文摘
在肺结节病,CD4细胞+t细胞表达t细胞受体Vα2.3积聚在肺部的HLA-DRB1 * 03+病人。探讨t细胞receptor-HLA-DRB1 * 03交互迄今未知抗原的识别,我们进行详细分析支气管肺泡灌洗液CD4 t细胞受体的表达+t细胞结节病的病人。
肺结节病的病人(n = 43)进行支气管镜检查和支气管肺泡灌洗。CD4 t细胞受体α和β链+t细胞通过流式细胞术分析、dna测序和t细胞的三维分子模型receptor-HLA-DRB1 * 03复合物生成。
同时表达的Vα2.3 Vβ22链被确认在肺部的HLA-DRB1 * 03+病人。积累Vα2.3 / Vβ22-expressing t细胞克隆高,相同或几乎相同Vα2.3链序列和inter-patient相似之处Vβ22链氨基酸分布。分子模拟显示特定的t细胞receptor-HLA-DRB1 * 03-peptide交互,与之前确定,sarcoidosis-associated波形蛋白肽,(Vim)429 - 443DSLPLVDTHSKRTLL,匹配HLA peptide-binding间隙和不同的t细胞受体功能完美。
我们证明,第一次大型的积累克隆特定Vα2.3 / Vβ22 t细胞receptor-expressing CD4的数量+t细胞的肺HLA-DRB1 * 03+结节病的病人。几个不同的接触点和HLA-DRB1 * 03 Vα2.3 / Vβ22受体分子之间建议vimentin-derived被肽。
文摘
克隆CD4+肺t细胞与HLA-DRB1 * 03分子显示特定抗原在肺结节病http://ow.ly/UB81x
介绍
CD4+t细胞无性系分布使用αβt细胞受体(tcr)识别抗原肽结合HLA-DR, dp和dq分子表面的抗原递呈细胞”。变量(V)的随机组合,加入(J),β链的多样性(D)基因片段和类似的任意添加和/或删除V-D-J核苷酸的连接方便一个极端分子多样性构成独特的抗原特异性的识别。Hypervariability主要发生在complementarity-determining地区(CDR) 3循环,构成抗原肽的主要接触点了HLA分子。V基因片段也含有germline-encoded CDR1 CDR2循环,这进一步调解细胞识别peptide-HLA复合物通过绑定框架地区HLA分子,peptide-binding外槽(1]。
在结节病,肺积累特征的t细胞表达不同的TCR Vα或Vβ基因显示特定抗原的存在2- - - - - -4]。Lung-compartmentalised CD4+t细胞是高度激活(5和生产辅助(Th) 1型细胞因子(6,7]。最近,一个重要的角色对Th17 [8)和调控T细胞T注册细胞(9,10)也被牵连。我们先前建立Vα2.3+CD4+总t细胞积聚在肺部HLA-DRB1 * 0301+和HLA-DRB3 * 0101+(11结节病活动性疾病患者,但不是其他炎症性肺疾病患者,如牙槽炎过敏或哮喘,也在健康个体12,13]。早些时候的TCRα链的分析支气管肺泡灌洗(BAL) Vα2.3+CD4+表示选择对特定抗原t细胞(14]。有趣的是,HLA-DRB1 * 0301和HLA-DRB3 * 0101分子结构上和功能上相似,似乎存在一个高度相似肽抗原,包括相同的抗原表位(15]。,因此,它是合理的sarcoidosis-specific抗原(s)可以由HLA-DRB3或HLA-DRB1 * 0301 * 0101的分子,这可能反过来被Vα2.3认可+t细胞(11]。
为了调查TCR Vβ剧目落下帷幕,我们最近应用一组21 TCR Vβ-specific抗体,覆盖70%的Vβ基因片段,在结节病的患者和健康对照组。频率的增加t细胞表达Vβ8、Vβ16或Vβ22观察肺的病人,和一个关联lung-restricted Vβ22扩张和HLA-DRB1 * 03+被确定(16]。
因此在这里,我们进行了全面的分析HLA-DRB1 * 03之间的联系+分子和lung-accumulated Vα2.3+Vβ22+CD4+t细胞。同时表达Vα2.3和Vβ22 BAL评估通过流式细胞术,这样的细胞被下一代测序(上天)进一步分析。我们提出一个三维分子模型展示提出Vα2.3之间的交互/ Vβ22 tcr和HLA-DRB1 * 03分子,符合特定的抗原表达。最后,通过结合测序数据和分子模型,我们能够提出一个潜在的候选抗原细胞骨架蛋白的形式波形蛋白,结节病病因学发现,这其中牵扯到的自身免疫过程。
材料和方法
主题,支气管镜检查和平衡
如前所述(执行支气管镜检查和平衡17)43例女性(16)与最近疾病发病平均年龄39年(表1)。有偏好的洛夫格伦综合征的患者,因为他们更经常HLA-DRB1 * 03+将强与肺积累的t细胞表达细胞Vα2.3基因片段(13]。洛夫格伦综合征患者急性发作中定义,通常会发烧,胸部影像学发现与双侧肺门淋巴结病,有时肺浸润和结节性红斑和/或双边踝关节炎。因此,26患者洛夫格伦综合征和17被归类为“non-Lofgren综合征”患者。所有患者HLA-typed(详细描述在线数据补充),通过典型诊断为结节病的临床和影像学表现,发现在支气管镜检查BAL包括高架CD4 / CD8-ratio和积极的活检诊断洛夫格伦综合征(不需要),符合世界标准的结节病和其他肉芽肿疾病协会(WASOG) [18]。书面知情同意了所有科目和斯德哥尔摩地区伦理审查委员会的批准。
排序的Vα2.3+Vβ22+CD4+BAL t细胞和细胞受体α和β基因扩增
表现型的Vα2.3+Vβ22+t细胞通过流式细胞术中描述在线数据补充。肺扩张的t细胞表达Vα2.3和Vβ22定义基于参考价值的3.5% (11)和4.0% (16),分别在健康个体。co-expression正常价值的计算值的0.14%,截止值定义一个Vα2.3+Vβ22+t细胞扩张被设置为3×0.14 = 0.42%,因此接近0.5%。在Vα2.3患者的一个子集+Vβ22+CD4+Vα2.3 BAL t细胞扩张+Vβ22+,Vα2.3+Vβ22−或Vα2.3−Vβ22+CD4+BAL细胞通过fluorescence-activated孤立的细胞分类(流式细胞仪),使用MoFlo XDP细胞分选仪(贝克曼库尔特;沥青、钙、美国)。在第二子集的病人,我们选择使用无序BAL细胞作为一种避免细胞变形和mRNA期间可能发生的损害排序。由于Vα2.3的显著扩张+Vβ22+CD4+t细胞,TCR Vα2.3 Vβ22信使rna链应该出现在足够高的水平是获得无论排序。高度相似的结果显示两种方法(即。有或没有事先流式细胞仪分选)同样成功。
PCR扩增Vα2.3和Vβ22基因组区域,分别进行了使用特定变量地区向前寡核苷酸引物和守恒的恒定区为每个细胞链反向引物。详细的信使rna提取方法,PCR条件和底漆提供了在线数据补充的信息。
统计分析
相对多的Vα2.3+和Vβ22+BAL CD4 t细胞(表示为百分数+BAL患者组之间t细胞)进行了计算和比较基于不同的存在与否HLA-DRB1和HLA-DRB3等位基因,分别使用双尾非参数Mann-Whitney紫外线测试。小动物——一张长有Wilcoxon签署等级测试应用Vα2.3成对比较+Vβ22+与Vα2.3−Vβ22−CD4+t细胞。分析使用GraphPad棱镜v.5.02软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国),p < 0.05被认为是显著的。
结果
tcr HLA-DRB1 * 03 lung-accumulated t细胞+结节病的病人
在HLA-DRB1 * 03+病人,我们验证了先前发现大型lung-accumulated CD4的数量+t细胞表达细胞Vα2.3基因片段,构成33.3% CD4(中位数)+BAL t细胞(图1一个和表2)。在HLA-DRB1 * 03−患者,相应的中值为5.2%,包括6名患者BAL CD4的接近20%+t细胞表达Vα2.3+(图1一个和表S2)。这些患者被发现HLA-DRB1 * 03−但HLA-DRB3 * 01+S1和S2(表)。TCR Vβ22+t细胞也发现积聚在肺部的HLA-DRB1 * 03+患者,平均9.2%的BAL CD4的价值+t细胞,而HLA-DRB1 * 03年的2.3%−患者(表2)。
同时表达Vα2.3和Vβ22基因片段被发现在所有BAL CD4的6.2%+t细胞在HLA-DRB1 * 03+与0.3%相比,HLA-DRB1 * 03−患者(图1 b和c,表2)。男人和女人之间没有区别可以观察到的Vα2.3 / Vβ22表达式。温和Vα2.3+Vβ22+BAL t细胞扩张被发现在一些HLA-DRB1 * 03−患者(图1 b和c);这些患者被发现DRB1 * 03−DRB3 * 01+。的相对百分比Vα2.3+Vβ22+CD4+BAL DRB1 * 03的t细胞+、DRB1 * 03−/ DRB3 * 01+和DRB1 * 03−DRB3 * 01−患者,分别提出了在图S1和S2的表。在HLA-DRB1 * 03+病人,Vα2.3的21.0%+同时肺t细胞表达Vβ22,Vβ22的62.3%+t细胞也表达了Vα2.3 (表2和图S2)。流式细胞术染色块Vα2.3代表+Vβ22+t细胞所示图1 d和图S2。
Vα2.3+Vβ22+BAL t细胞来自几占主导地位的克隆
细胞受体α和β链使用特定的引物测序Vα2.3 Vβ22结合CαCβ链,分别。在例1 - 4和8 - 10,lung-accumulated Vα2.3+Vβ22+CD4+t细胞的数量之前FACS-sorted测序,而5 - 7的病人和病人11日(包含Vα2.3总BAL细胞+Vβ22+t细胞扩张)。患者中8 - 11,信使rna浓度太低,使Vβ22链的PCR扩增(表3)。此外,患者中2、3、12和13日FACS-sorted Vα2.3+Vβ22−t细胞和Vα2.3−Vβ22+测序(表S3)。
在所有13例,1 - 4高度可变CDR3上地区占主导地位的序列被确定在任何给定的病人,和三个患者只有一个占主导地位的α链序列观察(图3,表3和表S3)。在六个病人,相同或类同的α链CDR3上地区序列,表达同一Jα基因段49 * 01 (表3和表S3)。具体来说,相同的氨基酸序列CVVN CDR3上lAGNQFYF观察患者5和7,类同CVVN CDR3上氨基酸序列我AGNQFYF, CVVNR一个TGNQFYF, CVVN米AGNQFYF和CVVN页面表GNQFYF患者8、10、12和3,分别从Vα2.3(后两种情况+Vβ22−排序BAL t细胞;表S3)。注意,亮氨酸残基(左)在108年CDR3上位置由异亮氨酸保守替换(I)患者8和蛋氨酸(M)的病人12。此外,亮氨酸残基位置108 CDR3上相同的氨基酸序列5和7之间共享病人是由两个不同的核苷酸序列编码(“CTA”病人5和“结论”病人7日)(图3一和表S4A)。同样,在患者1、2、3、4和6,115年的赖氨酸残基位置编码的亚美大陆煤层气有限公司或AAA。
β链,我们发现2 - 4控制克隆序列在每个病人,经常与首选的表达Jβ基因段2 - 1 * 01(的七个病人样本中发现4)(图3 b和表3)。发现了一个带正电的精氨酸明显更经常在一些患者的β链位置112(18序列四,22%)相比,出版参考β链序列从IMGT / LIGM-DB[检索23)(一个(1%)73;p < 0.001)。符合这一发现,带正电的精氨酸和赖氨酸氨基酸残基在职位112年或113年更频繁地出现在我们的样品(八18序列(44%),9(12%)相比73年引用β链序列;p < 0.001) (图3 b和图S3)。最后,一个带负电荷的谷氨酸倾向于出现在位置115多参考序列(p = 0.09)。此外,其中的几个相同的氨基酸被不同的核苷酸编码的组合(精氨酸谷氨酸在位置112 - 113年和在115位置,分别),表明一个重要的角色在特定的相互作用这些残留物和HLA-DRB1 * 03+分子,以及HLA-restricted抗原(图3 b和表S4B)。
Vα2.3的三维分子模型+Vβ22+识别涉及特定的识别残留的HLA-DRB1 * 03和vimentin-derived肽分子
结构信息迄今为止没有提供tcr Vα2.3 / Vβ22类。三元细胞的三维分子模型的合奏/ HLA /肽复合物创建基于CDR循环来自患者细胞获得测序结果。提出的三维分子模型Vα2.3 / Vβ22 TCR与HLA-DRB1 * 03(复杂图4一)透露,甘氨酸和天冬酰胺残留Gly73 Asn77,独特HLA-DRB1 * 03,通过发挥关键作用可能与细胞的相互作用残留Gln30和Ser51本地化CDR1αCDR2α循环,分别为(图4 b)。此外,一个基本的精氨酸的存在(或赖氨酸)残留在位置接近一半的112或113测序CDR3β循环使与带负电荷的交互HLA-DRB1 * 03残留Asp66或Glu69 (图4 c),或者带负电或极地残渣本地化中间的肽。除了这些观察,该模型还表明Vβ22残留Glu115,发现几乎所有的病人,可能是重要的选择与残留Ser31 Vα2.3链通过特定的交互和Tyr50本地化Vα2.3 CDR1αCDR2α循环,分别为(图4 b)。
基于这些发现,我们之前关于vimentin-derived肽Vim的发现429 - 443(DSLPLVDTHSKRTLL) [24),我们提出,波形蛋白可以结合HLA-DRB1 * 03利用残留Leu433 Thr436, Ser438和Thr441锚的位置,因此占据口袋1,分别为4、6和9。其他功能,包括肽残留Asp435 His437和Arg440与TCR CDR3β残留Arg112 Glu114,也观察到(图4 d)。
讨论
对TCR Vα2.3先前的研究+t细胞在结节病并没有考虑成对Vβ基因表达。在早期的尝试中,PCR技术被应用于解决这个问题,但是没有任何明显的发现(14]。最初使用新技术,我们发现了一个高于使用Vβ22 lung-accumulated t细胞从HLA-DRB1 * 03+患者(16),在目前的报告进一步建立,相当一部分lung-accumulated Vα2.3+t细胞也表达Vβ22 HLA-DRB1 * 03+病人。放大的t细胞表达Vα2.3和确定Vβ22 HLA-DRB1 * 03+病人,但不是在HLA-DRB1 * 03−病人(除了适度增加HLA-DRB3 * 01+病人)。分析细胞表面标记CD69和Vα2.3 CD27建议水平显著升高+Vβ22+t细胞被激活,也要区分Vα2.3更高程度相比−Vβ22−CD4+t细胞,这可能反映了抗原刺激。另外,高CD69的表达反映了tissue-resident记忆t细胞表型,建议的重要性对人类组织的免疫和炎性疾病25]。
最后,分子模型精确地定位特色HLA-DRB1 * 03分子及其相互作用与特定Vα2.3的残留物+Vβ22+细胞受体。这个模型还提供了优惠配对的分子洞察Vα2.3 Vβ22,以及HLA-DRB1 * 03,住宿的理想这个复杂的属性的一个潜在的抗原肽来源于细胞骨架蛋白波形蛋白。
Vα2.3+Vβ22+t细胞可能有一个增强的能力承认HLA-DRB1 * 03-epitope复合物,解释他们的肺的积累HLA-DRB1 * 03+病人。在最近的一项研究中,我们发现Vα2.3+t细胞积聚在BAL流体但仍在区域淋巴结和血液的正常水平,这表明吸入的假定抗原(26]。鉴于21%(中位数)lung-accumulated Vα2.3+t细胞在HLA-DRB1 * 03+病人也表达Vβ22,我们先前的研究关注Vα2.3+特异性的t细胞就可能被忽视的差异和功能机制,如细胞因子生产和激活标记表达式,不同Vα2.3之间+t细胞数量。考虑到co-expression Vβ22,抗原特异性和效应细胞的功能可以进一步详细地研究,采取Vα和Vβ基因片段在这些lung-accumulated t细胞。
几个主要的识别TCR Vα2.3和Vβ22序列在每个病人Vα2.3演示了一个高度+Vβ22+t细胞单克隆的肺,强烈暗示特定的抗原识别在肺结节病。这些克隆可能有助于进一步研究候选抗原,如ESAT-6 [27]或mKatG [28),揭开分子潜在的细节以及细胞与HLA-DRB1 * 03-peptide复合物。特定抗原的潜在存在局限于HLA-DRB1 * 03进一步支持我们的研究结果相同的长相和TCRα链序列在不同的患者以及相似的氨基酸TCRβ链内的不同位置。也,不同的核苷酸序列代码相同的氨基酸残基表示优先选择蛋白质含量,如抗原识别的情况下。总之,这些发现Vα2.3强烈支持我们的假设+Vβ22+肺t细胞识别和增殖sarcoidosis-associated和DRB1 * 0301 -限制抗原。
将一个三维分子模型阐明特定残留的可能安排在不同的CDR循环使我们建立共同的特征识别的Vα2.3 / Vβ22 TCR / HLA-DRB1 * 03分子复杂。众所周知,结节病,尤其是变异与洛夫格伦综合征等预后良好,强烈与HLA-DRB1 * 0301和HLA-DRB3 * 0101等位基因(29日,30.]。是否这么好的预后取决于HLA分子本身,链接到其他基因变异,或其连接lung-accumulated Vα2.3+Vβ22+t细胞可能是特别有效的消除抗原(31日),还有待阐明。然而,值得注意的是,Vα2.3越多+细胞BAL流体,预后越好32]。
虽然大部分残留在不同HLA-DRB1 * 0301和其他HLA分子内发现peptide-binding崩裂,对齐显示,两个特定的残留物,Gly73 Asn77,局部HLA-molecule远离呈现抗原决定基,与细胞残留很容易用于交互。有趣的是,这些职位在HLA-DRB3 * 0101是相同的,这也是Vα2.3的已知与装配+t细胞在肺部(11与Vα2.3],在某种程度上+Vβ22+t细胞。因此,我们假设Gly73和Asn77残留物,结合具体的、尚未确定,抗原表位,可以吸引TCR Vα2.3负责+t细胞到肺部,因为残留突出在所有分析CDR1α和CDR2α循环密切定位Gly73和Asn77见图4一。
此外,重复相同或几乎相同的Vα2.3-expressing t细胞可以互动的CDR3上地区HLA-DRB1 * 03分子(图4)。带电氨基酸发现在大多数Vβ22 CDR3上不同位置区域使直接与肽抗原交互窝藏带电氨基酸在位置5和7,分别。这表明Vα2.3基因段允许密切联系HLA-DRB1 * 03(或HLA-DRB3 * 01)分子,而Vβ22 CDR3上地区直接识别实际的抗原肽。因此,Vα2.3基因片段可能与其他,仍然不明,Vβ段承认其他抗原肽在复杂HLA-DRB1 * 03分子;这也可以解释inter-patient相似性较高的Vα2.3相比Vβ22 CDR3上地区。此外,自115年指控Vβ22氨基酸位置都位于远离肽,它们可能或者直接与相应交互带电氨基酸在Vα2.3 CDR1或CDR2区域,从而在一定程度上解释了优惠配对与Vβ22 Vα2.3。
根据本文提供的强大TCR-HLA协会,我们评估潜在多肽抗原的结合能力TCR-HLA复杂。有趣的是,之前确定vimentin-derived肽,Vim429 - 443(DSLPLVDTHSKRTLL),筛选了从HLA-DR汇集BAL细胞分子HLA-DRB1 * 03+结节病的患者(24),比赛完全进入HLA peptide-binding口袋和TCR Vβ22 CDR3上循环提出了分子模型。发现了相同的波形蛋白肽刺激HLA-DRB1 * 03的外周血t细胞+结节病的患者(33]。
胞浆内蛋白波形蛋白在内的自动抗原的其他疾病。肾脏炎症是系统性红斑狼疮的频繁和严重的表现,阻力指标(TII)作为炎症也许可以与常见的变体。波形蛋白的主要目标自动抗原最近被证明是TII [34]。波形蛋白表达的改变,增加了当地的肾脏,以及自身抗体滴定度高的血清anti-vimentin与疾病严重程度,观察患者TII,暗示系统性和本地自身免疫。波形蛋白是一个基本的蛋白质和可以通过激活巨噬细胞分泌的,它可能是在炎症条件下丰富的(35]。波形蛋白可以结合受体(dectin 1)表达在树突细胞,巨噬细胞和B细胞,从而加载和激活抗原递呈细胞(36]。同时,波形蛋白可以被你修改,从而成为auto-antigenic目标,如风湿性关节炎所示(37]。不管是否结节病可能是一种自身免疫性疾病,或有自体免疫性组件,最后仍然是不可能的。而联想到某些HLA类型和反应性上波形蛋白与自身免疫的概念,发病季节分布(30.),以及这样一个事实:结节病(特别是洛夫格伦综合征)通常是一种自限性疾病,会反对。此外,有瞬态感染后自身免疫的例子38,39),符合我们之前的发现强烈anti-vimentin复苏后患者的t细胞反应缺席(33]。
理论性质的分子模型是本研究的局限性,以及未来功能分析将致力于调查任何抗原波形蛋白的潜力。为此,我们计划研究B和t细胞反应对不同形式的波形蛋白(重组蛋白质、肽,你修改后的肽等)。t细胞细胞因子的生产和扩散将有关酶联免疫斑点和流式细胞术分析使用,我们将评估任何vimentin-specific Ig子类BAL液和血清。所有患者将HLA-typed,识别任何协会T细胞和B细胞反应的临床特征,认真的临床描述,包括监测疾病的特定子组的课程和单独考试如。洛夫格伦综合征患者,必须执行。然而,我们也需要考虑这种可能性,理想的波形蛋白的peptide-binding裂HLA-DRB1 * 03分子反映分子模仿,而“true”结节病抗原在现实中是一个外国代理等微生物。
总之,这部小说的识别lung-accumulated Vα2.3+Vβ22+t细胞克隆严格与HLA-DRB1 * 03分子,和inter-patient相似性TCRα和β链序列,强烈表明特异性抗原的识别这些患者。此外,TCR-HLA复杂造型建议vimentin-derived肽可能成为自身抗原在结节病的潜力结合HLA-DRB1 * 03分子与TCR CDR3β残留物和交互。在我们继续寻找sarcoidosis-specific抗原,波形蛋白将成为未来的研究特别感兴趣。
确认
作者感谢研究护士海伦Blomqvist, Margitha达尔和船舷上缘德森林以及生物医学分析贝妮塔Dahlberg娴熟的援助与样本收集和准备。同时,我们要感谢支持从生命科学实验室,国家基因组基础设施(进行下一代NGI)和Uppmax提供援助在大规模并行测序和计算基础设施。
脚注
编辑评论:欧元和J2016;47:707 - 709 . DOI:10.1183/13993003.01791 -2015]。
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:金融支持研究资助的形式收到瑞典心脏肺脏基金会,瑞典研究理事会垫Kleberg基金会国王奥斯卡二世禧基金会,斯德哥尔摩郡议会,瑞典胸部医生协会中心的炎性疾病,卡罗林斯卡医学院。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:没有宣布。
- 收到了2015年7月24日。
- 接受2015年9月30日。
- 版权©2016人队