抽象
呼吸衰竭的A型流感病毒(IAV)感染期间的一个主要的原因是对肺泡的上皮 - 内皮屏障的损坏。损害与蛋白质水肿液,红细胞和炎症细胞肺泡腔的水浸这一障碍的结果。迄今为止,肺上皮细胞和内皮细胞在此过程中的确切作用仍不清楚。
在这里,我们使用了体外共培养模型,以了解IAV损害肺上皮内皮屏障。人上皮细胞上的转孔膜的上半部接种而人内皮细胞上的下半部分接种。然后将这些细胞在共培养中生长和IAV加入到上室。
我们表明,添加IAV(H1N1和H5N1亚型)的导致显著屏障受损。有趣的是,我们发现,尽管内皮细胞安装于在相邻的上皮细胞病毒性感染的促炎/促凝血反应,肺泡上皮内皮屏障损伤独立地内皮细胞的发生。相反,屏障损伤用之间的上皮细胞的紧密连接的破坏有关,并特别是与紧密连接蛋白紧密连接蛋白4的损失。
综上所述,这些数据表明,在IAV感染期间,维持上皮细胞完整性是减少肺水肿的关键。
抽象
甲型流感病毒破坏呼吸道上皮细胞的紧密连接,特别是claudin-4http://ow.ly/UyGD5
介绍
甲型流感病毒(IAV)是引起全球显著的发病率和死亡率呼吸道病原体。典型地,IAV引起上呼吸道的急性感染。然而,在严重的情况下,IAV可以导致下呼吸道感染,导致病毒性肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。环至该呼吸功能障碍的发展是通过在肺泡上皮和内皮细胞形成的屏障破坏。该阻挡用于限制在肺泡腔流体的存在量,用上皮细胞组分是负责多数此屏障功能的[1]。当上皮 - 内皮屏障被损坏,肺泡空域可以与流体,红细胞和白细胞,最终防止气体交换和造成严重的呼吸功能不全[淹没2]。
目前,IAV如何破坏肺泡上皮-内皮屏障仍不清楚,有许多不同的机制被提出[2]。例如,肺泡上皮细胞不仅是保持肺不积水的必要细胞,也是IAV感染的靶细胞。因此,iav诱导的上皮细胞死亡被认为在屏障功能障碍中起着重要作用,在iav诱导的ARDS患者中,上皮细胞凋亡和坏死均有记录[3.,4]。心尖结络合物(AJC)连接相邻的上皮细胞也由上皮层形成的流体屏障的一个关键部分。所述AJC由紧密连接蛋白(如密蛋白和卵occludens)和粘着连接蛋白(例如E-钙粘蛋白)的。通过在细胞 - 细胞接触位点形成,所述调节AJC旁渗透性,并确保屏障完整性。几种病毒是已知的损害的各种不同的细胞类型的AJC [5- - - - - -9]。然而,据我们所知,没有研究迄今调查IAV是否会损害肺泡上皮细胞的AJC。
除了上皮细胞外,越来越多的证据表明内皮细胞在iav诱导的水肿和肺泡炎中也起着重要作用[10- - - - - -12]. 例如,在小鼠中,内皮细胞被认为是严重IAV感染期间观察到的“细胞因子风暴”的主要驱动因素[11]。这种过度的细胞因子产生可以直接(例如通过诱导上皮细胞凋亡)或间接(例如通过白细胞的募集)损坏上皮 - 内皮屏障[2,13,14]。IAV的炎症反应也可能导致组织因子的上调,组织因子可在内皮细胞和白细胞上表达。IAV感染时内皮细胞组织因子表达增加可导致异常的促凝状态,导致凝血因子消耗、微血管渗漏和肺出血[15- - - - - -17]。此外,促凝血状态诱导细胞因子如白细胞介素(IL)-6和IL-8 [释放18],这可能进一步加强iav诱导的细胞因子风暴和任何相关屏障损伤的严重程度。因此,iav感染小鼠促凝状态的降低与肺损伤的减少和存活率的提高相关[15]。最后,几体外研究表明,如上皮细胞,内皮细胞可以通过IAV [被感染8,19- - - - - -22],导致浓缩苹果汁的细胞凋亡和降解。但是,要认识到,相对于内皮细胞单层的感染研究是非常重要的体外细胞,内皮细胞在活的有机体内位于肺泡上皮细胞的单层的下方。因此,在何种程度上内皮细胞获得期间暴露于IAV在活的有机体内感染仍然是一个问题。确实,事后剖析对人死于IAV的病例和人流感动物模型的研究表明,IAV感染的是内皮细胞在活的有机体内缺席或罕见[23,24]。
在这里,我们使用了体外肺泡上皮-内皮细胞屏障共培养模型为上皮细胞和内皮细胞在iav诱导的肺损伤中的作用提供了新的认识。我们发现iav诱导的屏障损伤与上皮紧密连接完整性的丧失有关,特别是与紧密连接蛋白claudin-4的丧失有关。
材料和方法
细胞培养
的NCI-H441细胞(其形态学上显示II型肺和球杆细胞的特性)[25,26从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)获得]和在RPMI(GIBCO,Grand Island的,NY,USA)与培养10%胎牛血清(FCS)(Sigma公司,圣路易斯,MO,USA)和1%青霉素 - 链霉素(龙沙,巴塞尔,瑞士)。ISO-HAS-1细胞(先前已经描述,以显示内皮细胞的主要功能)27]是在相同的条件下进行培养。从Sciencell(卡尔斯巴德,CA,USA)获得,并在内皮细胞生长培养基(Sciencell)培养原代人肺微血管内皮细胞(HPMECs)。如先前所描述基本上建立的肺泡上皮内皮屏障的共培养模型(完整的细节请参见在线补充材料)25]。如果相关,细胞培养上清液与IAV疫苗接种的兔子的血清治疗,以防止再次感染IAV。(数据未显示)在防止IAV感染了该方法的效率通过流式细胞术证实。
病毒株和滴定
用流感病毒株A/PR8/8/34(PR8/34;H1N1)和A/Indonesia/05/2005(Indonesia/05;H5N1)模拟IAV感染。在胚胎鸡蛋(PR8/34)或Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞(Indonesia/05)上制备病毒库。感染病毒的滴度如前所述[28]。
细胞培养的病毒感染
在感染前2小时,transwell平板培养基用含2% FCS的RPMI进行刷新。IAV随后被添加到transwell系统的上舱。感染的多重性(MOI)是根据感染前transwell膜上上皮细胞的平均数量来确定的。
屏障完整性测量
一个EVOM voltohmmeter(世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)用STX-2筷子电极来测量跨屏障电阻(TER)。一个lternatively, permeability to fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (Sigma) was assessed by adding 2 μg of FITC-dextran to the upper compartment of the transwell system. Cells were then incubated for 3 h at 37°C, 5% CO2。50 μL of medium from the lower compartment was then added to 1 mM NaOH and the fluorescence intensity was measured on a microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland).
乳酸脱氢酶释放
根据制造商的指导使用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测(Promega,曼海姆,德国)测定乳酸脱氢酶(LDH)释放。
凝血酶生成时间
凝血酶生成的时间基本上与前面描述的一样[29]。详情参见补充材料。
RNA提取,cDNA合成和定量PCR
RNA提取在补充材料所述。的cDNA使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA,USA)并根据制造商的说明随机引物合成。的TaqMan引物/探针组合仪(Applied Biosystems,卡尔斯巴德,CA,USA)用于测量使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为管家基因选择的细胞因子的表达。问uantitative PCR (qPCR) was performed using the 2× universal PCR master mix (Applied Biosystems) and the following primer/probe combinations from Applied Biosystems: GAPDH (Hs02758991_g1), tumour necrosis factor (TNF)-α (Hs01113624_g1), chemokine (C-X-C motif) ligand 8 (CXCL8; Hs00174103_m1) and chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2; Hs00234140_m1). Reactions were performed on a 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems) and gene expression was calculated using the 2-ΔΔCT方法。
微阵列
补充材料中描述了微阵列数据的制备和分析。
电子显微镜
在电子显微镜下,在感染后24小时从经孔板的上下室取出培养基。在0.1 M cacodylate缓冲液(pH7.4)中加入1.5%戊二醛,固定细胞。室温下1小时后,用1%四氧化锇和0.1 M碳酸钙处理细胞。然后将这些细胞按乙醇分级脱水。将transwell膜切下并放置在塑料平埋模具上,然后将其嵌入Epon LX-112(Ladd Research,Williston,VT,USA)。将细胞的横截面(100 nm)切割并收集在碳涂层的彩色槽栅上,然后用乙酸铀酯(20 min)和柠檬酸铅(10 min)的饱和水溶液进行染色。有关成像信息,请参阅补充资料。在固定液中加入1%硝酸镧(Sigma)测量上皮细胞间连接的完整性。室温下5 h后,用0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)漂洗细胞并保持过夜以沉淀镧。然后用1%四氧化锇在0.1 M cacodylate缓冲液中处理细胞,该缓冲液在上层室中也含有1%硝酸镧。处理后,用binning 2(相当于样本水平11.5 nm的像素大小)以1900×的放大倍数采集图像。然后通过盲目测定模拟和IAV感染样本中镧阳性连接的数量来评估这些图像中紧密连接的通透性。
免疫荧光
生长在转孔膜细胞用4%多聚甲醛在室温下≥20分钟,随后用PBS洗涤。然后将细胞透化15分钟,在室温下用1%Triton X(Sigma)中。细胞s were stained with the relevant primary antibody followed by the relevant secondary antibody in PBS/1% bovine serum albumin (Sigma)/0.5% Triton X for 1 h at room temperature. Primary antibodies used were α-influenza A nucleoprotein (HB-65; American Type Culture Collection), α-E-cadherin (Bioss Company, Beijing, China), α-occludin (Sigma), α-junctional adhesion molecule 1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), α-zona occludin 1 and α-claudin-4 (both Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Secondary antibodies were Alexa 488 α-mouse IgG2a, Alexa 594 α-mouse IgG and Alexa 488 α-rabbit IgG (all from Life Technologies). Transwell membranes were then washed three times with PBS, excised and mounted on a glass slide with mounting medium containing 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Staining was visualised using a Laser Scanning Microscope 700 (LSM 700) (Zeiss, Jena, Germany) and staining intensity was quantified using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
统计分析
统计分析使用GraphPad Prism,用于Windows版本5.00(格拉夫派得软件,拉霍亚,CA,USA)进行。
结果
在体外联合培养模型中,IAV破坏肺泡屏障
为了理解上皮细胞和内皮细胞在IAV诱导屏障损伤中的作用,我们适于在肺泡上皮内皮屏障的先前所描述的模型[25]。简单地说,将肺泡上皮细胞(NCl-H441细胞)接种在可渗透的transwell膜上,而内皮细胞(ISO-HAS-1细胞)直接接种在transwell膜下(图1)。模拟IAV感染通过呼吸途径,PR8 / 34加入到上室和屏障完整性随时间测量。我nfection with IAV at an MOI of 1 or 0.2 resulted in a significant decline in the TER compared with mock-infected cells at 24 h post-infection (图2a)。相比之下,经模拟处理的细胞和经uv灭活的PR8/34处理的细胞的TER没有显著差异。与模拟感染细胞相比,IAV感染后对fitc标记的右旋糖酐的通透性也显著增加(图2b)。总之,这些数据表明,IAV感染能破坏这个体外上皮 - 内皮屏障。
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的示意图体外肺泡上皮-内皮屏障模型。
甲型流感病毒(IAV)对an造成损害体外肺泡上皮-内皮屏障模型。a)测量上皮-内皮共培养物随时间的跨界电阻(TER)。数据相对于感染前的TER记录(定义为100%),使用mock、uv灭活的IAV(株PR8/34 (H1N1))或IAV (PR8/34),以0.2或1的多重感染(MOI)表示。b)上皮-内皮共培养物对异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖的通透性。数据显示FITC的浓度检测到低舱后添加2μg FITC-dextran上层舱。感染IAV后24小时(PR8/34),将FITC-右旋糖酐加入上腔室,细胞孵育3小时,然后在下腔室测量FITC。c)与培养基(“mock”)或IAV (PR8/34, MOI 0.2)共培养transwell膜24小时后的代表性免疫荧光图像。细胞核染成蓝色,而IAV核蛋白染成红色。图像是来自同一膜的上皮细胞和内皮细胞。d)与培养基(“mock”)或IAV (PR8/34, MOI 0.2)共培养24小时后,在上清液中检测到病毒滴度。 The detection limit of the assay is indicated by a dotted line. TCID50:组织培养感染剂量中位数。e)单孔内皮细胞染色的跨well膜具有代表性的免疫荧光图像。细胞感染与c组相同剂量的IAV (PR8/34),感染24小时后拍照。细胞核染色为蓝色,而IAV核蛋白染色为红色。a、b和d)数据来自至少三个独立实验,以平均值±表示SEM。相对于模拟感染细胞的统计显着性通过计算)双向ANOVA或b)单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验。*:P <0.05;***:P <0.001。
为探讨IAV感染的细胞趋化性,对共培养的上皮细胞和内皮细胞进行IAV抗原染色。感染后24小时,MOI为0.2,上皮细胞呈IAV抗原阳性(图2c),具有细胞的〜40%被感染(数据未显示)。与此相反,无感染可以在内皮细胞或者通过免疫荧光来检测(图2c)或流式细胞术(数据未显示),即使在共培养的下腔室的培养基中检测到低水平的IAV (图2d)。然后,我们试图确定内皮细胞是否在所有许可,以IAV感染该系统。因此,血管内皮细胞的单一栽培生长Transwell小膜下方并IAV加入到上部隔室。一个t 24 h post-infection, endothelial cells stained positive for IAV antigen (图2e)。这些数据表明,尽管内皮细胞允许IAV感染,但当IAV接种于共培养的上皮层时,它们不会被感染,这很可能是由于与内皮细胞接触的病毒颗粒数量有限。
IAV诱导上皮细胞中比在体外肺泡屏障的内皮细胞更强的促炎性响应
以前的研究已经表明,内皮细胞是细胞因子风暴的IAV感染小鼠的过程中的关键因素[11]。因此,我们推断,尽管没有被感染IAV,内皮细胞可以通过响应于所述感染在相邻的上皮细胞产生促炎细胞因子在屏障功能障碍的作用。由于跨孔膜的渗透性,细胞因子检测在下隔室不必完全由内皮细胞产生。因此,为了通过内皮细胞,以评估细胞因子的产生,上皮细胞和内皮细胞群是从transwell小膜隔开。然后提取RNA,并在两种细胞群中进行微阵列辅助基因表达谱。IAV感染的上皮细胞显示261个差异表达基因相对于模拟感染的细胞。与此相反,暴露于IAV感染的上皮细胞的内皮细胞仅显示36组差异表达的基因相对于暴露于模拟感染上皮细胞的内皮细胞(图3)。内皮细胞中细胞因子基因的上调CXCL10,CCL2,CCL8,CXCL11和CXCL2。与抗病毒反应相关的其他几个基因(例如2',5'-寡腺苷酸合成酶)和白细胞粘附/血细胞渗出(e、 g.血管细胞粘附分子1)也差异表达。有趣的是,外CCL8和CCL2即是差异在内皮细胞中表达的所有细胞因子基因也在上皮细胞中差异表达的(图3),并经常到更高的层次。例如,CCL20几乎30倍于感染的上皮细胞中上调,而仅在两个倍上调内皮细胞。此外,若干不同的细胞因子(如CCL20和CXCL8)在上皮细胞中特异性差异表达(补充图S1)。为了证实这些发现,随后在共培养的上皮细胞和内皮细胞上对上皮细胞中差异表达的两个基因(TNF-α和CXCL8),并且是在差异内皮细胞(CCL2)表达的一种基因。与微阵列数据一致,TNF-α和CXCL8被显著更上调在上皮细胞中比在内皮细胞(图S1A)。出奇,CCL2在两种细胞类型中均上调,而微阵列数据未检测到CCL2上调感染的上皮细胞。最后,为了确认一些所选细胞因子也对蛋白质水平产生,ELISA中对细胞上清液从IAV-和模拟感染的共培养物(图S1b中)的上部和下部隔室进行。如所预期的,在上清液中检测到统计学显著更高水平的TNF-α和CXCL8的(上部和下部)IAV感染共培养物与那些被模拟感染相比较。总之,这些数据表明,尽管内皮细胞安装在相邻的上皮细胞的感染IAV促炎反应,上皮细胞是在此细胞因子响应的关键驱动体外系统。
以下A型流感病毒(IAV)感染共培养上皮和内皮细胞的基因表达谱。Co-cultures were infected with IAV (strain PR8/34 (H1N1), at a multiplicity of infection of 0.2) for 24 h. Epithelial and endothelial cells were then separated from the transwell membrane and used for transcriptional profiling. The 36 genes, and their corresponding fold changes in epithelial and endothelial cells, are shown here. The absence of a fold change value means that differential expression of the relevant gene was not detected in IAV-infected epithelial cells when applying a false discovery rate of 0.05 and a fold change cut-off of 2. A simple functional classification of the genes of interest is indicated. TNF: tumour necrosis factor; XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis; IAP: inhibitor of apoptosis.
的上皮细胞的结果IAV感染的促凝血状态
异常的促凝血响应先前已描述有助于IAV发病[15,16]。以确定是否IAV感染上皮细胞足以诱导在相邻内皮细胞促凝血状态,我们通过用任一IAV-或模拟感染的共培养物温育的人血浆测得的时间,以凝血酶产生。IAV感染的共培养物显示与模拟感染的共培养物相比,显著减少的时间到凝血酶生成(图4)。因此,尽管没有被IAV直接感染,内皮细胞仍能诱导促凝状态。
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时间凝血酶生成模拟感染或甲型流感病毒(IAV)感染的联合培养。IAV(株PR8 / 34(H1N1))以0.2的感染复数感染。共培养物用人类血浆和时间凝血酶测定生成孵育。数据是来自三个独立实验合并并表示为平均值±SEM。相对于模拟感染细胞的统计显着性t检验来计算。*:P <0.05。
内皮细胞不向体外肺泡屏障的损伤
而细胞因子的产生和促凝状态可能有重要的影响体内,我们希望确定这些或其他,观察促成了屏障损伤内皮细胞的特征体外。为此,我们比较了上皮-内皮共培养物和上皮细胞单培养物在iav诱导下的损伤。在两种情况下,随着时间的推移,IAV显著降低TER (图5一个)。但是,IAV感染的上皮细胞和单一栽培IAV感染共培养物(之间观察到在屏障受损无显著差异图5一个)。类似地,有在IAV感染单 - 和共培养物的渗透性,以FITC标记的葡聚糖无显著差异(图5 b)。为了证实这些观察结果不是使用永生内皮细胞或IAV模型的人工产物,我们建立了上皮细胞和原代内皮细胞(HPMECs)的共培养以及上皮细胞的单培养。这些培养物随后感染了高致病性禽流感病毒印度尼西亚/05。与我们之前对PR8/34和使用永生内皮细胞共培养的观察结果一致,随着时间的推移,印度尼西亚/05感染显著降低了上皮- hpmec共培养和上皮单培养的TER (图5 c). 但是,在感染的共培养和感染的单培养中,观察到的三者之间没有显著差异(图5 c)。总之,这些数据表明,IAV感染期间由内皮细胞产生的任何可溶性因子不发挥作用显著体外屏障的损伤。
甲型流感病毒(IAV)诱导的损伤与内皮细胞无关。a)用培养基(“mock”)或IAV(株PR8/34 (H1N1)感染后,在多重感染(MOI)为0.2的情况下,测量上皮-内皮共培养物(CC)和上皮单培养物(MC)的跨屏障电阻(TER)。b)感染IAV后CC和MC对荧光素异硫氰酸酯(FITC)-右旋糖酐的通透性(株PR8/34, MOI 0.2)。数据显示FITC的浓度检测到低舱后添加2μg FITC-dextran上层舱。感染24小时后将FITC-右旋糖酐加入上腔室,孵育3小时后在下腔室测量FITC。这些数据已被模拟减去。c)测定感染培养基(“mock”)或IAV株印度尼西亚/05 (H5N1)后CC和MC的TER。所有数据来自至少三个独立的实验,以平均值±表示SEM。a和c)的数据相对于记录只是在感染之前(其被定义为100%的TER表示),并且通过双向ANOVA计算出相对于模拟感染的细胞的统计显着性。*:P <0.05;**:P <0.01;***:P <0.001。
损坏体外肺泡屏障与对上皮细胞的紧密连接相关联的损伤
然后,我们试图确定哪些特征的上皮细胞层正在被IAV感染破坏。上皮细胞IAV感染可通过坏死或凋亡诱导细胞死亡[3.,4,三十- - - - - -32]。因此,我们推断所观察到的屏障破坏可以简单地反映IAV诱导上皮细胞死亡。为了检验这一假设,IAV感染和模拟感染的上皮细胞进行处理用于电子显微镜并检查形态学变化(图6)。两个模拟转和IAV感染的细胞表现出相似的超微结构特征。事实上,两个治疗组之间的唯一明显的区别是,IAV感染的细胞包含了某些与流感病毒颗粒的形态一致的颗粒。To confirm the absence of widespread cell death, the release of cytoplasmic LDH into the cell culture medium was also measured 24 h after IAV infection (图6 b)。由生长在转孔膜上皮细胞,以下模拟或IAV感染在LDH释放未观察到显著差异。总之,这些数据表明,上皮细胞死亡是不太可能占了体外IAV感染后的屏障损伤。
甲型流感病毒(IAV)不会引起广泛的上皮细胞死亡。上皮细胞生长上的转孔膜和感染了培养基(“模拟”)或IAV(株PR8 / 34(H1N1),以0.2的感染复数)。a) Representative electron microscopy images of epithelial cell monolayers 24 h after IAV or mock infection. b) Percentage lactate dehydrogenase (LDH) release of epithelial cell monolayers 24 h after IAV or mock infection. LDH levels were measured in the supernatants from the upper and lower compartments of the transwell, and percentage LDH release was calculated according to the manufacturer's instructions. Data are pooled from three independent experiments and shown as mean±SEM。
那么我们的理由是,像其他一些呼吸道病毒[5],IAV可能损伤肺部上皮细胞的浓缩苹果汁。因此,我们用电子显微镜和电子致密示踪剂镧测量IAV感染后AJC完整性。具体而言,镧 - 阳性的数量(即损坏)以下IAV或模拟感染细胞间连接测定(图7)。IAV感染后,显著更镧阳性上皮细胞间连接与模拟感染相比,这表明IAV感染损害AJC。然后,进行了六种不同的浓缩苹果汁的蛋白质免疫荧光染色(图7 b)。IAV-和模拟感染的细胞间未观察到透明occludin的-1,β-catenin和E-cadherin的染色无明显的差异。与此相反,有朝下列IAV感染的occludin和连接粘附分子表达降低的趋势。然而,最引人注目的是紧密连接蛋白 - 4染色以下IAV感染的明确损失。要确认相同的表型,可以观察到以下感染高致病性禽流感病毒,感染了印尼上皮细胞/ 05也被染色蛋白 - 4。类似于PR8 / 34感染,感染与印度尼西亚/ 05导致的claudin-4染色的显着损失(图7 c)。总之,这些数据表明,IAV损害肺上皮 - 内皮屏障体外通过破坏上皮紧密连接,特别是claudin-4。
甲型流感病毒(IAV)损害上皮细胞紧密连接。一个)的上皮细胞的代表性图像与镧处理。上皮细胞生长上的转孔膜和感染了培养基(“模拟”)或IAV(株PR8 / 34(H1N1),在感染复数为0.2(MOI))。一个t 24 h post-infection, cells were fixed (with lanthanum added to the upper compartment), processed for electron microscopy and the number of lanthanum-positive intercellular junctions were counted. An arrowhead indicates an intercellular junction that was considered lanthanum-negative whereas arrows indicate two intercellular junctions that were considered lanthanum-positive. Data are pooled from two independent experiments and the number of cell junctions and relative percentages are shown. Statistical significance was calculated by Fischer's exact test. ***: p<0.001. b and c) Representative immunofluorescence images of apical junction complex proteins of epithelial cells. Epithelial cells were grown on a transwell membrane and infected with either medium (“mock”) or IAV, strains b) PR8/34 (MOI 0.2) or c) Indonesia/05 (H5N1). At 24 h post-infection, cells were fixed and the nucleus and the relevant apical junction complex protein were stained (blue and green, respectively). The fold changes in fluorescence intensity in IAV-infected cells relative to mock-infected cells are also shown. Data are pooled from b) at least two or c) three independent experiments and shown as mean±SEM。ZO-1:透明闭合蛋白-1;JAM:连接粘附分子。
免疫球蛋白诱导的屏障损伤不依赖于上清液中存在的细胞因子
许多研究已经表明,促炎细胞因子对AJC [完整性有不利影响33]。因此,我们试图确定观察到的AJC损伤是否由IAV感染时上皮细胞产生的细胞因子所致。因此,感染iav和模拟感染的共培养物在感染后24小时收集上清液。感染IAV的细胞上清用抗IAV抗体处理(以防止再次感染IAV),并转移到未感染的上皮细胞。与使用模拟上清液相比,使用IAV上清液并没有导致TER随时间的显著下降(图8)。类似地,与IAV上清液处理没有增加渗透性FITC标记的葡聚糖(图8 b)。因此,这些数据表明,在IAV感染后,细胞上清液中既没有细胞因子,也没有任何其他可溶性因子导致观察到的屏障损伤。
上清液中存在的细胞因子对观察到的屏障损伤没有贡献。trans-barrier)测量的电阻(TER) epithelial-endothelial培养介质(“模拟”)治疗后,上层清液源自甲型流感病毒(IAV)来华的培养(应变PR8/34 (H1N1),在感染复数(MOI) 0.2)在感染后24 h (“IAV上层清液”),上层清液源自mock-infected培养在24 h感染后(“模拟上层清液”)或IAV感染(PR8/34,莫伊0.2)。使用抗IAV抗体(见材料和方法部分)处理IAV上清液,以防止再次感染IAV。数据与感染前记录的TER相关(定义为100%)。b)上皮-内皮共培养物对异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖的通透性。数据显示FITC的浓度检测到低舱后添加2μg FITC-dextran上层舱。在培养基(“mock”)、IAV上清液、模拟上清液或IAV感染处理24小时后,将fitc -右旋糖酐加入上腔室。细胞孵育3小时,然后在下腔室测量FITC。所有数据汇集自两个独立实验,使用来自四个独立实验的上清液,以平均值±表示SEM。相对于模拟感染细胞的统计显着性通过计算)双向ANOVA或b)单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验。***:P <0.001。
讨论
严重的IAV感染可破坏肺泡上皮-内皮屏障,导致肺水肿和呼吸功能障碍。虽然确切的机制尚不清楚,但上皮细胞和内皮细胞都被认为在这种损伤中起作用。
在这里,我们使用了体外上皮 - 内皮屏障的模型中IAV诱导屏障损伤探索各这两种细胞类型中的相对作用[25]。这种简化的方法在某种程度上受到一个事实的限制,即an是不可能的体外模型能完全反映复杂的相互作用,在IAV感染期间肺部这种情况发生。事实上,这种模式很可能反映的情况感染期间很早,当没有出现在肺(其存在也有可能对屏障完整性有重要影响),白细胞丰富。然而,这种模式确实负担研究员独特的机会,检查系统上皮细胞和内皮细胞更近似于在活的有机体内情况下,即由此内皮细胞和肺泡上皮细胞紧密并列,并只能由基底膜隔开。
本研究表明,虽然IAV受损上皮 - 内皮屏障体外,这与内皮细胞感染无关。这有点令人惊讶,因为还有很多其他的体外研究数据表明,内皮细胞的单一培养易受感染IAV [8,19,21,22]。事实上,我们还发现,在没有上皮细胞的情况下,内皮细胞对IAV感染具有许可性。然而,当从上皮侧接种IAV时,未观察到内皮细胞的感染。考虑到transwell系统下腔室的病毒颗粒数量有限,最可能的解释是,新的病毒颗粒从上皮细胞顶部释放,因此很少与相邻的内皮细胞接触。这与先前的研究一致,研究表明IAV主要由人类I型原始肺细胞的顶端释放[19]。或者,初始IAV感染上皮细胞可以允许紧密并列内皮细胞变得难治性感染(例如通过产生I型干扰素)。重要的是,在活的有机体内内皮细胞通过IAV的感染是罕见的[23,24,34,35]。因此,它是诱人的推测,在活的有机体内,上皮细胞作为这里已经描述来限制几乎相同的方式内皮细胞感染。
IAV感染期间小鼠的研究已经确定内皮细胞在肺中促炎性细胞因子的关键生产者[11]。因此,我们的理由是,内皮细胞体外尽管不被感染IAV,可能产生的细胞因子可发挥屏障破坏了重要的作用。然而,虽然内皮细胞表现出促炎性和促凝血响应,他们没有向观察到的屏障破坏。对这个观察结果的一个可能的解释是,内皮细胞衍生的细胞因子可能仅能够破坏肺泡屏障中白细胞的存在。例如,CCL8(我们发现被差异内皮但不是上皮细胞中表达)可以充当用于人单核细胞[强效化学引诱物36]。鉴于(单核细胞来源)的巨噬细胞是已知的,IAV感染过程中损坏肺上皮细胞中发挥了重要的作用[37],这是一种可能的机制,其中内皮衍生的细胞因子能促进屏障损伤在活的有机体内但不是体外。
在这里,我们首次证明,IAV破坏紧密连接,特别是幽闭-4,呼吸上皮细胞。在肺泡内,claudin-4同时由I型和II型肺细胞表达[38]。claudin-4敲除小鼠对5-羧基荧光素的通透性增加,肺泡液间隙减少,这一事实证明了claudin-4在肺功能中的重要性[39]。体外claudin-4的细胞转导使TER增加了50%[40]。此外,几个不同的病毒属于已知破坏跨越几个不同的细胞类型的单层[密蛋白表达和增加的渗透性6- - - - - -8]. 因此,推测IAV诱导的claudin-4丢失在观察到的TER下降中起主要作用。有趣的是,claudin-4的表达被认为比AJC的其他蛋白对细胞或微环境的变化更敏感[38]。因此,有可能的是,在浓缩苹果汁的其他蛋白质的减少将在时间点后可以观察到比本研究中使用的24小时的时间点。然而,这些数据清楚地表明,IAV可以破坏肺上皮细胞的紧密连接。
IAV破坏上皮细胞AJC的可能机制有多种。尽管有证据表明促炎细胞因子可降低上皮细胞TER,损害AJC [33],IAV感染期间产生的细胞外的细胞因子没有诱导屏障破坏我们的体外模型。这些数据表明,对AJC的损害是病毒感染本身的直接结果,正如先前在MDCK细胞中所描述的那样[9]。具体而言,Golebiewskiet al。(9结果表明,在一些高致病性H5N1 IAV毒株的非结构蛋白1 (NS-1)的羧基端存在一个ESEV共识基序,该基序通过一个PDZ结构域与所选择的宿主蛋白结合并影响其定位。其中一些PDZ蛋白(如Dlg1 (disc large homolog 1))在紧密连接的形成中至关重要,因此,流感病毒能够破坏AJC的形成。有趣的是,claudins也能结合PDZ蛋白,如Dlg1 [41]。因此,它是诱人的推测,IAV的组件能够间接通过结合并隔绝它们的同源结合配偶体破坏密蛋白的表达。
总之,本研究显示,肺泡上皮两种形式防止流体泄漏到肺泡腔的主要障碍是与IAV的在感染后的关键目标通过呼吸路径。这意味着改善和恢复肺泡上皮的完整性可能在降低IAV引起的水肿和ARDS的严重程度方面发挥重要作用。这仍然是今后研究的一个重要领域,希望在这方面越来越复杂体外楷模 (例如上皮细胞,内皮细胞和巨噬细胞),结合的三重培养在活的有机体内数据,将有助于确定具体的干预策略对肺泡上皮细胞和呼吸功能的恢复效果。
脚注
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支持声明:K.R.Short由国家健康和医学研究委员会(堪培拉,澳大利亚)C.J.Martin博士后奖学金(1054081)资助。这项研究部分由欧洲联盟第七框架方案安提戈涅项目(赠款协议编号278976)和弗吉尼亚财团资助,后者由荷兰基因组学倡议和荷兰政府资助(项目编号FES0908)。S、 Herold由德国研究基金会(SFB TR84 B2和SFB 1021 C5)和德国肺部研究中心(DZL)资助。M、 Bárcena由荷兰科学研究组织(NWO)MEERVOUD-836.10.003资助。本文的资金信息已存入FundRef。
利益冲突:披露能够随本文的在线版本中找到www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年8月3日。
- 接受2015年11月3日。
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