摘要
从欧洲的早期肺癌生物样本库非小细胞肺癌样本进行分析,以评估突变的预后意义TP53,喀斯特和EGFR基因。
研究对象包括11名从不吸烟的人、86名已戒烟的人、152名正在吸烟的人以及1名不吸烟的人。鳞状细胞癌(SCCs) 110例,腺癌(adc) 133例,大细胞癌或混合组织7例。免疫组化分析p53表达情况。从冷冻的肿瘤组织中提取DNA。
TP53的情况下为48.8%,进行检测,并分别比的SCC的ADC(P <0.0001)之间更频繁的突变。TP53突变状态与预后无关。已知与吸烟有关的G to T转位在发生第二原发肺癌或复发/转移(进展性疾病)的患者中更为常见。EGFR突变几乎只在从不吸烟的女性中发现(p=0.0067)。喀斯特在18.5%的病例中检测到突变,主要是ADC (p<0.0001),并显示出与疾病进展状态相关的趋势。
这些结果表明,突变是肺癌的不同病因和组织病理学形式的良好标记,但几乎没有预后价值,除了喀斯特突变,这可能对ADC的预后价值。
非小细胞肺癌的癌症(非小细胞肺癌)的开发是根据病因学和组织学类型[伴有多种遗传和外遗传改变,以一定的差异1,2]。的139个NSCLC细胞系的调查已确定的频繁突变的基因,可以是用于激活突变的基础上,非小细胞肺癌分层有用的面板。这些基因包括KRAS,EGFR,ALK,MET,PDGFR,ROS,ERBB2,BRAF PI3K和MEK1[3]。最常见的突变,这些基因是EGFR和喀斯特(后者多见于腺癌(ADC),且相互排斥)。EGFR编码一个表皮生长因子和相关配体的跨膜受体,其中包含一个胞内酪氨酸激酶域。突变几乎只在不吸烟者的肺癌中发现,并聚集在激酶结构域,构成激活其活性和信号转导。喀斯特编码GTP/GDP交换因子,作为EGFR信号的下游效应因子,介导生长促进激酶级联信号的激活。突变主要发生在密码子12处,位于GTP结合囊中,阻止GTP水解。
除了这些激活突变失活突变TP53在大多数非小细胞肺癌进行检测。TP53编码全方位肿瘤抑制转录因子,p53,其介导响应于多种胁迫,包括,特别是,DNA损伤的多种抗增殖作用。大多数已知的突变落入DNA结合结构域内和停用通过防止DNA结合和反式激活的抑制。有证据表明,TP53要么喀斯特吸烟者NSCLC的易位突变多发生在G碱基,通常是烟草致癌物主要家族之一的多环芳烃代谢物加合物形成的位点[4-6]。这些观察表明,至少一些这些突变可能由于暴露于烟草烟雾的结果发生,并且先于癌症的发展,因此具有在肺癌发生的分子和生物图案的影响。然而,在临床预后这些突变的影响仍然是一个有争议的问题。
我们研究的目的是探讨突变在预后的影响TP53,喀斯特要么EGFR在切除,早期非小细胞肺癌,并评估其疾病进展的生物标志物的使用。我们把欧洲早期肺癌的优势(EUELC)项目和生物样本库[7,8]选择一组具有良好质量的冷冻组织的患者。EUELC患者来自8个欧洲国家的12个中心,术后随访6个月。我们表明,TP53和EGFR突变虽然在这些癌症中很常见,但其预后价值有限(如果有的话)喀斯特突变可能与进展性疾病(PD)状态有关。
材料和方法
研究对象和肿瘤
EUELC项目是由法国、德国、爱尔兰、意大利、荷兰、波兰、西班牙和英国的12个中心参与的合作项目。本研究招募了762例经手术切除的原发肺癌患者,这些患者被认为极有可能发展为第二原发肺癌(SPLCs)和/或转移,这与职业或生活方式的风险因素有关。其中739例进行了疾病进展评估,并以6个月为间隔进行了长达48个月的随访(中位数为29个月)。所有患者在每次随访时完成一份生活方式和医疗问卷。有完全切除的原发肺癌或头颈癌病史、发生SPLC、复发或转移、或死于该疾病的患者被归类为PD。在最后一次随访时,患者仍存活且无症状,且未接受化疗和/或放疗,被归为无病(DF)。有关吸烟和职业的数据是通过一份标准化的生活方式问卷收集的。编制了采访和编码的说明,并在每个中心对研究采访者进行了培训。所有问卷都翻译成英文,以确保整个欧盟伙伴的一致性。
免疫组化法检测p53共有306个样本(图1)。273个冷冻组织用于DNA提取和突变分析。最后选择随访状态已知的250例患者进行统计学分析TP53和喀斯特。该系列包括11从不吸烟者(<100支在一生熏制),86名以前吸烟者(戒烟≥2诊断之前年),152名当前吸烟者(仍然吸烟或自停止<2岁)和没有已知的吸烟状况一个患者。有记录为“其他组织学”(大细胞癌或混合组织学)110个鳞状细胞癌(SCC的),133级的ADC和7。EGFR早前有报道称,除了ADC和吸烟者外,该基因在非小细胞肺癌类型中很少发生突变[9]。
突变分析
接收并分析先前从冷冻组织中提取的DNATP53与如其他地方所述变性之后的第二PCR和双向自动化测序高压液相色谱法(DHPLC)(外显子4-10包括侧翼剪接位点)通过突变预筛分[10]。与匹配的dHPLC和测序结果标本被认为含有突变。喀斯特如其他地方所述,对第12密码子的突变进行了突变体富集PCR分析[10],允许突变体序列的富集,并进行测序。
EGFR使用引物和其他地方描述的退火条件对酪氨酸激酶域的四个外显子(外显子18-21)进行基于pcr的直接测序来检测突变[11]。
p53免疫组化方法如前所述[12使用文塔纳自动免疫染色剂(文塔纳公司,图森,亚利桑那州,美国)与指定的程序和试剂。染色肿瘤细胞百分率按0 - 4分(0分,无;1、< 10%;2、10 - 50%;3,50 - 90%;4,> 90%)。染色强度在0(无)到3(标记)的范围内进行评估。将百分比和强度的结果相加,得出综合评分:0分,无染色(0分);1 - 3个,轻度染色(1分);4-5例,染色中等(2分); and sum of 6–7, marked staining (score 3).
统计分析
Mantel-Haenszel卡方检验用于检验临床参数与生物标志物之间的关系,以及生物标志物之间的关系。细灰色模型[13]被用来衡量临床变量和癌症进展的生物标志物之间的相关性。该模型考虑了竞争风险的存在,在我们的研究中,竞争风险是死于肺癌以外原因的患者。在精细模型和灰色模型中,危害比(HRs)可以用与相对风险相同的方式来解释。通过Bootstrapping获得风险估计的非参数置信区间。根据随访时间的分布,我们在48个月时审查了分析结果。每个生物标志物在一个多变量模型中一次评估一个,在单变量分析中,调整与疾病进展风险显著相关的临床变量。根据基因的突变状态,通过累积发病率图来说明疾病随时间进展的风险。
使用Cox比例风险模型,以评估总体死亡,肺癌特异性死亡和生物标志物之间的关联,进行标准存活分析。进行与死亡相关的临床参数调整。所有的分析是由中心分层。所有统计分析均使用SAS统计软件,版本9.1.3(SAS公司,卡里,NC,USA)进行。
结果
患者、突变患病率和与个体和病理参数的关系
患者选择的特性示于表1和突变流行率示于表2。共有48.4%TP53基因突变,包括五点沉默突变进行检测。喀斯特12位密码子的突变和EGFR分别在18.5%和13.1%的样本中检测到突变。18例患者有两个基因突变(表2),包括11名患者TP53和喀斯特突变和六个患者兼有TP53和EGFR突变。一个病人喀斯特突变也有EGFR沉默突变的外显子21(密码子836,CGC>CGT Arg>Arg)。三种基因均未发生突变。
突变的模式TP53显示在网上补充图S1。TP53突变和密码子分布与已知的吸烟模式[协议4],其中在G中> C至T>在密码子157甲颠换和热点和158的突变的〜33%EGFR被测试的四个外显子之间传播(外显子18 4%,外显子19 3%,外显子20和外显子21 5%3%)和所有先前在体细胞突变在癌症中的目录(COSMIC)突变数据库报告[14]。表3显示突变与选定的病理或个体变量之间的联系。TP53ADC的突变频率(39.7%)低于SCC (57%);p < 0.0001 (表3)。喀斯特ADC(89.1%)较SCC(10.9%)更容易发生突变(p<0.0001) (表3)。这些突变均与肿瘤TNM分级的T或N状态无关。TP53突变在报告有肺部疾病史或肺癌家族史的受试者中更为常见,但这些相关性没有统计学意义(在线补充表S1b和S1c;p=0.1505, p=0.1620)。吸烟状况和接触石棉史均与此无关TP53要么喀斯特突变状态。没有显著的关联被发现之间TP53突变与吸烟持续时间、开始吸烟时的年龄、包年消耗量、戒烟后的时间或卷烟类型(数据未显示)。在EGFR在从不吸烟的女性中发现23.5%的突变(p=0.007) (表3)。
之间的关联TP53突变与p53表达
错义TP53突变可能导致p53突变蛋白的核积累。230例患者同时获得突变状态和p53免疫组化信息。突变状态与p53免疫组化有很强的相关性(p<0.0001;在线补充表S3)。在突变的肿瘤中,有62%的p53蛋白呈高阳性。在野生型肿瘤中TP53然而,在整个肿瘤中,有25%的p53广泛、高表达,这表明p53可能在一些肺癌中广泛表达,而在外显子4-9中没有错义突变。
突变的预后意义
其中PD占26.4%,DF占73.6%。与PD状态(数据未显示)显著相关的参数有:TNM的T状态(T1)与T2或更多;p<0.0001), TNM (N0)的N状态与N1 N2或NX;p < 0.0001)。TP53,喀斯特要么EGFR突变状态,但是,并没有与预后相关(图2)。根据突变对p53蛋白结构或功能的预测影响将突变分为不同的类别,未发现有预后价值[15]。G>T移植在PD患者中比DF (表4),但该效应不是统计上显著(调整的HR 1.49; 95%CI 0.66-3.36; P = 0.13)。
p53免疫组化阳性与预后无关(p=不显著)。由于各国和各中心在病人招募方面存在重大差异,我们对最大的同质亚群重复了这些分析,该亚群包括来自法国各中心的103名病人(Nancy和Grenoble)。同样,在这个子群中,两者都不是喀斯特也不TP53突变有预后价值(结果未示出)。然而,患者用含有突变的肿瘤有开发一种PD(调整的HR 3.30; 95%CI 1.08-10.0; P = 0.036)的轻微显著风险较高。
TP53突变与TP53多态性
该TP53基因是高度多态性,有证据表明,在不同的不同的费率可能会发生突变TP53等位基因。我们分析了三种常见的多态性分布在312-basepair区TP53编码基因p53的N末端,在与相对于TP53突变状态。这三个多态性分别是PIN2 (G to C,内含子2,rs1642785)、PIN3 (16-basepair重复,内含子3,rs17878362)和PEX4(非沉默的G to C,密码子72,R to P;rs1042522)。结果(表5)表明,携带编码P的两个PEX4 C等位基因(编码P的两个PEX4 C等位基因在72密码子上的突变有增加的趋势(G-C杂合子中有85.7%,G-G纯合子中有43.9%,G-G纯合子中有46.6%);p = 0.05)。其他两个多态性似乎与突变患病率的显著差异无关(数据未显示)。
讨论
许多研究调查的预后价值TP53要么喀斯特突变的肺癌。有证据表明,这两个图案和突变的频率根据风险因素如烟草烟雾而变化。但是,目前还不清楚是否突变与疾病进展的风险增加和不利结果的关联。在这里,我们使用了大量的欧洲合作研究的设置,EUELC,评估预后价值TP53和喀斯特突变与详细的后续信息的一系列的250例非小细胞肺癌。我们分析之间的关系TP53突变和几种常见TP53多态性。最后,我们进行了评估EGFR在130级的ADC突变,因为这种基因突变已被报道在其他肺癌的组织学类型[稀有16,17]。
结果表明,TP53变异占48.4%喀斯特18.5%的病例中有突变。对于这两个基因,密码子的分布显示了高比例的G到T的转位,这与有充分记录的吸烟者肺癌中这种突变类型的流行相一致。我们还观察了非小细胞肺癌的两种主要组织形式SCC和ADC的差异。TP53在SCC的57%进行检测突变与adc的39.7%。相比之下,喀斯特在89.1%的ADC中检测到突变与10.9%的鳞状细胞癌。如其他案例系列所示,喀斯特突变在曾经吸烟者和从不吸烟者中更常见(分别为52.2%、45.7%和2.2%)。在临床和病因学因素中,只有组织学与突变患病率有统计学意义,而不吸烟与突变患病率有显著相关性EGFR变异(p = 0.0067)。一个肿瘤包含两个EGFR和喀斯特突变,根据文献极为罕见发生。有趣的是,EGFR在该肿瘤突变是一个沉默一个(密码子836 CGC> CGT精氨酸>精氨酸)和由此不应该导致酪氨酸激酶活化。
在本病例系列中,所分析的三个基因中没有一个突变在队列中具有显著的预后价值,无论是在整体上还是在特定的组织学亚组中。考虑到这项研究的多中心特征和由于不同的招募中心而可能存在的偏见,我们对最大和最相似的亚群进行了单独分析,结果显示在同时携带这两种病毒的患者中存在边缘性影响TP53和喀斯特突变(HR 3.26; 95%CI 1.07-9.90; P = 0.038)。这些分析的值由相对较小的样本大小的限制,这将是重要的,以验证在较大的同伙这种解释。
类似我们的研究结果,对日本患者手术切除ADC研究没有发现任何预后含义TP53要么喀斯特突变[18]。作者发现了两者之间的重要联系EGFR突变,延长生存期,而没有基因突变的似乎是一个独立的预后标志物。值得注意的是,在日本系列,患者49%有EGFR突变,比目前的高加索系列高得多(13.1%)。有充分的文献记载,突变在EGFR与不吸烟的身份、女性性别和亚裔种族有关[16-18]。相对较低的患病率EGFR在我们的系列突变可能反映在EUELC招募病人的特点,即高加索人,84层%的男性和95.2%,曾经吸烟者。鉴于这些特点,EGFR突变显示出高于预期的比率,而且它并不局限于从不吸烟的NSCLC患者,因为在前吸烟者(48人中有5人)或现吸烟者(72人中有8人)中检测到10%的突变。
基于这些结果,保守的结论是,突变状态不完全切除后的短期预测结果肺癌,肺癌的总体预后不良的5 - 8年,还有待决定它是否可能是一个长期的预后因素的结果。
从生物学的角度来看,TP53和喀斯特突变可以表示非常早期事件在肺癌发生,肿瘤发病如烟草组分遗传损伤的结果之前发生。虽然这些突变不参与发起对转型和发展支气管细胞,很可能是肿瘤的行为可以通过特定的被决定的,由烟草致癌物开始后发生的其他事件。我们发现同时携带该肿瘤TP53和喀斯特突变可能有一个更差的预后,这强调了一个可能较高的接触烟草致癌物或特定的易感性,他们的诱变作用。这些患者获得额外突变的风险可能增加,这反过来可能是他们预后较差的原因。因此,两者都存在TP53和喀斯特同一病变的突变可能作为一个标记,以确定一小群肿瘤的遗传不稳定和易于积累突变,这可能会加速疾病的进展和/或逃避治疗。需要进一步的研究来确定NSCLC中这种遗传不稳定性的靶点。候选标记可能涉及具有激活突变的基因,使使用选择性药理学抑制剂治疗这些癌症成为可能[3],以及DNA甲基化模式和microRNA表达的表观遗传学变化,这些变化可能会区分不同的NSCLC亚群[19]。
我们的数据TP53多态性表明,TP53突变往往以不同的速率发生在不同的地方TP53等位基因。虽然本组病例较少,患者有两个PEX4Ç等位基因倾向于更频繁地有TP53突变比患者至少有一个G等位基因。这表明TP53与G型等位基因相比,C型等位基因可能在本质上更“易变”,这可能是p53蛋白功能特性细微差异的结果。实验研究已经确认了这些功能上的差异,包括72P比72A更能诱导细胞凋亡[20.]。这一观察结果与Mechanic等。[21],谁发现在共同的遗传变异TP53可以调节肺癌途径,通过协会的建议TP53codon 72多态性与非裔美国人肺癌和体细胞肺癌的关系TP53肺癌的突变频率。因此,在未来的研究中,这可能是重要的考虑两者TP53突变和TP53单倍型在评估的预后和预测意义TP53在肺癌的基因状态。
致谢
EUELC联盟的成员如下。(利物浦大学癌症研究中心,利物浦大学转化医学研究所,英国利物浦);C. Brambilla (INSERM U823格勒诺布尔,法国);Y. Martinet(法国南茜大学中心医院);E. Thunnissen (Canisius Wilhelmina Ziekenhuis, Nijmegen, the Netherlands);P.狙击手(荷兰阿姆斯特丹自由大学大学医院);G. Sozzi(意大利米兰纳粹学院实验肿瘤学系);A. Risch(德国海德堡癌症研究中心,德国);S. Elborn(贝尔法斯特市医院,贝尔法斯特,英国);L.M. Montuenga(西班牙潘普洛纳纳瓦拉大学); K. O'Byrne (St James Hospital, Dublin, Ireland); D.J. Harrison (University of Edinburgh, Edinburgh, UK); and J. Niklinski (Medical Academy of Bialystok, Bialystok, Poland).
脚注
这篇文章有提供补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项研究部分得到了法国国家癌症研究所(INCa)的PNES肺癌规划的支持。欧洲早期肺癌研究得到了欧盟框架V基金的支持(QLG1-CT-2002-01735)。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到2011年6月7日。
- 公认2011年11月4日。
- ©2012人队