷酸多态性CXCR1和三个CXCR2与CF患者年龄调整后肺功能密切相关。单核苷酸多态性组成单CXCR1_Ha和CXCR2_ha是高挂连的不平衡和患者的杂合CXCR1-2单体型集群(CXCR1-2与纯合野生型等位基因患者相比,肺功能较低(1 s≤70%预测,或7.24; p = 2.30×10-5).CF患者携带CXCR1-2_ha显示CXCR1的降低与CXCR2 mRNA和蛋白质表达增加,并显示出干扰的抗菌效应器功能。
CXCR1和CXCR2CF肺疾病中基因型调节肺功能和抗菌宿主防御
慢性肺疾病决定囊性纤维化(CF)患者的发病率和死亡率[1].CF肺病的特征在于细菌感染的有害反馈回路和炎症。虽然潜在的机制仍然明白,但之前的研究提供了嗜中性粒细胞在这种疾病条件下代表关键效应细胞的证据。CF气道液含有数百万激活的中性粒细胞,但这些专业吞噬细胞在其抗菌功能中效率低下[2].趋化因子(C-X-C motif)配体(CXCL)8通过其两个同源的七跨膜环g蛋白偶联受体(GPCR) CXCR1(白细胞介素-8受体α (IL-8Rα))和CXCR2 (IL-8Rβ)招募并激活中性粒细胞,这两个受体均在中性粒细胞表面高表达。CXCR1已被确定为CF肺部疾病发病机制中的关键组成部分,因为CXCR1介导CF气道中的抗菌宿主防御[2].高CXCR1表面表达水平与CF患者肺功能的保存有关反之亦然。
CF患者的疾病严重程度在很大程度上独立于CF跨膜电导调节因子(雌性生殖道)基因型,表明遗传修饰因子的贡献[3.].在CF患者中已经报道了几种基因修饰剂,包括转化生长因子β1(TGFB1)那IFRD1那MBL2.最近报道的11p13和20q13.2染色体位点[4.-8.].基于CXCR1和CXCR2在中性粒细胞炎症中的功能重要性,以及有文献记载的基因修饰物对CF肺疾病严重程度的贡献,我们假设基因变异调节CF患者中CXCR1和CXCR2的表达水平,并可能对CF肺疾病的严重程度有重要影响。
方法
病人
本研究中所有受试者及其父母或法定监护人均获得知情书面同意,所有研究方法均经当地伦理和机构审查委员会批准(Ludwig Maximilian University of Munich, Munich, Germany)。只有在过去5年中每6个月至少定期访问一次CF护理单位的受试者才被纳入我们的研究。本研究共纳入442例CF患者。CF患者人群的详细信息见在线补充表S1。CF组男性224例,女性218例,平均±sd年龄21.4±12.6岁。入选标准为通过临床症状、汗液试验阳性或疾病诱导突变、1秒用力呼气量(FEV)诊断CF1) >25%预测,并在研究前进行至少2周稳定的伴随治疗。28例患者无FEV1采血时的数据是可用的,因此这些患者不包括在FEV中1协会分析。纵向FEV.1从最少5年的CF患者数据计算的价值可用于318名CF患者,并用于计算FEV1如前所述,预测到20年代的年龄鲁坎特等。[9.].总共包括13,256 FEV1我们纵向分析中的价值。比较CXCR1 / 2.CF和健康对照人群之间的单核苷酸多态性(SNPs),我们纳入了来自KORA人群的395名健康受试者[10].KORA(奥格斯堡地区合作健康研究)是一个区域性研究平台,以人口为基础进行调查,并在流行病学、卫生经济学和保健研究领域进行后续研究[10].KORA F4研究是KORA S4研究的后续研究,KORA S4研究是1999年至2001年在德国奥格斯堡市和周围两个县进行的以人口为基础的健康调查。
定量RT-PCR
通过使用Sybr Green和Icycler IQ检测系统(Biorad,Hercules,USA)的实时定量RT-PCR,通过实时定量RT-PCR进行量化的表达水平。感兴趣基因的循环阈值被标准化为β-肌动蛋白,并用于计算mRNA表达的相对量。对于引物序列,请参阅在线补充表S2。
CXCR1/CXCR2基因分型
基于V的突变筛选选择具有次要等位基因频率> 1%的多态性。asilescu等等。[11在上述CF群体中基因分型,以研究SNP对CF肺病的影响。通过标准盐析出方法从全血中从全血中提取基因组DNA,使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(亮片,圣地亚哥,CA,USA)进行DNA样品,如前所述[12].使用光谱器软件(亮片)设计PCR测定和相关的延伸反应。特异性引物序列在线补充表S2中给出。
中性粒细胞隔离
通过Ficoll梯度离心分离来自外周血的中性粒细胞。分离后,中性粒细胞在PBS中洗涤,计数并重新悬浮在RPMI 1640或HANKS的平衡盐溶液(HBSS)中。中性粒细胞悬浮液的纯度> 93%,如May-Grünwald-giemsa染色和染色Ficoll-分离的中性粒细胞级分,与最近描述的流式细胞术的CD11b和CD16抗体测定[13那14].注意,从单个CF中心抽取外周血后立即进行处理,因此排除了运输或中心到中心的变异。
荧光激活的细胞分选分析
如前所述进行CXCR1 / 2表面染色[2].简单地说,从外周血中新鲜获得的中性粒细胞进行Fc阻断,然后与各自的单克隆抗体孵育40分钟,洗涤3次,并用流式细胞仪分析(FACSCalibur;正欲,德国海德堡)。用校准器珠来调整荧光激活细胞分选仪器的设置并使数据正常化。每个样本分析了10,000个中性粒细胞。使用BD生物科学公司(San Diego, CA, USA)的抗体在中性粒细胞上对CXCR1和CXCR2进行染色。所有染色均使用来自同一克隆的CXCR1和CXCR2抗体,并将抗体浓度归一化至中性粒细胞数量,以校正不同CF患者中性粒细胞数量的差异。从各自的特异性抗体表达中减去设定为固定阈值的同型对照,结果报告为平均荧光强度。使用Cell Quest分析软件(Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany)进行计算。
细菌杀死
如前所述评估细菌杀伤[2].粘液的临床分离物假单胞菌铜绿假单胞菌从CF患者的痰中传代培养过夜,生长到固定期,清洗并在37℃下用20%的新鲜c5a耗尽人血清混合孵育60分钟预调理。在PBS中洗涤两次后,调理蛋白发生变化P.铜绿假单胞菌将细菌重悬于1 mL含0.1%明胶和胰蛋白酶大豆肉汤的HBSS混合物中(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)。中性粒细胞在37°C与细菌(2×107.细菌·毫升-1),每个中性粒细胞有五个细菌。其中,CXCL8 (100 nM)被添加到检测中以刺激CXCR1功能。在规定的时间内,每一种混合物的等价物都被除去P.铜绿假单胞菌通过蒸馏水中的连续稀释来计算菌落和定量涂布电镀。数据表示为每毫升形成菌落形成单位。
呼吸爆发
中性粒细胞等密度孵育(2×106.·ML.-1), 37℃双氢丹明-123染色20分钟。N然后将甲基硫氨酸 - 亮氨酸 - 苯丙氨酸(1M)在37℃下加入到细胞中30分钟。其中,CXCL8 (100 nM)被添加到检测中以刺激CXCR1功能。通过使用流式细胞术测量罗丹明-123荧光强度来分析中性粒细胞的呼吸爆发。
统计分析
将衍生的基因型频率与基于Hardy-Weinberg平衡测试(Pearson Chi-Squared)进行控制的预期等位基因群体平衡进行了比较,以控制技术基因分型误差。通过使用Pearson Chi Squared首次测试SNP和定性结果之间的关联[15使用主导模型,Fisher的确切测试。用双面未配对的T检验进行两次患者组中定量结果的比较,而使用ANOVA进行两组以上的多种定量结果的比较。为了测试复杂模型中的SNP和结果之间的关联,逻辑回归用于定性结果和定量结果的线性回归。据报道,对于数量的回归系数B和β系数,据报道了多种异数结果的差异比率和95%的置信区间。多变量分析用于调整潜在的混杂因子(年龄,性别,CFTR基因型和P.铜绿假单胞菌).使用期望最大化算法估计单倍型频率[16].为了指定单个单舱的效果,我们进行了单倍型趋势回归,其中单倍型的估计概率在作为独立变量的逻辑回归中建模[17].要考虑多种比较,执行了Bonferroni调整。P值为<0.002(24个测试中的0.05个)被认为是统计学意义的。在指示的情况下,数据显示为平均值±SEM.。所有基团中的比较都是通过ANOVA进行的,并且使用双面T检验进行两种患者组之间的比较。用棱镜4.0(Graph Pad软件,圣地亚哥,CA,USA)绘制了图表。统计分析与STATA版本8.2进行用于Windows(Stata Corporation,TX,USA)和PASW版本18.0 for Mac(Spss Inc.,芝加哥,IL,USA)。
结果
在CF患者中分离的外周血中性粒细胞中观察到的CXCR1和CXCR2的表达水平显示了mRNA和蛋白质水平的两个不同的表达群体(图1a和b).基于CXCR1和CXCR2 mRNA和蛋白表达的高变异性(图1a和b[和数据未显示),我们开始评估基因热点是否在CXCR1和CXCR2基因(11]在特征明确的CF患者队列中与CXCR1/2表达水平和CF肺疾病严重程度相关(表1).191 CF患者均合并ΔF508,129是CFTR的ΔF508等位基因的杂合载体,122雌性生殖道除ΔF508之外的突变。246名患者为阳性P.铜绿假单胞菌微生物学(至少连续两次痰标本中分离的细菌,间隔至少6个月)。21个SNPs标记CXCR1和CXCR2基因座进行基因分型(表2).所有多态性的基因型分布一致,与硬质 - Weinberg平衡(P> 0.1),并且呼叫率范围为89.1至99.1%。次要等位基因频率CXCR1 / CXCR2.与年龄匹配的健康对照人群相比,CF人群的SNPs没有显著差异(在线补充表S3)。我们发现了四个多态性CXCR1还有三个多态性CXCR2与年龄调整后肺功能强烈相关[9.]在CF患者(表1).单倍型的患者CXCR1_HA或单倍型CXCR2_Ha (SNP簇杂合子)显示年龄调整后的纵向肺功能(FEV)显著降低1)比纯合的患者对CXCR1_哈(FEV.1≤70%pred,或= 4.90)或CXCR2_ha(fev.1≤70%pred,或= 3.80)(表2).有趣的,SNP包括单倍型CXCR1_Ha和CXCR2_Ha的连锁不平衡程度非常高(而是1C).因此,为组合的单倍型发现了降低肺功能发育的甚至更高的风险CXCR1-2_Ha与纯合子携带者相比CXCR1-2_ha(fev.1pred≤70%pred,或7.24)(表2).CF患者携带CXCR1-2_与Ha单倍型相比,外周血中性粒细胞中CXCR1 mRNA和蛋白水平显著降低,CXCR2 mRNA和蛋白水平显著升高CXCR1-2_HA CF个人(而是1D和E.).遗传效应CXCR1-2_CXCR1和CXCR2 mRNA或蛋白表达的Ha单倍型不依赖于循环血清CXCR1/2配体水平、中性粒细胞凋亡或中性粒细胞激活状态(数据未显示)。
CXCR1 / CXCR2表达配置文件和CXCR1/CXCR2囊性纤维化(CF)患者的单倍型。a)采用实时RT-PCR技术定量CF患者外周血中性粒细胞中CXCR1、CXCR2 mRNA表达水平。b)荧光活化细胞分选法定量CF中性粒细胞CXCR1和CXCR2蛋白表面表达水平。MFI:平均荧光强度。c)区位和连锁不平衡(R2和D ')CXCR1和CXCR2CF人群的基因型多态性。在这个图中,每个方格代表两个单核苷酸多态性(SNPs)和各自的R之间的成对比较2在每个方格内给出。较深的正方形颜色表示较大的D'值,最大为1。SNPs按顺序编号,从5 '到3 ',其相对位置如图所示。d) CF患者HA或HA单倍型的CXCR1和CXCR2 mRNA和e)蛋白表面表达水平。**:P <0.01。
为了确定这些基因变异是否影响中性粒细胞效应的功能,我们分析了CXCR1-和cxcr2介导的抑菌中性粒细胞功能CXCR1-2_Ha单倍型,特别是cxcr1介导的呼吸爆发和细胞内杀伤P.铜绿假单胞菌[2].事实上,患者携带的中性粒细胞CXCR1-2_Ha显示cxcr1介导的抗菌功能降低(图2).
CXCR1/CXCR2囊性纤维化(CF)患者的单倍型调节抗菌中性粒细胞功能。a,b)从HA (n=3)或HA (n=3)单倍型CF患者中分离中性粒细胞,CXCR1-和cxcr2介导的中性粒细胞效应功能如前所述进行分析[2].a)CXCR1介导的呼吸突发通过荧光激活的细胞分选测量。在37℃下用二氢倍胺-1,2,3(DHR)染色20分钟后,用细胞刺激细胞N-甲酰基-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(1 M)在CXCL8 (100 nM)存在下再持续30分钟,并用流式细胞仪分析呼吸爆发。结果显示为中性粒细胞总体的平均荧光强度(MFI)。b) cxcr1介导的杀伤假单胞菌铜绿假单胞菌。孤立的嗜中性粒细胞与oppsonised孵育P.铜绿假单胞菌在CXCL8(100nM)存在下,每种嗜中性粒细胞的5个细菌的比例为150分钟。**:P <0.01。
讨论
我们的结果为临床相关的作用提供了强大的遗传和功能证据CXCR1和CXCR2单倍型在改变CF肺疾病中的作用既往研究发现CXCR1是CF肺疾病炎症维持和持续的关键成分[2]:中性粒细胞上的CXCR1介导细菌杀伤,但在CF呼吸道中受到损坏,从而有利于感染和维持自动炎症。这些研究表明,高CXCR1蛋白表达水平对CF患者的肺功能具有保护作用。受这些调查结果的启发,我们系统地分析了协会CXCR1/CXCR2snp和单倍型与CF肺病严重程度的候选基因关联研究这些基因调查确定了一个CXCR1 / CXCR2.单倍型群集对CF患者肺功能和中性粒细胞功能有显著影响。
用于CF肺病的额外遗传改性剂,包括TGFB1那IFRD1和MBL2.[4.-7.]先前描述过。最初,提出了TGF-β1作为CF调制器的作用,其中提出了一种情况控制设置的研究[6.].然而,进一步的研究表明,风险等位基因的指定TGFB1在研究之间变化,最重要的是由于传动比失真和母体混淆效应,因此需要谨慎解释[18].随后的基因组扫描仅能够识别IFRD1作为CF修饰符。有趣的是,IFRD1多态性也与中性粒细胞效应函数的变化显着相关[7.].最初,研究MBL2.由于CF疾病修饰者产生了不一致的结果[6.那19那20.].然而,最近的荟萃分析,考虑到大多数可用的数据集,支持MBL2.作为CF肺病的主要改性剂[21].在最近的全基因组方法中,11p13染色体上的两个重要位点(EHF-APIP区域)和20Q13.2被确定为CF的生物相关性的港口基因[8.].由于CXCR1,CXCR2,IFRD1和TGF-β1的不同功能,[22那23[作为染色体11P13和20Q13.2上的候选基因仍未认定,在遗传,表达和功能水平下这些潜在的CF肺病改性剂的比较是本研究的范围。然而,对其不同的染色体位置不太可能对关联结果的相互遗传影响(CXCR1 / 2.2,从而向IFRD1CHR 7和TGFB1科19)。需要进一步的研究来确定它们之间的相互关系和对CF肺疾病的贡献。
超越统计关联CXCR1 / CXCR2.单倍型集群在我们的研究中纵向肺功能,我们发现携带单倍型聚类的CF个体显示出干扰的抗菌效应官能团,特别是CXCL8诱导的反应性氧物质以及CXCL8诱导的杀伤P.铜绿假单胞菌。这些研究表明所描述的CXCR1 / CXCR2.单倍型簇可通过中性粒细胞先天效应器功能的缺点调节CF患者的肺预后。
本研究的主要局限性是纳入CF患者的数量。因此,由于本研究是基因关联的第一份报告,这些结果必须由其他CF群体的独立研究者来证实。FEV的分布比较1等位基因群之间的值证实了四种多态性之间的强关联CXCR1还有三个多态性CXCR2经年龄调整的肺功能(表1).有趣的是,我们观察到大多数的次要等位基因频率CXCR2SNPs高于CXCR1SNPS(表1).类似的MAF分布CXCR1和CXCR2SNP已经在对照队列中逐出vasilescu等等。[11].ΔF508纯合的频率,ΔF508杂合和非ΔF508CF患者在HA和HA载体之间没有显着差异。线性回归分析显示雌性生殖道基因型没有混杂效应CXCR1/ 2观察到单倍型。
一起携带,我们已经确定了一个CXCR1 / 2.是与肺功能在CF患者相关联,并且协同单倍型聚类影响mRNA和蛋白的表达,从而调节嗜中性粒细胞的效应子功能。随着CXCR1和CXCR2都是GPCR,我们的结果可以为治疗CF肺病提供新的药理学方法。
脚注
本文提供了补充材料www.www.qdcxjkg.com.
支持声明
由德国研究基金会(DFG,EMMY Noether Program Grant Ha 5274 / 3-1)提供支持,德国儿科气动学会,Pina E.v。和诺华基金会。所有资金都被授予D. Hartl。
感兴趣的语句
D. HART的利益声明可以找到www.www.qdcxjkg.com.网站/ misc /语句。
- 收到2011年7月29日。
- 接受2011年9月21日。
- ©2012年