摘要
我们评估了促进病理间质中胶原交联的赖氨酸氧化酶样2 (LOXL2)是否在特发性肺纤维化(IPF)患者的血清中检测到,并评估了其与IPF疾病进展的关系。
分析了来自ARTEMIS-IPF (n=69)和IPF (GAP)疾病进展的基因组和蛋白质组学分析(n=104)研究的患者。基线血清LOXL2 (sLOXL2)水平与疾病严重程度的基线临床和生理替代指标进行比较,并使用分类和回归树(CART)方法评估与IPF疾病进展的相关性。
在两个队列中,sLOXL2与强迫肺活量和一氧化碳扩散能力相关性较弱(r -0.24-0.05)。cart测定的阈值相似:ARTEMIS-IPF 800 pg·mL−1GAP 700 pg·mL−1.在ARTEMIS-IPF中,较高的sLOXL2 (>800 pg·mL−1)与疾病进展风险增加相关(危险比(HR) 5.41, 95% CI 1.65-17.73)。在有基线呼吸计数据的GAP受试者中(n=70),较高的sLOXL2水平(>700 pg·mL−1)与更多的疾病进展事件相关(HR 1.78, 95% CI 1.01-3.11)。在所有GAP受试者中,较高的sLOXL2水平与死亡风险增加相关(HR 2.28, 95% CI 1.18-4.38)。
这些结果表明,较高的sLOXL2水平与IPF疾病进展的风险增加有关。然而,由于多种限制,这些结果需要验证。
摘要
较高的基线sLOXL2水平:与IPF严重程度无相关性,但与疾病进展相关http://ow.ly/sEbGW
简介
特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性且最终致命的肺部疾病,涉及气道上皮细胞损伤、成纤维细胞活化和增殖、胶原蛋白和其他细胞外基质(ECM)成分过度沉积[1].纤原性胶原I和III沉积明显增加[2],以及胶原蛋白V、XII和XIV的丰度和定位的变化,这些变化有助于组织和稳定生长的原纤维[3.,4].ECM组成和组织的这些改变改变了肺实质的生物力学特性,并增加了局部张力,这在IPF疾病的发病机制中至关重要[5].
基质张力的一个重要驱动因素是赖氨酸氧化酶样2 (LOXL2),这是一种催化ECM分子共价交联的酶,包括纤维胶原蛋白。活化的成纤维细胞分泌LOXL2,胶原蛋白含量增加[6].ECM的这种病理性重塑可能导致从ECM中隔离的潜伏相关肽复合物中释放潜伏转化生长因子(TGF)-β [7,8],驱动细胞激活、LOXL2和胶原蛋白分泌以及基质硬化的前馈循环。
LOXL2蛋白在病变IPF肺组织的成纤维细胞灶和胶原区表达,在健康肺组织中表达相对较少[9].LOXL2也被定位于肝纤维化的活性疾病界面[9],并被认为是纤维化的“核心”驱动因素[10].由于LOXL2与病变组织中活跃的纤维发生区域相关,我们假设在IPF患者中LOXL2 (sLOXL2)的血清水平会升高。我们开发了一种能够相对定量LOXL2蛋白循环水平的免疫测定方法,并测试了从两个独立的特征良好的IPF患者队列中收集的血清样本。本研究的主要目的是评估基线sLOXL2水平是否与IPF疾病严重程度和IPF进展风险相关。这项研究的初步结果先前已在若干国际会议上报告[11,12].
方法
本研究使用的血清和临床数据来自参与两个独立临床研究的受试者:ARTEMIS-IPF和IPF中疾病进展的基因组和蛋白质组学分析(GAP)研究。所有血清和数据均为前瞻性收集,但回顾性分析。所有分析均由每个临床场所的机构审查委员会批准。
研究人群和血清采集
ARTEMIS-IPF(注册于www.ClinicalTrials.gov与标识符NCT00768300)是一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照、事件驱动的试验,评估安布里森坦(一种被批准用于治疗肺动脉高压的内皮素a受体的选择性拮抗剂)是否能够预防IPF疾病进展[13].基线临床和生理数据包括强迫肺活量(FVC) %预测(% pred),肺一氧化碳扩散能力(DLCO) % pred, 6分钟步行距离(6MWD),平均肺动脉压(PAP),圣乔治呼吸问卷(SGRQ)评分和过渡呼吸困难指数(TDI)评分。获得PAP通过右心导管插入术,这是所有研究对象在基线时都需要的。利用基线FVC和FVC计算综合生理指数(CPI)DLCO根据先前公布的公式[14].
GAP研究(注册于www.ClinicalTrials.gov与标识符NCT00373841)是一项前瞻性观察性研究,招募了匹兹堡大学Dorothy P.和Richard P. Simmons间质性肺病研究中心(Pittsburgh, PA, USA)的受试者。2005年10月开始招收这批学员。数据库在2011年12月1日被锁定用于当前分析。研究对象要求:1)年龄≥18岁;2)根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会指南诊断为IPF [188bet官网地址15];3)能够在临床设施接受所有持续的护理和随访。研究访问1前3个月至2周期间收集的临床数据被纳入基线评估,包括但不限于肺功能测试。
对于ARTEMIS-IPF,在美国选择的临床地点随机分组之前收集基线血清。这些地点具有必要的基础设施和支持人员,可根据实验室规程收集这些样本。对于GAP队列,在入组研究访视时收集基线血清样本,然后在此后的常规临床访视中每4-6个月收集一次血清样本。采集后,血清标本alialic, -80℃冷冻;本研究分析的所有血清样本在测试前保持在-80°C。
健康供体血清
对从bioreclamy公司(Hicksville, NY, USA)和Cureline公司(South San Francisco, CA, USA)购买的自我报告为“健康”的成年捐赠者的样本进行sLOXL2水平分析。捐赠者的乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病毒感染血清呈阴性。
临床终端
sLOXL2分析使用了ARTEMIS-IPF临床试验中使用的相同的预先指定的临床终点。主要终点为首次IPF疾病进展事件发生的时间,复合终点包括任何原因的死亡率、判定的呼吸道住院或肺功能的分类下降(定义为FVC下降≥10%,肺功能下降≥5%)DLCO或降低≥15%DLCO植被覆盖度降低≥5%)。对于GAP队列,ARTEMIS-IPF疾病进展定义应用于基线有肺量测量的受试者子集(n=70),但不包括呼吸道住院事件。在GAP队列中没有跟踪住院情况,因为这些患者是从其他医疗保健计划转来的,在必要时他们在那里住院。评估所有受试者的全因死亡率,基线sLOXL2可用于分析(n=104)。如果在随访期间发生肺移植,则认为是死亡事件。
抗体生成和sLOXL2免疫分析
抗体生成方法和sLOXL2免疫分析程序和验证的详细信息可以在在线补充材料中找到。简单地说,针对全长纯化的LOXL2蛋白,产生了两个抗LOXL2抗体,一个是兔多克隆抗体,一个是小鼠单克隆抗体。使用电化学发光平台(Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA)开发了一种使用这两种抗loxl2抗体的三明治免疫分析法。使用纯化的重组人LOXL2蛋白(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)作为校核器,允许对未知样品进行相对定量。
统计分析
采用分期方法分析ARTEMIS-IPF和GAP队列。第一阶段包括ARTEMIS-IPF队列中的9项关联分析;其中8项关注基线特征,1项关注疾病进展终点。多重比较的Bonferroni校正要求α阈值设置为0.006。第二阶段是GAP队列的假设驱动分析,主要分析评估基线sLOXL2水平与IPF疾病进展之间的关联是否可以在α-阈值0.05处复制。考虑到每个终点都是疾病进展终点的一个组成部分,所有与疾病进展终点组成部分的测试都被认为是探索性的。
所有分析均使用SAS统计软件9.1版(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)进行。sLOXL2水平低于检测下限(LLOD) (180 pg·mL)的患者样本−1)被分配为LLOD/2 (90 pg·mL−1)作分析之用,如左删减数据所建议的[16].Pearson相关系数用于确定sLOXL2水平与人口学和临床变量之间的相关性。采用分类回归树(CART)方法,以IPF疾病进展状态(二进制)为响应变量,以基线sLOXL2水平为因变量,选择“低”与“高”sLOXL2受试者评估IPF疾病进展与基线sLOXL2之间的关联。CART以无监督的方式独立地应用于每个队列。使用累积发生率曲线计算高sLOXL2组和低sLOXL2组出现终点的概率差异。使用Cox比例风险模型对每个队列的终点和sLOXL2水平之间的关联进行独立评估。采用逐步选择方法来确定在p<0.05阈值处与感兴趣终点相关的基线变量。治疗分配被强制纳入模型进行ARTEMIS-IPF分析。对ARTEMIS-IPF的随访持续了整个研究期间。GAP队列研究对象在入组24个月后被随访至死亡、肺移植或检查。统计学意义定义为双侧p值<0.05。
结果
LOXL2免疫测定和健康供体的特征
LOXL2免疫测定方法的开发是使用校准样品进行的,校准样品是通过将重组全长人LOXL2蛋白添加到缺乏可检测到LOXL2水平的正常健康供体的血清中生成的,如在线补充材料中所述。使用发生的患者样本进行验证。血清样品的化验性能特征见表1;EDTA血浆样品的测定性能相似(数据未显示)。
来自自我报告的健康成年捐赠者(n=101)的样本与IPF研究参与者无关,检测sLOXL2水平。均值±sd年龄为50.3±14.3岁,男性占60%。年龄与sLOXL2水平无相关性(p=0.36)。90%(91名捐献者)的sLOXL2水平低于LLOD, 2%(2名捐献者)的sLOXL2水平<定量下限。
ARTEMIS-IPF研究中的sLOXL2
在意向治疗队列的492名受试者中,69名(14%)受试者(49名接受氨布里森坦治疗)收集了基线血清样本并可用于分析。这些受试者的平均随访时间为245天。在随访期间,有血清可用的亚组有9例死亡。这些受试者,与没有基线血清的受试者相比,具有相似的基线人口学特征和IPF严重程度,如预测FVC百分比和DLCO、6MWD、平均PAP、CPI、SGRQ评分及TDI评分(表2).
所有69名受试者的sLOXL2中位基线水平为304 pg·mL−1(图1)(四分位范围(IQR) 144-738 pg·mL−1;最小<180 pg·mL−1(低于LLOD),最大值5389 pg·mL−1);安慰剂组和氨布里森坦组的中位基线sLOXL2水平为206.1 pg·mL−1360.6 pg·mL−1分别。sLOXL2与IPF严重程度的基线人口学和生理学测量之间的相关性较弱(相关系数如下:年龄为0.31;FVC -0.24;DLCO-0.13;6随钻测量-0.04;人民行动党0.17;CPI 0.14;SGRQ 0.12;TDI -0.18)。CART分析基线sLOXL2水平为800 pg·mL−1作为该队列中分类IPF疾病进展风险的最佳阈值;36例(67%)和18例(33%)接受氨布里森坦治疗的受试者被分组为“低”(≤800 pg·mL)−1)与“高”(>800 pg·mL−1) sLOXL2基线水平;13名(87%)和2名(13%)安慰剂治疗的受试者被分组为“低”(≤800 pg·mL)−1)与“高”(>800 pg·mL−1)基线sLOXL2水平。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/43/5/1430/F1.medium.gif)
在ARTEMIS-IPF中接受氨布生坦和安慰剂治疗的受试者和特发性肺纤维化(GAP)研究队列中疾病进展的基因组和蛋白质组学分析的受试者中,血清莱氨酸氧化酶样2 (sLOXL2)的分布。虚线表示ARTEMIS-IPF中用于将受试者分为“低”和“高”sLOXL2组的阈值(800 pg·mL−1)和GAP队列(700 pg·mL−1).
存在高基线sLOXL2水平与经历IPF疾病进展事件的高概率相关(图2一个).在疾病进展终点的所有三个组成部分中,始终观察到这种关联:肺功能下降(图2 b)、呼吸系统住院治疗(图2 c)和死亡率(图2 d).考克斯比例风险模型(表3)显示,高基线sLOXL2水平与IPF疾病进展风险增加5.4倍相关(p=0.005),肺功能下降风险增加7.6倍(p=0.031),呼吸系统住院风险增加5.4倍(p=0.029)。治疗分配包括在每个模型中,6MWD和CPI评分也包括在内,这是使用逐步方法发现仍然显著的唯一基线变量。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/43/5/1430/F2.medium.gif)
累积发病率曲线比较低(≤800 pg·mL)−1)和高(>800 pg·mL−1) ARTEMIS-IPF中血清lysyoxidase样2 (sLOXL2)水平对a)疾病进展及其组成部分:b)肺功能下降,c)呼吸道住院和d)死亡。
GAP队列中的sLOXL2
总共有120名受试者被纳入GAP队列。其中105例有可供分析的血清样本,其中1例临床资料不足。其余104例受试者中,70例有基线肺活量测定值。与ARTEMIS-IPF相比,GAP受试者的基线FVC较低,但略高DLCO(表2).平均随访时间也较长,为455天。所有数据在入组2年后进行审查,以进行其余分析。在此期间,该队列中有26例死亡和17例肺移植。
104名受试者的中位基线sLOXL2水平为716 pg·mL−1(图1IQR < 180-1447 pg·mL−1(低于LLOD的较低值);最小<180 pg·mL−1(低于LLOD),最大15 708 pg·mL−1).在可获得基线肺活量测定数据的受试者子集中,基线sLOXL2水平与肺功能之间的相关性较弱(相关系数如下:年龄-0.16;FVC -0.01;DLCO-0.28;CPI 0.24)。CART分析为700 pg·mL−1作为IPF疾病进展风险队列分类的最佳阈值;46名(44%)受试者被分组为“低”(≤700 pg·mL)−1) sLOXL2, 58名(56%)受试者被分组为“高”(>700 pg·mL)−1) sLOXL2。
在70名基线进行肺功能测量的受试者中,高基线sLOXL2水平的存在与IPF疾病进展事件显著增加相关(p=0.042) (图3).考克斯比例风险模型(表3)显示,高基线sLOXL2水平与疾病进展风险增加1.8倍相关(p=0.045)。虽然肺功能下降(p=0.334)和死亡率(p=0.159),当被视为单独的因素时,不符合0.05的p值阈值,但高基线sLOXL2水平的存在与发生这些事件之一的更高概率相关(图3b和c).GAP队列中所有104名受试者的死亡率分析显示,高基线sLOXL2水平与更多的死亡相关(p=0.017) (图3 d),死亡风险增加2.2倍(p=0.014) (表3).每个统计模型都包括性别和年龄作为协变量,这是使用逐步方法发现仍然显著的唯一基线变量。
累积发病率曲线比较低(≤700 pg·mL−1)和高(>700 pg·mL−1)血清水解氧化酶样2 (sLOXL2)水平:a)疾病进展及其组成部分:b)肺功能下降;c)特发性肺纤维化(GAP)研究对象疾病进展的基因组和蛋白质组学分析(n=70)基线呼吸计值;d)没有(n=104)基线呼吸计值的GAP研究对象的死亡。
讨论
LOXL2直接参与疾病相关的纤维发生[9]:促进纤维增生性基质和纤维化的主要成分纤原性I型胶原交联,在基质重塑、成纤维和病理性基质形成中起关键作用。在这项研究中,我们证明了LOXL2可以在循环中检测到,并且在IPF患者中,我们发现了sLOXL2水平与IPF疾病进展之间的新关联。我们还发现,基线sLOXL2水平与IPF疾病严重程度的典型临床测量没有显著相关(如.FVC和DLCO).鉴于目前对LOXL2在纤维化中的作用的了解,这些发现表明,循环中的sLOXL2水平可能反映了IPF疾病的活动性,而不是严重程度。
尽管这些结果代表了sLOXL2水平与IPF结果之间的关联,而不是直接的因果关系,但有几个理由相信sLOXL2作为IPF疾病活动的潜在生物标志物值得进一步研究。首先,有强有力的生物学证据表明,高sLOXL2水平与不良IPF结果之间存在因果关系。我们先前证明LOXL2在纤维化疾病的小鼠模型中表达(如.肺纤维化和肝纤维化),并可通过抗loxl2抗体治疗加以抑制[9].在肺纤维化的治疗性小鼠模型中,GS-607601(以前称为AB0023),一种抑制LOXL2的小鼠单克隆抗体,能够降低肺中的LOXL2水平,减少反映纤维化活性的因素(如.α sma阳性成纤维细胞、基质细胞衍生因子-α1、TGF-β1、内皮素-1和phospho-SMAD2)的数量减少,纤维化程度降低。在乙型肝炎或丙型肝炎相关肝纤维化患者中,高sLOXL2水平也已被证明与较高的Ishak纤维化评分相关,并且sLOXL2水平随抗乙型肝炎治疗而下降[17,18].因此,非人类和人类的数据都支持sLOXL2反映纤维化疾病活动程度的可能性。
其次,在两个IPF队列中,sLOXL2始终与疾病进展及其组成部分相关。在ARTEMIS-IPF中,疾病进展终点的肺功能下降和呼吸道住院部分与高sLOXL2水平密切相关。与死亡风险的相关性也呈相同的趋势,尽管它没有达到0.05的p值阈值。在GAP队列中,肺功能下降和死亡风险均达到0.05的p值阈值。值得注意的是,GAP队列中与高sLOXL2水平相关的死亡风险与ARTEMIS-IPF中观察到的死亡风险相似,这表明如果ARTEMIS-IPF中的死亡事件率更高,则可能达到0.05的p值阈值。
第三,这些关联是在两个独立的人群中观察到的,这两个人群在多个水平上存在很大差异,将我们的分析设置为基线sLOXL2与IPF临床结果之间关系的敏感性分析。ARTEMIS-IPF人群是在一个控制良好的多中心临床试验的背景下招募的,其中纳入和排除标准的设计是为了确定轻度IPF的受试者;高分辨率计算机断层扫描>5%蜂窝状的受试者被排除在外[13].GAP队列是一个观察性队列,由位于三级机构的间质性肺病项目进行评估,该机构的患者更有可能患有晚期IPF。尽管植被覆盖度和DLCO虽然这两个队列的死亡事件数量相似,但这两个队列的死亡事件数量却截然不同(表2).
尽管sLOXL2水平与IPF结果之间的相关性具有生物学上的合理性和统计学意义,但仍有显著的局限性需要考虑。这些观察是使用小的IPF队列进行的,这可能导致不精确的点估计。虽然治疗分配被强制纳入Cox模型,但在ARTEMIS-IPF分析中与sLOXL2相关的风险估计仍然受到研究药物的残留混杂效应的影响,其与IPF疾病进展风险增加1.7倍相关[13].由于缺少基线肺功能数据而排除30%的GAP受试者也可能导致结果偏倚。缺失基线肺功能数据的受试者可能患有更严重的IPF疾病,这反映在更多的死亡(50%)与37%),死亡风险略高(HR 1.75, 95% CI 0.95-3.23;p = 0.07)。最后,sLOXL2的低picogram水平需要极高灵敏度的检测。我们预计,当开发出更可靠和标准化的检测方法以及对更全面的IPF人群进行调查时,cart识别的sLOXL2阈值可能会发生变化。
鉴于LOXL2极有可能参与IPF的发病机制,未来的研究应研究sLOXL2的诊断、预后和预测潜力。sLOXL2有可能提高当前诊断标准的阳性预测价值[15]用于指规数。未来的研究还应考虑sLOXL2与其他有前景的预后IPF生物标志物(如.基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP7、KL-6、骨膜蛋白、表面活性剂蛋白- a和D、CC趋化因子配体18、血管内皮生长因子和YKL-40) [19- - - - - -29],以及预后评分[30.,31]和放射模式[32],可能对帮助医生和患者预测患者的IPF疾病进展具有预后价值。这可能包括评估连续收集的sLOXL2水平及其与IPF急性加重的关系,这是许多IPF患者的终末期事件[33].最后,sLOXL2水平可能预测IPF患者对靶向治疗的反应。Simtuzumab是一种人源单克隆抗体,是LOXL2的变异构抑制剂,目前正在进行2期临床试验(www.ClinicalTrials.gov标识符号码NCT01769196),以治疗指规癣。这项研究将有助于确定基线LOXL2水平是否可以预测simtuzumab的疗效,并证实我们在本文中提出的研究结果,即基线LOXL2水平高的患者发生不良IPF结局的风险增加。
总之,这些数据证明了较高的sLOXL2水平与不良IPF结果风险增加之间的新关联。鉴于这种关联在两个独立的IPF群体中得到证实,并且LOXL2在动物模型中已被证明是纤维化疾病发病机制的疾病驱动因素,这种关联在本质上可能是因果关系。然而,这些结果并不表明sLOXL2是目前IPF的合适生物标志物。未来的工作不仅应该评估sLOXL2在IPF患者中的流行病学,还应该评估所有纤维化肺疾病中的流行病学,这对于确定sLOXL2在IPF患者的管理中是否具有任何诊断、预后或预测价值是必要的。
脚注
有关编辑评论,请参阅1233页.
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com
临床试验:本研究注册于www.ClinicalTrials.gov标识符编号NCT00768300NCT 00373841。
支持声明:这项工作由吉利德科学公司和美国国立卫生研究院资助(资助号P50HL084932)。
利益冲突:可以在本文的在线版本中找到信息披露www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2013年5月8日。
- 接受2013年9月19日。
- ©2014人队