摘要
脱氢表雄酮(DHEA)预防大鼠慢性缺氧诱导的肺动脉高压和相关的右心室功能障碍。在该动物模型中,缺氧后复氧可逆转肺动脉高压,但不能逆转右心室功能障碍。因此,我们研究了DHEA在复氧后对右心室的影响,即。在大鼠慢性缺氧继发于常氧恢复期后。
评估右心室功能在活的有机体内多普勒超声心动图和在体外在三组动物中进行隔离灌注心脏技术:对照组,恢复期(21天缺氧,21天恒氧)和恢复期脱氢表雄酮(30 mg·kg)−1在恢复阶段每2天一次)。用光学和电子显微镜观察右心室组织。
DHEA消除了右心室舒张功能障碍,因为超声E波保持接近对照组(平均±sd76.5±2.4和79.7±1.7 cm·s−1而恢复组则降低至40.3±3.7。DHEA还可以消除右心室收缩功能障碍,这可以通过抑制离体心脏压力-体积曲线斜率的增加来证明。DHEA效应与心肌细胞增殖有关。
总之,DHEA通过防止心肌细胞改变来预防右心室功能障碍。
典型的慢性肺低氧血症疾病,如慢性阻塞性肺病[1],可导致肺动脉高压,最终导致右心室功能衰竭[2- - - - - -4].暴露于慢性缺氧(正常或高压氧)的啮齿动物构成了一种经典动物模型,用于研究这种肺血管疾病的机制和治疗靶点[5,6].在低气压慢性缺氧的大鼠模型中,我们先前已经证明脱氢表雄酮(DHEA),一种肾上腺类固醇,可以预防和降低低氧PH值和相关的右心室肥厚[7].在同一动物模型中,缺氧后的复氧,即。继发于21天慢性低氧期的21天的常氧恢复期也逆转了PH值,因为它使肺压正常化并拮抗血管重塑[8].然而,这样的正常恢复期并不能纠正右心室功能障碍[9].我们认为,这样的实验模型可能与慢性阻塞性肺病患者相关,因为他们可能在与病情加重相关的连续严重缺氧发作之间交替出现[10]和较少的缺氧事件与他们的氧治疗有关[11].
如前所述,脱氢表雄酮已在动物[7,12]和人体PH值[13,14].最近,已有研究表明脱氢表雄酮可以调节心脏功能。脱氢表雄酮逆转左心室僵硬和纤维化,这通常伴随小鼠衰老[15],并减少心脏成纤维细胞产生I型胶原蛋白[16].脱氢表雄酮还可以调节大鼠心脏的氧化应激[17].
因此,这项研究的目的是评估在这个慢性缺氧模型中,脱氢表雄酮对右心室的影响,即。然后是大鼠的正常氧恢复期。我们检查了脱氢表雄酮对右心室结构和功能再氧合的额外影响在活的有机体内而且薇芙交货o.还确定了DHEA激活的信号通路。
方法
动物模型和脱氢表雄酮治疗
调查是在与政府的协议下进行的《实验动物护理和使用指南》[18]及欧洲指令[19].成年雄性Wistar大鼠(220-240 g)随机分为三组。第一组大鼠在低气压室中保持21天,以诱导慢性低氧PH值,如前所述[7],随后常氧治疗21 d(恢复组);第二组大鼠同样在低气压室中饲养21天,然后在常氧条件下饲养21天,同时给予脱氢表雄酮(30 mg·kg)−1在恢复期(恢复期-脱氢表雄酮组)。将这两组与正常大气压下的对照组进行比较。
心脏组织重量比评价及超声心动图
右心室肥厚指数为右心室重量与左心室重量加室间隔重量之比;如前所述,计算右心室质量指数为右心室重量与体重之比[20.].超声心动图多普勒成像如前所述[9].右心室缩短分数估计为((舒张末期直径-收缩末期直径)×100)/舒张末期直径。用E波和E/A峰值速度比评估右心室舒张功能。在心尖四腔位上记录三尖瓣的脉冲波多普勒(A波和E波)。
心脏离体灌注技术
心脏隔离灌注技术如前所述[9].
组织学测量
光学和电子显微镜检查如前所述[7].右心室组织用4% (w/v)甲醛固定,3 μm厚切片用苏木精、伊红、藏红花染色。每心室肌细胞数量(N)的估计公式为:N=(肌细胞体积fraction×ventricular体积)/中位肌细胞体积[21].所用心肌细胞体积分数为75%,心室容积计算为心室重量除以心室比重(1.06 g·cm)−3).
活性氧含量测定
用电子顺磁共振技术对右心室组织进行活性氧的测量,并如前所述进行[22].
线粒体活性测定
如前所述,对右心室组织进行复合物1和柠檬酸合酶活性测定[23].
西方墨点法
如前所述,对右心室组织进行Western blotting [23].对抗呼吸链复合物III核心2和F的抗体1F0三磷酸腺苷(ATP)合成酶从Mitoscience (Eugene, OR, USA)获得。caspase 3、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活物1α (PGC1α)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗体来自Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz, CA, USA)。.抗磷酸环腺苷单磷酸反应元件结合(CREB)和抗增殖细胞核抗原(PCNA)从Abcam生物化学公司(Bristol, UK)获得。
细胞增殖与凋亡
组织固定在磷酸盐缓冲的4%甲醛和石蜡包埋中。使用基于图像的定量分析系统(NanoZoomzer数字病理图像软件;Hamamatsu Photonics France, Massy,法国)。研究人员在每只动物身上追踪了50个肌细胞的轮廓。细胞增殖和凋亡检测如前所述[24].增殖心肌细胞在PCNA与desmin共免疫染色的基础上进行鉴定。抗pcna单克隆抗体来自Calbiochem/Merck (Darmstadt, Germany)。根据制造商说明书,使用ApopTag过氧化物酶试剂盒(Millipore, Billerica, MA, USA)检测凋亡心肌细胞。盲法对编码标本进行定量形态学处理。组织切片采用系统随机场采样(0.143 mm)进行扫描2用亮场显微镜和数字图像采集系统(奥林巴斯,东京,日本)捕获的校准场。11-24(平均±扫描电镜每个标本通过整个组织切片采样18.1±1.2)场,PCNA+细胞核的数量参照样本表面积。其他地方发表的小鼠哮喘模型的肺组织切片[25]作为末端脱氧核苷酸转移酶三磷酸脱氧尿苷划痕末端标记(TUNEL)+对照标本进入染色批次。
数据分析
数据值以均数±表示扫描电镜.使用NCSS 5.0软件(NCSS, Kaysville, UT, USA)进行统计分析,同时酌情采用Kruskal-Wallis方差分析评估组间差异。在两种条件比较的实验中,如采用未配对曼-惠特尼检验。N为相关实验动物样本量。当p<0.05时,认为数据差异显著。
结果
脱氢表雄酮可改善常氧恢复期继发的右心室功能障碍
体内,采用多普勒超声心动图评估右心室收缩(缩短分数)和舒张(三尖瓣E波和A波)功能(每种情况n=5)。在基础条件下,各组间右心室缩短分数无差异。恢复组E波明显降低(40.3±3.7)与79.7±1.7厘米·s−1, p<0.001), DHEA处理显著阻止了这一效应(76.5±2.4 cm·s)−1, p<0.001) (图1一个).同样,恢复组E/A波明显升高(1.3±0.2)与0.4±0.01,p<0.001),而DHEA治疗显著阻止了这种影响(0.4±0.08,p<0.001) (图1 b).
体外,在无右心室负荷的情况下,使用孤立灌注心脏技术进一步评估右心室收缩和舒张功能(每种情况n=5)。恢复条件增加了大舒张容积的收缩压(80、140、160和180 mL;p < 0.001) (图1 c),而DHEA处理显著降低了这种效应。对于大的舒张容量,恢复条件也增加了舒张压(80-180 mL, p<0.001) (图1 d),而DHEA也降低了这种效果。
脱氢表雄酮通过刺激心肌细胞增殖改善正常氧复期间右心室心肌细胞密度
右心室肌细胞密度(以每毫米核的数量来评估2)通过光学显微镜研究(每只大鼠9张幻灯片)。恢复组平均心肌细胞密度低于对照组(4.77±0.33)与(8.56±0.32,p<0.001), DHEA治疗可显著抑制该效应(6.77±1.08,p<0.05) (图2).对肌细胞总数的估计也进行了测定,并显示各组之间有相同的差异(表1).为了确定肌细胞密度下降是否与肌细胞减少或肌细胞肥大有关,测定了右心室肥大指数、右心室质量指数和肌细胞横截面积。恢复组和恢复-脱氢表雄酮组(表1).此外,各组间心肌细胞横截面积无差异(表1).因此,肌细胞密度的降低与肌细胞的减少有关。
为了检验DHEA的保护作用,采用TUNEL+染色技术和Western blotting(裂解caspase 3)研究细胞凋亡。TUNEL+细胞的代表性野区极为罕见,两组间无差异;Western blot比较caspase 3激活无显著性差异。PCNA染色(图3 a - c(8.6±1.6 cells·mm)−3)与恢复组(12.1±1.8 cells·mm)比较−3, p<0.05),并通过Western blot (图3 d).
脱氢表雄酮可防止常氧恢复引起的线粒体破裂
在第一组实验中,恒氧恢复和脱氢表雄酮处理对:1)每个细胞区域线粒体切片的数量;2)线粒体截面积;3)基体密度。在6000倍的放大倍率下,随机选取一系列组织切片(每只大鼠9片)进行切片观察。恢复组线粒体切片数较多(4.07±0.20)与2.52±0.20部分·μm-2;p<0.001), DHEA显著降低了这一效应(2.94±0.10个·μm-2;p < 0.001) (图4 g).两组间线粒体总切片面积无差异。因此,恢复组的平均线粒体切面面积较低(0.099±0.004)与0.195±0.012μm2;p<0.001), DHEA抑制了这一效应(0.148±0.003 μm)2;p < 0.05) (图4 h).在第二组实验中,高倍放大(20500倍)观察到线粒体超微结构异常,包括部分嵴裂、嵴紊乱和基质夹杂物。恢复组出现异常,脱雄表雄酮治疗后异常不明显(图4 d-f).与恢复组相比,DHEA治疗后基质密度也有所增加(恢复组基质密度为216±85%,p<0.05)。这表明线粒体网络在恢复过程中出现了碎片化,而脱氢表雄酮阻止了这一过程。
讨论
在本研究中,我们已经证明,脱氢表雄酮改善了大鼠慢性缺氧继发于正常氧恢复期后观察到的收缩期和舒张期右心室功能障碍。这种右心室功能障碍与1)心肌细胞密度显著降低和2)线粒体碎裂有关,而呼吸链活性没有改变。脱氢表雄酮阻止了这些观察到的大部分变化。具体地说,脱氢表雄酮诱导线粒体能量蛋白表达增加和O2-产生,这与线粒体抗氧化防御和心肌细胞增殖的改善有关。恢复期DHEA处理对细胞凋亡无影响,但能促进细胞增殖。这些作用的信号通路包括CREB蛋白的激活导致eNOS的后续表达和线粒体生物发生的调节因子PGC1α的刺激。这表明了一种新的机制,通过DHEA部分拮抗慢性缺氧恢复损伤后的心脏改变。
据我们所知,这是第一个探索脱氢表雄酮对慢性缺氧暴露后常氧恢复期诱导的右心室损伤的影响的研究。我们之前已经证明,这种继发于慢性缺氧的常氧恢复期会诱导大鼠不可逆的右心室功能障碍和发育不良[9].形态测量学分析表明,线粒体网络破裂通常在线粒体功能障碍的情况下观察到[29].与线粒体结构和活性改变相关的心功能障碍先前已在其他模型中描述过[30.,31].线粒体碎裂可能表明细胞ATP水平的降低,因为线粒体从网状状态到碎裂状态的转变依赖于ATP水平。正常氧恢复期后右心室心肌细胞密度下降可以解释为慢性缺氧期细胞凋亡的发生[32].然而,在常氧恢复期后未观察到这种效应,可能是因为凋亡细胞被免疫系统迅速清除。
在本研究中,脱氢表雄酮刺激线粒体呼吸链蛋白表达,这种效应与细胞密度的改善有关,这表明线粒体能量代谢受损确实限制了恢复组的细胞生长。线粒体整体和内部结构的改变(即。在恢复组中观察到的线粒体网络破碎和嵴溶解)支持这一假设。在dhea处理组,线粒体结构恢复正常,氧化磷酸化蛋白上调。综上所述,这些观察结果表明,脱氢表雄酮刺激右心室的线粒体生物发生,正如先前在肝脏和大脑中所显示的那样[33,34].
我们的研究还强调了脱氢表雄酮的细胞效应和右心室的相关信号通路。PGC1α是一种涉及线粒体生物发生的转录共激活因子[35,36]可以与心脏eNOS表达上调一起受到刺激[26].这种eNOS上调的机制可能是由于dhea诱导的CREB增加,CREB是控制eNOS基因启动子的一个因素。综上所述,这些数据表明eNOS/PGC1α/CREB通路可能与DHEA的作用有关。有趣的是,最近的一项研究[37表明PGC1α控制肝脏中脱氢表雄酮的合成。结合我们的观察,这可能表明DHEA参与了PGC1α表达或激活的反馈控制。PGC1α的靶基因对其表达的反馈控制将是调控线粒体生物发生的转录网络和调控信号的一个显著特征。此外,我们发现脱氢表雄酮降低O2-生产。这可能是DHEA保护作用的机制之一。事实上,活性氧与线粒体损伤和细胞损伤有关,并可能导致心力衰竭[2,38].此外,MnSOD水平在常氧恢复阶段(在此阶段测量氧化应激)较高,在脱氢表雄酮处理后下降。因此,我们的数据支持了先前的观察,即MnSOD的表达受活性氧浓度的控制[39].
总之,脱氢表雄酮可预防继发于慢性缺氧的正常氧恢复期后观察到的右心室功能障碍、重构和肌细胞改变。刺激抗氧化防御和线粒体代谢通过eNOS/PGC1α/CREB轴的激活可能解释了DHEA处理后观察到的活性氧产生的减少和细胞增殖的增加。1)这样的实验模型可能与患有COPD和PH的患者相关,因为他们在与加重相关的连续严重缺氧发作和与氧治疗相关的低缺氧发作之间交替,2)脱氢表雄酮耐受性良好[40],目前正在对人类PH进行研究[14].因此,脱氢表雄酮可能被证明是一种值得进一步研究的有价值的分子,特别是在慢性阻塞性肺病继发性PH中,右心室衰竭是死亡的主要原因之一。
致谢
作者想要感谢A-M。loomenech, P. Techoueyres, S. Vautrat, G. Simon, S. Guerit和L. Parios(都是Inserm U1045,波尔多,法国)的技术援助。
脚注
权益声明书
没有宣布。
- 收到了2011年1月21日。
- 接受2012年3月26日。
- ©2012人队