文摘gydF4y2Ba
潜在的自我本质原因特发性肺纤维化(IPF)累进,通常致命的疾病,仍然未知。我们提出,肺泡溶膜联蛋白V导致肺纤维化,基于人类IPF的观察支气管肺泡灌洗液(BALF)包含高膜联蛋白V水平促进纤维母细胞参与肺泡上皮伤口愈合,降低BALF的膜联蛋白V耗尽时。gydF4y2Ba
2型细胞条件培养基从膜联蛋白V-treated肺泡上皮(AEC2),但不是膜联蛋白VgydF4y2Ba本身gydF4y2Ba、诱导人类成纤维细胞的增殖和包含pro-fibrotic, IPF-associated蛋白,以及促炎细胞因子被发现紧密相关(r > 0.95)与人类BALF膜联蛋白V含量。ErbB2受体酪氨酸激酶在原子能委员会是由膜联蛋白V,激活和封锁减少了纤维膜联蛋白的潜力V-treated AEC-conditioned媒介。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba气溶胶交付的膜联蛋白V鼠肺引起炎症,纤维化和羟脯氨酸增加,Wnt活化,改变增长factor-β增殖蛋白激酶和核factor-κB信号通路,见IPF。gydF4y2Ba
长期增加肺泡膜联蛋白V水平,反映在IPF BALF水平增加,可能导致IPF的进展诱导pro-fibrotic介质的释放。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
可溶膜联蛋白V,发现在IPF患者BALF的水平上升,促进在小鼠肺部炎症和纤维化gydF4y2Bahttp://ow.ly/MHobzgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
特发性肺纤维化(IPF)是最致命的间质性肺疾病,几乎没有有效的治疗方法。IPF的患病率和死亡率上升,随着年龄的增加显著(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。越来越多的证据表明它是多个周期的结果2型细胞(AEC2)肺泡上皮损伤和激活(gydF4y2Ba2gydF4y2BaAEC2损伤,标志物通常是发现在IPF患者的血浆gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。慢性AEC2损伤和随后的成纤维细胞/ myofibroblast人口的扩张和细胞外基质堆积导致的疾病进展(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),然而IPF的自我本质仍是一个谜。gydF4y2Ba
膜联蛋白基因家族的一个独特的膜结合蛋白与磷脂结合calcium-dependent的方式。膜联蛋白V是发现一直在体液,暗示一个细胞外的角色(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。最好是被称为凋亡细胞的标记,由于其高亲和力的磷脂酰丝氨酸暴露损伤(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。膜联蛋白V已知的生物活性是基于磷脂酰丝氨酸绑定,包括膜损伤修复(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba],抗凝活性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)和调制的蛋白激酶C和磷脂酶A2 (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。膜联蛋白V直接与胞内域的血管内皮生长因子(VEGF)受体2,因此可以作为细胞内信号蛋白表达这种受体(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
膜联蛋白V是co-secreted与表面活性剂(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),可以发现在人类支气管肺泡灌洗液体(BALF)从控制病人的ng≤20毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba和在IPF患者BALF水平显著升高。这小说假设水平的提高可溶膜联蛋白V在肺泡可以发挥积极,在肺泡上皮伤口愈合不利的作用。在此,我们确定膜联蛋白V水平升高对肺泡上皮细胞的影响gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,并确认高架肺泡膜联蛋白VgydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba导致肺部炎症和纤维化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba膜联蛋白V刺激pro-fibrotic蛋白质和细胞因子的释放原子能委员会也发现IPF患者BALF中。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
人类BALF样本gydF4y2Ba
匿名编码人类丢弃样品BALF[游离gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]从莫伊塞斯塞尔曼(间质性肺疾病项目,国家呼吸疾病研究所(内心),墨西哥城,墨西哥),详细在网上补充材料。gydF4y2Ba
ELISA试剂盒gydF4y2Ba
膜联蛋白V ELISA试剂盒获得美国Diagnostica(列克星敦,妈,美国)。小鼠结缔组织生长因子(CTGF) ELISA试剂盒来自Biotang(列克星敦,妈,美国)。gydF4y2Ba
清除膜联蛋白V BALF的免疫沉淀反应gydF4y2Ba
膜联蛋白V被撤BALF样品使用20μL anti-annexin V(4μg) (sc - 8300;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)或4μg兔免疫球蛋白的控制(更多细节在网上补充材料)。gydF4y2Ba
培养细胞gydF4y2Ba
的主要文化AEC2获得从250 - 300 g雄性老鼠使用g的方法gydF4y2BaonzalezgydF4y2Ba和DgydF4y2BaobbgydF4y2Ba(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
小鼠肺上皮(标定)15原子能委员会(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)请提供的Jeffrey Whitsett(美国辛辛那提儿童医院,辛辛那提,哦)。gydF4y2Ba
人类成纤维细胞细胞系CCD-8Lu(写明ATCC ccl - 201)和WI-38(写明ATCC ccl - 75)分部获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。gydF4y2Ba
体外肺泡上皮创伤模型gydF4y2Ba
新孤立鼠AEC2镀人口在24-well盘子,和损坏的第二天,汇合的时候,用吸管刮小费。细胞被洗两次清除残骸,孵化24 h的物质利益在固定和波形蛋白免疫染色。人类BALF补充道,在DMEM / F12培养基稀释1:1胎牛血清的最终浓度为10%。gydF4y2Ba
体内气管膜联蛋白V的气溶胶gydF4y2Ba
人类重组膜联蛋白V(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)已被使用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)是筛查内毒素和注入到老鼠肺部使用微灌aerosoliser(美国Penn-Century、费城、PA)(有关详细信息,请参阅在线补充材料)。剂量是根据膜联蛋白V从人类IPF BALF中恢复过来,纠正上皮衬里稀释的液体在人类BALF和鼠标的相对量gydF4y2Ba与gydF4y2Ba人类肺(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。博来霉素1.5 U·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba气管内的一群动物管理是积极控制肺纤维化。动物的工作表现符合机构的动物保健和使用委员会批准了协议。gydF4y2Ba
重组膜联蛋白VgydF4y2Ba
人类重组膜联蛋白V是来自两个来源:eBioscience和AbD Serotec / BioRad(美国罗利数控)。每批膜联蛋白V检测内毒素水平从Genscript使用分析工具(美国新泽西州皮斯卡塔韦),< 0.04内毒素单位(欧盟)·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba对所有批次测试。150年μL气溶胶管理每个鼠标包含< 0.006欧盟,4%的最大可接受的内毒素剂量可以管理一个30克的鼠标gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
胶原蛋白测定gydF4y2Ba
羟脯氨酸测定玉米胚芽蛋白酶解物的整个肺从BioVision使用工具(Milipitas、钙、美国)。肺癌部分是沾染了塞莱斯廷蓝色、苏木精和饱和苦味酸天狼星红0.1% (gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。可溶性胶原蛋白测定的条件培养基使用定量picro-Sirius红试验(在线补充材料)。gydF4y2Ba
蛋白质组学筛选gydF4y2Ba
蛋白质分离二维凝胶和凝固态与胰蛋白酶消化gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。由此产生的肽是清洗C18 OmixTips(美国瓦里安,帕洛阿尔托,CA)和分析使用一个Eksigent nanoLC-2D(美国马SCIEX,弗雷明汉)耦合到一个Orbitrap XL质谱仪(美国热科学、沃尔瑟姆,MA) (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。蛋白质被确定使用补充蛋白质从串联质谱识别软件系统,BioWorks(热)和支架(蛋白质组软件,波特兰,或美国)所描述的年代gydF4y2BaadygovgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
细胞因子测定gydF4y2Ba
MILLIPLEX地图细胞因子/趋化因子磁珠包(人类和小鼠)提供的微孔(美国马Billerica)和使用根据制造商的指示。公司提供的分析使用专有软件(Milliplex分析师)。gydF4y2Ba
免疫印迹gydF4y2Ba
免疫印迹分析如前所述[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。使用整个肺肺溶解产物。gydF4y2Ba
抗体gydF4y2Ba
信号蛋白+他们的活动形式如下。细胞外signal-regulated激酶、β-catenin Smad2 IKBa, Akt和ErbB2(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国);增殖细胞核抗原)、波形蛋白(老鼠)和膜联蛋白V(圣克鲁斯生物技术);波形蛋白(老鼠)和平滑肌肌动蛋白(SMA)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国);和β-actin (MP生物医学,梭伦,哦,美国)。gydF4y2Ba
受体酪氨酸激酶的蛋白质阵列gydF4y2Ba
老鼠受体酪氨酸激酶(RTK)数组从研发(明尼阿波利斯,美国)。gydF4y2Ba
鼠标ErbB2沉默RNAgydF4y2Ba
目标gydF4y2Ba+gydF4y2Ba沉默(si) RNA RNA是来自通用电气和控制Dharmacon(美国拉斐特有限公司)和转染到细胞的最终浓度10 nM,使用Lipofectamine RNAiMAX(表达载体和生活技术,大岛,纽约,美国)。gydF4y2Ba
肺部成像gydF4y2Ba
高分辨率的微型电脑断层扫描(CT)扫描肺使用SkyScan 1172成像仪(力量,布鲁塞尔,比利时)gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba由于所需的时间扫描(> 4 h)。小鼠肺膨胀的25岁以下的年轻人而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO在成像之前的压力。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
用t检验比较治疗gydF4y2Ba与gydF4y2Ba治疗组。为多个比较,方差分析,其次是适当的gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba测试是由正常和分布的数据。所有统计分析使用GraphPad棱镜软件(La Jolla、钙、美国)。图像J软件(美国国立卫生研究院)是用来计算蛋白质印迹带密度。三个独立的实验数据代表,除非另有说明,给出了均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba,p≤0.05被认为是重要的。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
间质性肺病患者BALF样本促进纤维母细胞生长在体外gydF4y2Ba
主要鼠AEC2文化,它在我们的手中可重复包含2 - 5%的成纤维细胞在附件(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba屏幕),提供了一种有效的生物监测纤维母细胞参与肺泡上皮愈合伤口,以应对潜在的纤维发生的刺激。BALF游离获得控制患者和患者确认肺病(过敏性肺炎、自身免疫性疾病和IPF),并分析pro-fibrotic肺泡上皮伤口愈合蒙蔽的方式为了区分群体。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba受损的老鼠AEC2治疗24小时与BALF控制患者(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba间质性肺病)显示主要伤口内上皮生长,所看到的形态和特征波形蛋白染色的缺乏。相比之下,BALF和IPF患者自身免疫的结果主要vimentin-staining细胞在伤口。过敏性肺炎患者BALF促进成纤维细胞和上皮细胞的增长。α-SMA (myofibroblast)染色BALF-treated组之间没有明显不同(数据未显示),这表明成纤维细胞波形蛋白染色代表增长已经出现在文化,而不是epithelial-mesenchymal过渡(EMT)。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液(BALF)特发性肺纤维化(IPF)患者促进纤维母细胞生长在肺泡上皮伤口。Vimentin-stained鼠肺泡上皮的主要文化2型细胞(AEC2)包含∼2 - 5%成纤维细胞损害之前,和之后攻击+ 24小时接触BALF从)对照组;b)过敏性肺炎(惠普);c) IPF;和d)自身免疫性疾病(AI)患者;e)的细胞。代表结果为每个组(n = 5)提出(比例尺= 400μm)。箭头显示主要原子能委员会增长在伤口内文化从控制和惠普患者BALF对待,同时增加vimentin-stained细胞被认为在文化和IPF AI BALFs治疗。f) IPF患者BALF中含有高水平的可溶性膜联蛋白V膜联蛋白V水平(量化人类膜联蛋白V ELISA)更高的BALF IPF和艾城的患者,与BALF水平控制。控制n = 5; IPF, AI and HP n=6. *: p<0.05; **: p<0.01, by ANOVA followed by Tukey's事后gydF4y2Ba测试。g)膜联蛋白V诱导细胞因子的释放原子能委员会,与人类BALF膜联蛋白V。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba受损的原子能委员会(小鼠肺上皮细胞(标定)-15行,以确保100%上皮表型)被孵化24小时有或没有ng 50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba膜联蛋白V,条件培养液(CM)对小鼠细胞因子筛选,使用微孔Milliplex 32细胞因子多路检测(美国Billerica的)。人类BALF细胞因子与膜联蛋白V密切相关,interferon-γ-inducible蛋白质(IP) 10和小鼠interleukin-8同系物,角化细胞化学引诱物(KC)和巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2释放受损原子能委员会针对膜联蛋白V .白血病抑制因子(生活)是人类所不能提供的用于获得人类BALF细胞因子面板数据。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:p < 0.03gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制。gydF4y2Ba
膜联蛋白V水平增加患者BALF的间质性肺病gydF4y2Ba
蛋白质组学筛选进行识别小说在人类BALF pro-fibrotic(在线补充蛋白质gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。膜联蛋白V是显示感兴趣的蛋白质独有人类BALF促进纤维母细胞生长在上皮的伤口,gydF4y2Ba与gydF4y2BaBALF介导上皮伤口愈合。一个人类ELISA证实显著增加膜联蛋白V含量从IPF患者BALF和自身免疫性疾病(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。从而为进一步研究膜联蛋白V被选自分泌与表面活性剂(AEC2gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),与损伤有关,然而,从未涉及在纤维化肺病发挥功能作用。gydF4y2Ba
肺泡上皮2型细胞分泌蛋白在膜联蛋白VgydF4y2Ba
特定的细胞因子与人类BALF膜联蛋白VgydF4y2Ba
我们首先确定哪些细胞因子与人类BALF膜联蛋白V含量。多路六个人类BALF细胞因子分析样本代表广泛的膜联蛋白V水平< 20 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba80 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba透露,五个40的小组处理的细胞因子与BALF膜联蛋白V浓度与r≥0.95: GRO /处于受控(r = 1.0), interferon-γ-inducible蛋白质(IP) 10 (r = 0.99),白介素(IL) 8 (r = 0.96),血管内皮生长因子,VEGF (r = 0.96)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (r = 0.95)。gydF4y2Ba
膜联蛋白V诱导细胞因子的释放鼠标MLE15原子能委员会,与人类BALF中膜联蛋白VgydF4y2Ba
四个细胞因子,从一个32岁的小组被培养分泌MLE15原子能委员会> 5的pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba为了应对24小时治疗膜联蛋白V (gydF4y2Ba图1克gydF4y2Ba),包括细胞因子,我们发现三个紧密相关(r > 0.95)和可溶性人类BALF膜联蛋白V含量。膜联蛋白V刺激释放IP10,角化细胞化学引诱物(KC) (GRO-α啮齿动物同系物)和巨噬细胞炎性蛋白质从受损的原子能委员会(MIP) 2。啮齿动物缺乏人类引发的直接同系物,但处于受控/ KC和CXCL2 / MIP2被视为功能性同系物(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。白血病抑制因子,第四细胞因子诱导的膜联蛋白V鼠标原子能委员会,是人类所不能提供的多路传输面板用于BALF、但在IPF肺升高(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
删除的膜联蛋白V IPF BALF减少纤维母细胞生长在肺泡上皮伤口gydF4y2Ba
膜联蛋白V耗尽三IPF BALF样品通过免疫沉淀反应(51 - 80 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba耗尽之前,≤10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba枯竭后,经ELISA),并将其添加到破损和新鲜受损的老鼠AEC2 24 h。膜联蛋白V损耗减少vimentin-staining细胞内的文化,特别是在伤口(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。免疫印迹分析文化溶菌产物证实vimentin-positive细胞的减少(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
损耗的膜联蛋白V特发性肺纤维化(IPF)支气管肺泡灌洗液(BALF)减少纤维母细胞生长在肺泡上皮的伤口。一)膜联蛋白V-depleted (-Anxa V)和未用尽的BALF或添加了PBS的和受损的老鼠AEC2 24 h,那么文化固定在4%多聚甲醛和波形蛋白染色(比例尺= 400μm)。的实验是代表三个独立实验使用不同BALF样本。b)免疫印迹显示波形蛋白表达在受损的老鼠AEC2处理两种不同的人类IPF BALFs±膜联蛋白V损耗。波形蛋白带修正的c)光密度定量肌动蛋白从三个西方墨迹显示少BALF-induced波形蛋白annexin-V损耗;n = 3;*:p < 0.05。gydF4y2Ba
膜联蛋白V添加到原子能委员会文化增加vimentin-staining细胞gydF4y2Ba
波形蛋白表达在主要诱导鼠AEC2文化治疗24小时,细胞和细胞龛之间与膜联蛋白V剂量反应关系的最大表达ng在50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。α-SMA表达式并没有改变膜联蛋白V治疗(没有显示)。gydF4y2Ba
2型细胞条件培养基从膜联蛋白V-treated肺泡上皮(AEC2)促进成纤维细胞增殖。)治疗大鼠的基本文化AEC2膜联蛋白V 24 h导致波形蛋白表达的增加存在剂量依赖的相关性,如代表所示免疫印迹;两个独立的实验中,光密度分析β-actin纠正;波形蛋白染色的控制和ng 50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba膜联蛋白V-treated AEC2文化,酒吧= 400μm 10×放大,规模。b)成纤维细胞没有增殖膜联蛋白V的反应gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba(在线补充gydF4y2Ba图1克ydF4y2Ba),治疗24 h和条件培养液(CM),治疗从老鼠AEC2 ng±50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba膜联蛋白V,在存在和缺乏血清。24小时后,细胞要么trypsinised,中和和统计,细胞溶解免疫印迹分析细胞增殖核抗原(PCNA),或为可视化与结晶紫染色。厘米从AEC2处理膜联蛋白V诱导成纤维细胞增殖,以细胞计数(n = 4;* *:p < 0.01;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba:p < 0.02gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制)和PCNA蛋白表达。图像显示结晶紫染色实验中血清在场;酒吧= 1000μm规模。gydF4y2Ba
条件培养基从膜联蛋白V-treated AEC2,但不是膜联蛋白V本身,促进纤维母细胞生长gydF4y2Ba
令人惊讶的是,膜联蛋白V没有直接刺激经济增长的纯纤维母细胞细胞系(WI38, NIH3T3和CCD-8Lu)添加多个剂量时24 h,以细胞计数和PCNA表达(在线补充gydF4y2Ba图1克ydF4y2Ba)。相比之下,从膜联蛋白条件培养液V-treated鼠AEC2诱导成人纤维母细胞的增长文化相比,从未经处理的细胞条件培养基(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
膜联蛋白V刺激释放从AEC2 pro-fibrotic蛋白质gydF4y2Ba
15蛋白质蛋白质组学筛选已确认,独有或过表达的条件培养基annexin-treated鼠AEC2(在线补充表2和3)。其中,13个蛋白质与IPF相关,组织纤维化、慢性受伤或EMT,包括两个分子与转化生长因子(TGF) -β1信号,CTGF和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI) 1 (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
增加了膜联蛋白V的另外两个蛋白质治疗(磷脂酶Cε和真核翻译因素)没有报道与纤维化。验证检查,CTGF被ELISA测定的数量。膜联蛋白V治疗MLE15原子能委员会诱导分泌CTGF增加1.5倍的水平gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的细胞(60.8±1.2gydF4y2Ba与gydF4y2Ba40.9±3.9 pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(p < 0.004);n = 3)。重要的是,蛋白质组学屏幕从肺成纤维细胞条件培养液治疗24小时±膜联蛋白V表明以上蛋白质是由成纤维细胞分泌(在线补充表4)。有趣的是,成纤维细胞分泌pro-fibrotic蛋白质胶原蛋白1 a1和a2, decorin和纤连蛋白膜联蛋白V .验证筛选、可溶性胶原蛋白水平都被证实可能升高1.5±0.06倍于膜联蛋白V对成纤维细胞条件培养基gydF4y2Ba与gydF4y2Ba从控制条件培养液(p < 0.02, n = 4)。分泌的胶原蛋白不是膜联蛋白诱导的V-treated MLE15。gydF4y2Ba
肺泡膜联蛋白V诱发炎症和胶原沉积增加小鼠的肺gydF4y2Ba
膜联蛋白V解决方案或车辆,检测内毒素,是管理8-week-old C57BL小鼠通过气管内的aerosolisation,每周两次为2周,在剂量范围从7.5到75 ng /肺。在14天后的最后一剂膜联蛋白V(28天后初始滴剂),地区肺部的损伤和炎症被认为膜联蛋白V-treated动物(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba),广泛分布在所有叶病变观察。肺接受低剂量(7.5 ng)没有不同于控制肺(没有显示)。Sirius-red染色证实周围间质胶原沉积增加地区的渗透和胸膜膜(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba)。肺组织羟脯氨酸含量升高1.4倍的膜联蛋白V在28天(膜联蛋白V治疗gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制肺0.25±0.02gydF4y2Ba与gydF4y2Ba0.18±0.02μg·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba肺;n = 4全肺/组)。这增加类似于1.6倍增加看到在28天post-bleomycin bleomycin-treated肺(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。肺部高分辨率ct机扫描annexin-treated后28天第一次滴注法lace-patterned的透明的膜联蛋白V显示纤维化trans-axial片出现在所有叶,和增厚interlobar和肺泡隔(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba)。膜联蛋白之间的主要区别发现V-treatedgydF4y2Ba与gydF4y2Bableomycin-treated肺在28天的持久性是渗透膜联蛋白V-treated肺,这可能是由于受损efferocytosis由于多余的膜联蛋白V (gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。膜联蛋白V-induced病变解决了膜联蛋白V停止治疗2个月后,但持续沿着胸膜增厚膜被认为在一些动物(没有显示)。gydF4y2Ba
气管内的aerosolised膜联蛋白V诱发渗透和胶原蛋白沉积在小鼠的肺。间质炎症和斑驳的小鼠肺纤维化的收到膜联蛋白V气管内的气溶胶,每周两次,坚持两周模拟慢性接触有限,见苏木精和伊红染色肺部分)控制和b) 75 ng膜联蛋白V,初始膜联蛋白V剂量后28天。4×放大;酒吧= 500μm规模。渗透的主要群体是Ly6G-positive细胞,由疣状(没有显示)。肺治疗剂量反映膜联蛋白V含量控制人类支气管肺泡灌洗液(7.5 ng),没有不同于控制肺(没有显示)。增加胶原蛋白检测d)的肺膜联蛋白V-treatedgydF4y2Ba与gydF4y2Bac) vehicle-treated老鼠,斑片状肺间质内的小天狼星红与领域的渗透,以及胸膜膜(箭头)的初始治疗后28天。20×放大;酒吧= 100μm规模。羟脯氨酸是升高1.4倍从小鼠肺玉米胚芽蛋白酶解物处理75 ng膜联蛋白V初始膜联蛋白V治疗后28天(p < 0.02, n = 4),增加类似于由博来霉素(1.6倍),28天post-bleomycin [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。微型计算机断层扫描的e)控制,f) bleomycin-treated肺癌和g)膜联蛋白V-treated肺。g)膜联蛋白V-treated肺膨胀20厘米的水膜联蛋白V (75 ng /肺)执行后28天第一膜联蛋白V治疗,显示了广泛的纤维化,视为lace-patterned混浊trans-axial片(较低的箭头),存在于所有叶,上部的箭头表示增厚intralobar隔膜;f) bleomycin-treated 28天(纤维化阶段)的肺损伤作为阳性纤维的控制,并显示不完整的纤维化(箭头所指)。尽管有相似之处,但膜联蛋白之间的主要区别发现V-treatedgydF4y2Ba与gydF4y2Bableomycin-treated肺在28天的持久性是渗透膜联蛋白V-treated肺。gydF4y2Ba
膜联蛋白V激活信号通路在原子能委员会和肺gydF4y2Ba
Wnt TGF-β,核因子(NF)κB和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路激活在75 ng膜联蛋白V-treated肺28天后处理(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba),如在IPF患者的肺gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。Wnt、MAPK TGF-β和PI3K / Akt通路被激活在1 h(膜联蛋白V接触老鼠AEC2,见gydF4y2Ba图5gydF4y2Bab。印迹phosphotyrosine显示感应高分子量的蛋白质(∼150 - 200 kDa)短期和长期治疗膜联蛋白V。MLE15原子能委员会作出了类似的反应(数据没有显示)。NF-κB通路的激活也被检测到,但是只有24 h后曝光,表明二次反应(数据没有显示)。gydF4y2Ba
膜联蛋白V激活信号通路在肺泡上皮细胞(aec)和肺。)溶菌产物三个控制和三个膜联蛋白V-treated老鼠肺部,在治疗后28天膜联蛋白V (75 ng /肺),被西方墨点法分析关键蛋白质的主要信号通路被激活在特发性肺纤维化。由于片状膜联蛋白的性质V-mediated肺损伤,整个肺都被用于确保数据代表。Wnt、转化生长因子(TGF) -β核因子κB和增殖蛋白激酶(MAPK)通路被激活膜联蛋白V治疗,在增加活性(act)β-catenin p-Smad2, p-IKBa和p-extracellular signal-regulated激酶(ERK),分别gydF4y2Ba与gydF4y2Ba他们nonphosphorylated形式。b)活性与MAPK信号蛋白,Wnt TGF-β和PI3K / Akt通路和高分子量(∼150 - 200 kDa)酪氨酸磷酸化蛋白1 h(膜联蛋白V接触后被发现老鼠AEC2。同样的结果被认为当小鼠肺上皮(标定)15原子能委员会细胞系(数据未显示)。c) ErbB2酪氨酸激酶磷酸化/活动被受体酪氨酸激酶(RTK)抗体阵列的溶解产物MLE15原子能委员会,治疗了5分钟和50个ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba膜联蛋白V在缺乏血清。激活ErbB2的膜联蛋白V证实了西方墨点法使用表皮生长因子(EGF) 10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba1分钟作为积极的控制。d) MLE15原子能委员会与ErbB2沉默(si) RNA转染或炒(sc) RNA (10 nM)使用Lipofectamine RNAiMAX(表达载体和生活技术,大岛,纽约,美国),然后为西方墨点法细胞溶解在48 h和72 h post-transfection确认沉默。e)条件培养基从MLE15原子能委员会,培养±膜联蛋白V±ErbB2沉默了nonconfluent井的成纤维细胞24 h,然后细胞细胞溶解的蛋白质印迹增殖细胞核抗原(PCNA)。污点是代表三个单独的压制实验,显示增殖细胞核抗原诱导成纤维细胞的增加AEC-annexin V条件培养基被废除当AEC2 ErbB2沉默(定量,由微PCNA乐队和细胞计数提出了在线补充gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
ErbB2磷酸化在原子能委员会是由膜联蛋白VgydF4y2Ba
一系列蛋白质的39个鼠标RTK抗体被用来识别潜在的RTK激活MLE15原子能委员会通过膜联蛋白V意外,ErbB2,表皮生长因子受体家族的一员,是唯一RTK的激活在原子能委员会发现膜联蛋白V治疗的5分钟之内,这证实了免疫印迹(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
沉默ErbB2或抑制ErbB酪氨酸激酶活性降低膜联蛋白从原子能委员会V-mediated pro-fibrotic蛋白质的分泌gydF4y2Ba
ErbB2是大中型企业的原子能委员会的有效沉默使用48 h与核治疗gydF4y2Ba与gydF4y2Ba炒(sc) RNA (gydF4y2Ba图5gydF4y2Bad)。条件培养基从MLE15原子能委员会处理ErbB2 siRNA /膜联蛋白,当添加到成年人类成纤维细胞24 h,诱导纤维母细胞生长比条件培养基从scRNA / annexin-treated原子能委员会,以PCNA表达(gydF4y2Ba图5gydF4y2Bae)和细胞计数(在线补充gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba调查还显示增殖细胞核抗原乐队的定量数据)。条件培养基从MLE15原子能委员会,处理膜联蛋白V的细胞渗透性的存在不可逆抑制剂ErbB酪氨酸激酶活性,PD 168393(10μM),也从膜联蛋白诱导纤维母细胞生长比条件培养液V-treated原子能委员会,以PCNA表达(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)和细胞生长(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。1.5倍增加分泌CTGF的原子能委员会由24 h膜联蛋白诱导治疗降低了ErbB激酶抑制和沉默ErbB2 (gydF4y2Ba图6gydF4y2Bac)。这些数据来自两个不同的阻断策略表明,膜联蛋白V-mediated ErbB激活在原子能委员会上游pro-fibrotic释放的因素,包括CTGF。的三个细胞因子释放annexin-treated原子能委员会,被发现与人类BALF中膜联蛋白V (IP10, KC和MIP-2),只有IP10被发现的下游ErbB RTK激活(在线补充gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba),这表明annexin-mediated释放KC和MIP-2发生了不同的机制。gydF4y2Ba
ErbB受体酪氨酸激酶抑制肺泡上皮细胞(aec)减少膜联蛋白V-mediated pro-fibrotic蛋白质的分泌。)条件培养液(厘米),从小鼠肺上皮(标定)收集15个原子能委员会一直与10 preincubatedμM ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂PD168393或二甲亚砜(抑制剂稀释剂)2 h后的膜联蛋白V ng(50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)24 h, nonconfluent文化添加了24小时的成纤维细胞。增殖细胞核抗原比较的井被细胞溶解蛋白免疫印迹细胞生长。条件培养基从原子能委员会处理膜联蛋白V诱导纤维母细胞生长与预期的一样,如图所示的诱导增殖细胞核抗原(PCNA)。相比之下,厘米从原子能委员会preincubated为2 h PD168393之前的膜联蛋白没有诱导纤维母细胞生长gydF4y2Ba与gydF4y2Ba厘米从原子能委员会处理PD168393孤单。b)平行井视为)是固定的,水晶紫罗兰色。c)膜联蛋白V-mediated结缔组织生长因子(CTGF)分泌物MLE15原子能委员会,以ELISA来衡量,是减少ErbB受体酪氨酸激酶(n = 4)或抑制ErbB2沉默(si) RNA (n = 3),通过方差分析图基的紧随其后gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba测试。兵:细胞外signal-regulated激酶;scRNA:炒RNA。*:p < 0.05。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
是知之甚少的起源和功能膜联蛋白V在体液gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。(≤20 ng·毫升的稳态水平gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)的可溶性膜联蛋白V,我们正常的人类BALF中发现可能来自正常的肺泡细胞营业额和分泌AEC2以及表面活性剂。我们检测到低水平的膜联蛋白V的培养基的老鼠AEC2 (∼2 ng·10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞),增加后gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba伤害(数据未显示)。培养大鼠AEC2和鼠标MLE15细胞治疗与膜联蛋白V公布的IPF患者BALF中发现高浓度pro-fibrotic蛋白质,以及促炎细胞因子,也发现在IPF BALF和关联与膜联蛋白V紧密(r≥0.95)水平。人肺成纤维细胞也回应了膜联蛋白V矩阵与纤维化相关的蛋白质的分泌。如果人类AEC2 IPF肺反应膜联蛋白V看到gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba与啮齿动物原子能委员会,以下临时场景疾病发展建议:损坏和/或异常激活AEC2 [gydF4y2Ba3gydF4y2Ba释放增加可溶性膜联蛋白V的水平,促进自分泌和旁分泌pro-fibrotic蛋白质的分泌。此外,phosphatidylserine-mediated巨噬细胞efferocytosis,从肺泡清除受损细胞,有效地阻碍了多余的膜联蛋白V,这面具的磷脂酰丝氨酸暴露在受损细胞的信号去除(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。因此,引起的渗透膜联蛋白V-mediated细胞因子会清晰的效率较低,导致进一步的细胞损伤和膜联蛋白V释放,因而保持了膜联蛋白V释放的周期,渗透和纤维化。小鼠的肺部浸润的持久性处理膜联蛋白V是符合这种猜测。gydF4y2Ba
小鼠的肺膜联蛋白V-treated显示早期纤维化肺病的特征,包括增加纤维化和炎症,与羟脯氨酸水平升高和Wnt增加、MAPK和TGF-β信号活动。膜联蛋白的激活TGF-β信号观察V-injured老鼠的磷酸化与Smad2 CTGF的增加和PAI-1 (TGF-β下游介质)显示与膜联蛋白v TGF-βAEC2刺激,分泌,激活受损AEC2 IPF的发展起着至关重要的作用通过促进EMT,胶原蛋白合成、和成纤维细胞增殖gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。Wnt信号通路的激活也发现膜联蛋白V-treated老鼠肺部,在IPF,和原子能委员会对膜联蛋白V治疗通过激活β-catenin和frizzled-related分泌蛋白质的分泌(sFRP) 1, Wnt靶蛋白,升高在IPF肺gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。MAPK信号通路的激活在IPF肺部和展品重要的相声TGF-β和Wnt通路,也激活膜联蛋白V-treated肺以及膜联蛋白V-treated老鼠原子能委员会。gydF4y2Ba
ErbB2酪氨酸激酶活性诱导在原子能委员会的5分钟内接触膜联蛋白V,并封锁使用两种不同的策略是有效地降低膜联蛋白的fibroblast-stimulatory活动V-conditioned原子能委员会的媒介。具体来说,膜联蛋白V-mediated CTGF释放原子能委员会发现ErbB2下游激活。诱导CTGF ErbB2激活后曾被报道成纤维细胞(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。还有待确定膜联蛋白V本身直接绑定到ErbB2在原子能委员会,和其他膜联蛋白家族成员是否可以从原子能委员会引起类似的反应。gydF4y2Ba
我们推测,减少过度肺泡膜联蛋白V稳态水平有可能适度多个通路和下游目标已经与纤维化肺,然而其个人封锁在临床试验中被证明是无效的。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢Gevorg Karapetyan和洛杉矶儿童医院的成员小动物成像的核心(美国洛杉矶CA)为他们无价的帮助肺微型电脑断层扫描。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
可以从本文的补充材料gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明:这项研究是由美国健康和人类服务部门,国立卫生研究院(NIH) (RO1 HL44060 d·沃伯顿;HL068597和HL109932 w·史;核磁共振弗雷R01 DK095004;和UO1 HL122681 w·史,r .护城河和d·沃伯顿),美国癌症协会(授予124678核磁共振研究学者Frey),洛杉矶儿童医院的帕萨迪纳市工会养老和花环基金会和韦伯基金会(d·沃伯顿)。为这篇文章一直存放在资助信息gydF4y2BaFundRefgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2015年1月7日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2015年4月25日。gydF4y2Ba
- 版权©2015人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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