摘要
许多关于肺腺癌(ADC)的单方面研究已经发表。为了综合联系临床相关的ADC特征,我们评估了425例切除的ADC的形态学、诊断和预测性生物标记物。
细胞角蛋白-7、甲状腺转录因子(TTF)1、napsin A、胸苷酸合成酶和切除修复交叉互补啮齿动物修复缺陷互补组-1表达、间变性淋巴瘤激酶重排以及表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)、V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(喀斯特)和v-Raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1 (BRAF)突变分析。所有特征均与临床和生存参数相关。
形态学亚型与吸烟史和不同的诊断生物标志物模式显著相关。喀斯特突变在男性吸烟者中普遍存在,而表皮生长因子受体突变与女性性别、不吸烟和麻风以及微乳头状生长模式有关。TTF1表达(总生存风险比(HR)为0.61,p=0.021)和BRAF多因素分析发现突变(无病生存的HR为2.0,p=0.046)是形态和分期独立的生存预测因素。在某些情况下,辅助放化疗对诊断性和预测性生物标志物的预后影响很大。
我们的数据对已建立的组织学和分子ADC特征的患病率和相互作用进行了全面的描绘。这些数据将有助于开发具有时间效益的ADC诊断和治疗算法。
摘要
肺腺癌的形态学、诊断和预测性生物标志物及临床特征http://ow.ly/skRky
介绍
作为癌症相关死亡率的主要原因,肺癌在发达国家是一个主要的健康问题[1].非小细胞肺癌(NSCLC)占所有病例的约80%;~ 60%的NSCLC为腺癌(adc)。ADC是一种复杂、异质性疾病,表现出各种临床病理和分子特征,对预后和预测有重要影响[1- - - - - -10]特别是V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变(喀斯特)、表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)和v-Raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1 (BRAF)和间变性淋巴瘤激酶的易位(ALK)基因位点已被鉴定为ADC的致癌驱动因子,对靶向治疗具有潜在的预测价值。与标准化疗相比,使用各自抑制剂治疗的选定患者的预后有显著改善[3.,5].此外,胸腺嘧啶合成酶(TS)和切除修复交叉互补的啮齿动物修复缺陷互补组1蛋白(ERCC1)分别被确定为培美trexed和铂为基础的治疗假定的预测性生物标志物[11- - - - - -14]最近,ADC的外显子组和基因组序列已经绘制,揭示了新的潜在治疗靶点[15,16,然而,大多数尚未进入临床决策阶段。
大多数ADC患者在初始诊断时存在无法手术的肿瘤分期。因此,只有小的活检或细胞学标本可用于诊断和预测性评估;在多达三分之一的病例中,诊断性免疫组织化学对于可靠的肿瘤亚型是额外需要的[8]为了在有限的组织环境中建立有效的患者分层和可靠的治疗策略,组织形态学、免疫组织化学、分子和临床数据的联系对于理解所有相关参数之间的相互作用至关重要。
为了全面评估建立的诊断,预后和预测ADC特点,彼此关联和病人的结果,我们回顾性分析了高加索群425随后切除组织形态学的ADC提供临床数据,诊断immunomarkers,基因改变的喀斯特,表皮生长因子受体,BRAF和ALK,以及TS和ERCC1的蛋白表达。
患者与方法
病人
仅包括2002年至2008年间手术切除的侵袭性ADC,并提供临床病理数据。根据2004年世界卫生组织肺癌分类进行诊断和分型[17]以及新的国际肺癌研究协会(IASLC)/美国胸科学会(ATS)/欧洲呼吸学会(ERS)分类[188bet官网地址18].采用国际癌症控制联盟(UICC)/美国癌症联合委员会第7版TNM(肿瘤,淋巴结,转移)分类。记录总生存率和无病生存率(DFS)。对于DFS,事件被定义为任何明确的临床或病理证据的局部或远处复发。
临床特征
我们收集了425例病例的形态学、免疫组化、分子和临床资料。单一缺失数据点的病例不包括在具体分析中。9例(2.1%)行楔形切除术,2例(0.5%)行节段切除术,340例(80%)行肺叶切除术,11例(2.6%)行双叶切除术,63例(14.8%)行全肺切除术,并伴有系统淋巴结清扫。264例(62.1%)为男性。中位(范围)年龄为62.6(38.3-84.8)岁。107例(25.2%)患者接受辅助化疗;III/IV期患者行辅助纵隔放疗73例(48.7%)。根据切除时有效的指导方针和患者的临床状况,给予辅助铂化疗或放疗,除非存在禁忌症。所有患者均未接受基于生物标志物的靶向治疗。总生存期终点分析(n=246, 57.9%)的平均随访时间为48.2个月。 Never-smokers were defined as having smoked <100 cigarettes in their lives; former and active smokers were designated as smokers. Clinicopathological characteristics of the patients included in the analyses are given in表1.
Histomorphological评价
所有常规ADC均根据IASLC/ATS/ERS分类标准进行模式分析,如前所述[9,记录每个组织成分(腺泡、腺泡、实性、乳头状和微乳头状)的百分比,每增加5%。主要模式被定义为覆盖最大肿瘤区域的模式。
组织芯片构建和免疫组化
对于诊断性(细胞角蛋白(CK)7,甲状腺转录因子(TTF)1和napsin A)和预测性免疫标记物(TS和ERCC1)的免疫组化分析,组织微阵列(TMA)之前详细描述[8使用了)。所有组织的使用得到了德国海德堡大学当地伦理委员会的批准(第206/2005号)。以苏木精和伊红为基础选择合适的区域后,TMA机(at27;AlphaMetrix Biotech, Rödermark, Germany)用于从组织供体块中提取串联1.0 mm圆柱形芯样。免疫组化染色由国家肿瘤中心(海德堡,德国)的组织库使用商业可用的抗体进行。所有标准的常规诊断抗体都是根据在循环试验中持续检测的质量控制方案应用的(www.nordiqc.org)在认可的环境中。TMA玻片脱蜡并用抗原回收缓冲液预处理。随后的步骤在染色机中进行(DAKO Autostainer;德国汉堡)。诊断性免疫标记物的表达根据二分法评分方案进行评估[8].分别用H评分(H=1×(% tumor 1 +(弱染色))+ 2×(% tumor 2 +(中染色))+ 3×(% tumor 3 +(强染色))分析细胞核和细胞质TS和ERCC1的表达。对于TS和ERCC1表达的总体评估,核和/或细胞质中各自标记的h值最高。所使用抗体的详细信息见表S1。
分子分析
对所有病例进行基因突变分析喀斯特(外显子1),表皮生长因子受体(外显子18-21)和BRAF(外显子15)通过Sanger测序。人工显微解剖后提取基因组DNA [10利用全自动纯化系统(QIASymphony SP;试剂盒、希尔登,德国)。进行可靠的测序分析[10],仅使用>40%肿瘤细胞含量的显微解剖组织材料。用分光光度计(NanoDrop;Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)。PCR扩增采用以下引物。表皮生长因子受体: 5 ' -gctgaggtgacccttgtctc-3 '(外显子18正向),5 ' -acagcttgcaaggactctgg-3 '(外显子18反向);5 ' -gctggtaacatccacccaga-3 '(外显子19正向),5 ' -gagaaaaggtgggcctgag-3 '(外显子19反向);5 ' -catgtgcccctccttctg-3 '(正向外显子20),5 ' -gatcctggctccttatctcc-3 '(反向外显子20);5 ' - ccagcttcttcccatgatga -3 '(21外显子正向),5 ' -cctggtgtcaggaaaatgct-3 '(21外显子反向);喀斯特: 5 ' -gtgtgacatgttctaatatagtca-3 '(外显子1正向),5 ' -gaatggtcctgcaccagtaa-3 '(外显子1反向);BRAF: 5 ' - cctaaactcttcataatgcttgcc -3 '(正向外显子15),5 ' -ccacaaaatggatccagaca-3 '(反向外显子15)。在3500基因分析仪上使用BigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)对两条链的PCR扩增子进行直接测序。
识别个案ALK重排,所有病例均采用免疫组织化学方法筛选,使用敏感抗体检测ALK阳性NSCLC[19].阳性病例接受荧光检查原位如前所述,使用分离探针(美国伊利诺伊州雅培公园雅培实验室VYSA)进行杂交(FISH)[6].只有经fish确认的病例ALK重排被认为是ALK阳性。
统计数据
分类生物标志物与临床病理资料的相关性采用Fisher’s exact检验、卡方检验和趋势卡方检验。用Mann-Whitney u检验和Kruskal-Wallis检验将半定量评价的生物标志物(ERCC1和TS)与临床病理数据进行比较。使用Kaplan-Meier方法估计总生存和DFS,并采用log-rank检验来探讨是否显著。使用Cox比例风险模型计算单因素和多因素生存分析的风险比(HRs)。所有统计分析均使用SPSS Statistics 20 (IBM, Ehningen, Germany)进行。P <0.05被认为是显著的。
后果
肺ADC的病理、诊断和分子生物学标志物特征分布
最终队列包括416例(97.9%)常规和9例(2.1%)浸润性黏液adc。常规adc中,lepidic 30例(7.5%),腺泡性176例(43.9%),乳头状21例(5.2%),微乳头状25例(6.2%),固体149例(37.2%)。在15例病例中,现有的档案组织不足以进行可靠的形态学重新分类。
在诊断性生物标志物方面,96.7%、87.6%和75.5%的ADC患者表达CK7、TTF1和napsin A。
ALK6例(1.4%)发生易位。喀斯特,表皮生长因子受体和BRAF突变分别为160例(37.6%)、66例(15.5%)和17例(4%)。
双突变(突变1/突变2)发生喀斯特/喀斯特(n = 8 1.9%),表皮生长因子受体/表皮生长因子受体(n=6,1.4%),喀斯特/表皮生长因子受体(n = 6 1.4%)表皮生长因子受体/BRAF(n=2,0.5%)。六分之一ALK转移的adc显示了额外的喀斯特突变。ERCC1和TS的平均h值分别为57.9和45.5。有关临床病理特征分布的详细信息,请参见表1.
诊断和预测性生物标记物与形态学特征的关联
Napsin的表达与主要的组织形态学模式显著相关(图S1) (p<0.001),微乳头状癌的表达率最高,而实体癌和lepidic癌的表达率更可能为阴性。喀斯特突变在侵袭性粘液性ADC中更常见,而在该ADC亚型中未发现其他类型的驱动突变(表1).在所有分析的分子变化中,只有表皮生长因子受体突变频率在生长模式方面存在显著差异,以鳞状和微乳头状为主的ADC表现出较高的突变频率表皮生长因子受体突变率(表1),主要是由于19号外显子突变频率的差异(图S2)。ALK易位仅见于腺泡和实性ADC(图S2)和BRAF突变主要见于微乳头状ADC,但不见于乳头状ADC或鳞状ADC(表1和图1).
诊断性和预测性生物标志物之间的关联
ttf1阳性adc中TS和ERCC1表达均显著升高(p=0.026和p=0.007) (表1).此外,ERCC1和TS的高表达水平与ALK易位和野生型喀斯特(ERCC1 p分别=0.005和0.008,TS p分别=0.075和0.049)(图S3)。
诊断和预测生物标志物在肺ADC中的预后价值
TTF1和napsin A表达与延长生存率相关,TTF1具有更强的预后价值(表2).此外,TTF1表达是分期和模式独立的总生存预测因子(HR 0.61, p=0.021)。在没有进行辅助化疗的患者中,生存效果尤其明显(表S2)。TS表达是较好的总生存期和DFS的显著预测因子(表S3和图S4)。然而,在Cox回归模型中,当TS表达的生存影响根据分期和显性组织形态学模式进行调整时,TS没有显示出对患者生存的独立影响(总生存HR 0.82, p=0.233, DFS HR 0.73, p=0.073)。的存在BRAF突变是DFS的负预后因素(p=0.009),但不是总生存率(图S5)。有趣的是,尽管总的生存率没有显著差异,但表皮生长因子受体与未接受辅助化疗的患者相比,接受辅助化疗的突变患者的预后明显改善(表S3)。文中给出了所有形态学、临床和分子生物标志物的预后相关性的全面概述表2而在图3.
讨论
尽管已经发表了大量关于肺ADC的临床、形态学和分子生物标记物的详细资料,但迄今为止,还缺乏涵盖与当前常规诊断环境相关的所有临床和病理特征的综合研究。在这里,我们证明了几个特定的临床、组织形态学、免疫组织化学和分子参数紧密相连或几乎相互排斥,这可能对开发合理的、保留组织的诊断算法以及优化患者分层产生重大影响。
在过去的十年中,肺癌研究被大规模的分子方法所主导,以确定个性化药物的预后和预测标志物。然而,到目前为止,只有表皮生长因子受体突变和ALK易位已经成功地转化为诊断环境;其他一些潜在的生物标志物也未能实现这一目标。分子特征和随后的临床试验强调形态学特征(例如鳞状与非鳞状上皮)是选择治疗的关键。今天,我们知道肺adc组比预期的更加异质性,具有不同的生物学行为和预后。因此,基于组织形态学的adc重分类[18是一个逻辑性和必要的步骤,具有高度显著的预后,并可能具有预测价值[9].有了这本小说,而且在很大程度上是可以复制的[20.,21工具,将不同的ADC组织类型与诊断和预测生物标志物以及临床特征联系起来,对于未来ADC的综合跨学科分类至关重要[18].此外,不同的治疗靶点被发现是相互关联的,这意味着联合抑制策略来优化治疗算法。例如,ALK易位被发现与TS表达相关[22],表皮生长因子受体在ercc1阴性肿瘤中,突变的报道更为频繁[23]和EGFR抑制剂已知可下调TS [24,25].此外,新的药物,如拉帕替尼,一种双重EGFR和Her2酪氨酸激酶抑制剂(TKI),克唑替尼(ALK/c-Met抑制剂)或索拉非尼(多激酶抑制剂)针对不止一个靶点,可能因此成功地防止肿瘤逃逸机制。对靶向治疗的获得性耐药性也与特定的分子改变密切相关[26]因此,联合治疗方法需要相应预测性生物标志物的相关患病率数据。
ERCC1和TS参与DNA合成和修复,其表达缺失被认为是对铂类药物反应的预测[27]及以培美曲塞为基础的[28]然而,除了这两种蛋白的潜在阴性预测值外,高表达水平也被报道与改善预后相关[27,29- - - - - -31,至少对TS来说,这一点在本研究中得到了证实。这可以用一种假说来解释:通过防止突变,DNA修复不仅可以预防癌症,而且还可以抑制与肿瘤进展相关的分子事件。因此,在未治疗的患者中,通过识别只有在分子水平上缓慢进展的肿瘤,各自标记的高表达可能表明预后的改善[32],这也反映在我们的发现中,TS和ERCC1高表达水平在早期肿瘤阶段更为普遍(表1).TS的表达与侵袭性黏液性adc、TTF1阳性、年龄和ALK易位(22],但也导致TKI下调TS[24,25]可能被用于对患者进行分层,以接受培美曲塞联合治疗。
一些研究报告了ERCC1对铂类化疗的预测价值,包括761例NSCLC肿瘤的国际辅助性肺癌试验(IALT)[11].然而,随后的研究表明,这种关联可能在鳞状细胞癌中特别突出,而在ADC中则没有[33](A.沃思,个人通信)在我们的ADC队列中,ERCC1表达也与接受辅助性铂类化疗的患者的生存率降低相关;然而,这些差异没有达到统计学意义,这可能表明该标记物的预测值相对较小,但相反,也可能归因于本次分类中的所有样本量。最近,Fribouletet al。[34]报道称,他们无法验证免疫染色对ERCC1的预测效果,在几个大型NSCLC队列中,包括IALT试验的队列,这可能是由于商业可用的抗体,包括本研究中使用的抗体,似乎没有专门检测到独特的功能性ERCC1亚型。因此,ERCC1的预测价值可能存在争议,直到有更多特异性抗体能够验证ERCC1表达的预测效果。
表皮生长因子受体据报道,突变在年轻、女性、亚洲人和从不吸烟的患者中累积。然而,迄今为止发表的大多数研究都是在临床试验的背景下对选定的队列进行报告的。在本文分析的未选定的高加索人队列中,我们可以确认女性占优势,此外,还发现更高的患病率在以鳞状和微乳头状为主的ADC中,年龄与ADC患病率的差异无关表皮生长因子受体突变。相比之下,其他一些人发现了更高的患病率表皮生长因子受体老年患者的突变与腺泡型ADC的相关性[35].这些差异可能可以用不同的种族背景来解释。在任何情况下,形态学标准似乎是有帮助的,如果预先选择的病人表皮生长因子受体需要进行突变测试。
虽然到目前为止还没有特定的靶向疗法,喀斯特突变被认为是基于tki的ADC治疗的潜在阴性预测因素,也是手术切除的早期ADC的预后因素[36,37].然而,也有证据表明喀斯特突变,在男性、吸烟者和侵袭性粘液性adc中更为普遍[15,35,38) (图2),不是一个先天的对TKI管理不利的因素[39].靶向下游效应物的药物喀斯特途径可能为这一庞大的ADC亚群提供治疗选择。病人的分层喀斯特可以根据上述特征进行突变检测。
在第一个试验中,BRAF抑制剂在非小细胞肺癌中显示出明显的抗肿瘤活性[40),具体BRAF突变也使肿瘤对达沙替尼产生反应[41].BRAF据报道,突变与女性性别和吸烟有关。此外,BRAF-突变肿瘤被认为属于侵袭性组织型,以微乳头状特征和较短的DFS和总生存期为特征[42,43].我们可以确认BRAF微乳头型ADC的突变与BRAF突变导致更严重的DFS,但与女性性别或吸烟无关。
在诊断标志物中,TTF1最近被报道为独立的生存预测因子[44,我们的研究证实了这一点。其他人也描述了napsin A的独立预后效应,以及napsin A表达与存在的相关性表皮生长因子受体亚洲ADC队列中的突变[45].然而,我们只能看到napsin A与生存参数的交界性联系,而与表皮生长因子受体突变。同样,这些不同的发现可能归因于种族背景的差异,并强调需要来自不同地理区域的大型ADC队列的可靠患病率数据。
本研究的一个局限性在于其回顾性。对多个临床病理特征的评估必然会导致小组比较,因此在某些情况下会妨碍多变量分析。此外,预测性生物标记物通常不会使用切除标本进行分析,而是在肿瘤晚期或晚期进行分析仅有稀疏组织的复发性肿瘤。尽管基于TMA的免疫标记物评估可能在很大程度上反映了活检星座,但我们不能排除与日常常规设置相比,分子改变的轻微患病率变化。
考虑到越来越多的临床相关生物标记物,为了满足这些要求,不仅要建立保留组织的诊断算法,而且要为分子改变开发具有时间和成本效益的多测试平台,并将其分别应用到常规诊断中肺癌个体化治疗背景下的循证决策。新型亚基因组大规模平行测序(MPS)在这方面,允许在一次测序运行中对肿瘤材料进行全面突变筛查的策略尤其有希望。然而,在广泛的常规诊断使用之前,应用的每种MPS技术必须适应肺癌诊断的特定需要;具体而言,其鲁棒性e方法必须显示在小支气管活检样本和石蜡包埋材料上。
综上所述,这是第一项大规模研究,同时涵盖了肺ADC的形态学、诊断和预测性生物标志物以及临床特征。本文提供的未经选择的高加索人队列数据,未经基于生物标志物的靶向疗法治疗,可能构成肺ADC发展的基础合理的诊断分层算法可用于选择合适的治疗方法,也可作为临床试验设计的流行数据来源。
致谢
J. Schmitt, A. Brüntgens, C. Hofherr, W. Schmitz, M. Karipidis, M. Viole(海德堡病理学研究所,德国海德堡)和C. Stolp (Thoraxklinik Heidelberg,海德堡,德国)因其出色的支持本研究而受到认可。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究的部分内容由LungSys财团(资助编号0316042B)及由诺华制药.
利益冲突:可以在本文的在线版本旁找到披露www.www.qdcxjkg.com
- 收到2013年1月30日。
- 接受2013年7月10日。
- ©2014人队