摘要
常见的流感病毒在新鲜的人气道黏液中被固定,可能是通过流感结合抗体http://ow.ly/yxu0305bqh6
致编辑:
气道黏液被认为是一个动态过滤器,可以将呼吸道病毒困在密集的黏液网络中[1],并迅速将它们连同呼吸道粘液一起清除。然而,病毒必须穿透气道黏液才能感染气道上皮细胞,我们和其他人已经发现各种病毒可以轻易地穿透生理黏液凝胶[2- - - - - -4].我们特别感兴趣的是,由于季节性爆发的流行和健康负担,气道粘液是否可以作为抵御流感病毒的屏障。有人认为,气道黏液通过在黏液上呈现唾液化的“诱饵”来预防流感,这些“诱饵”与流感血凝素结合,并将病毒粒子困在黏液中。另外,我们已经证明了宫颈阴道粘液中的抗体可以捕获病毒通过病毒表面的抗体与粘蛋白之间的多个低亲和力fc粘蛋白键,类似于魔术贴[4].为了深入了解气道黏液如何充当抵御流感的屏障,我们使用实时高分辨率多粒子跟踪技术,对人气道黏液中流感病毒粒子和病毒样颗粒(VLPs)的流动性进行了表征。
我们从选择性手术期间插管进行全身麻醉的健康成年患者的气管插管中收集未稀释的人气道粘液[5在典型的流感季节之外。这种粘液可能是气管局部分泌的粘液以及通过粘液纤毛清除从支气管/细支气管输送的粘液的混合物。由于具有内部荧光基团的野生型流感病毒粒子的制备极具挑战性,我们决定测量用胺活性Alexa Fluor染料(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)荧光标记的野生型H1N1(流感A/PR/8/34)和H3N2(流感A/Victoria/3/75)病毒的平移运动,这些病毒对黏蛋白没有明显的亲和力[6,7].我们使用多粒子跟踪对病毒运动进行量化[8],并发现H1N1和H3N2病毒粒子的运动在大多数气道黏液标本中受到强烈和一致的阻碍(图1一个,在线辅助电影S1和S2)。病毒粒子在气道黏液中表现为均匀的点状斑点,表明它们作为单个病毒粒子而不是凝集物被困在气道黏液中。在20秒的录像过程中,几乎所有病毒粒子(所有样本中>为80%,平均为95%)的移动小于其直径(~ 100nm),与水中的理论速度相比,病毒粒子在气道黏液中的移动速度减慢了约3000 - 4000倍。相比之下,用2kda聚乙二醇(PS-PEG)涂覆大小相当的乳胶纳米颗粒,以尽量减少粘膜粘连[9,10]在同一气道黏液标本中呈现快速扩散(图1一个、在线补片S3;P <0.05),表明流感病毒是通过与黏蛋白或其他粘液成分的粘附作用被捕获的。
为了研究呼吸道黏液中流感的捕获是否主要归因于血凝素与黏蛋白相关的唾液酸的结合,我们制备了VLPs,在核心处使用HIV-1 GAG-mCherry衣壳蛋白在内部进行荧光标记,并表达来自H1N1(流感A/PR/8/34) (WT-Inf)的神经氨酸酶和血凝素,或相同的神经氨酸酶和血凝素,其唾液酸结合域被删除(ΔSAB-Inf),因此不能直接与黏蛋白结合[11].有趣的是,WT-Inf和ΔSAB-Inf都被困在气道黏液中,其程度与H1N1和H3N2相似,大约98%的WT-Inf和97%的ΔSAB-Inf被固定在气道黏液中,缓冲液中的平均扩散系数分别比预期速度低1700-和1100倍(图1 b,在线辅助电影S4和S5)。病毒捕获与空间阻塞或神经氨酸酶功能受损无关,因为WT-Inf和ΔSAB-Inf VLPs都表现出类似的大小(使用Nanosight测量;Malvern, Malvern,英国)和神经氨酸酶活性(使用NA-Fluor流感神经氨酸酶测定试剂盒评估;生命科技)与野生型流感(图1 c).这些结果表明流感病毒可以在没有血凝素与粘蛋白唾液酸结合的情况下被困在人气道黏液中,并提示流感病毒固有的神经氨酸酶活性不足以克服生理性的人气道黏液。
利用全病毒ELISA检测,我们在气道黏液中检测到大量抗流感的内源性IgG和IgA(数据未显示),以及抗WT-Inf和ΔSAB-Inf VLPs (图1d, e).这就打开了一种可能性,即气道黏液中的流感特异性抗体可能通过将抗体-病毒复合物与黏液成分(如黏蛋白)交联来固定病毒粒子。我们试图在缺乏抗体的气道黏液中测量病毒和VLP的流动性;然而,我们不能通过透析充分去除Ig,可能是由于膜堵塞,并且从支气管上皮细胞的气液界面培养中分离出的粘液分泌物不能产生足够坚硬的基质来固定粘液胶乳纳米颗粒。在加入标记病毒之前,我们还尝试将未标记流感病毒比标记流感病毒多20倍的>混合到气道粘液中,以“饱和”粘液-抗体屏障,但在捕获标记流感病毒方面仍然没有观察到明显的差异。因此,我们通过追踪与流感病毒VLP制备相似但表达HIV YU2 gp160的HIV VLP,来研究粘液中缺乏结合抗体是否与更大的病毒流动性相关。我们在气道黏液中未发现hiv结合IgG或IgA (图1d, e),而HIV病毒极低频蛋白在气道黏液中的扩散能力显著提高(图1 b、在线辅助电影S6;p<0.05), > - 45%的HIV VLPs被归类为可移动的,集合有效扩散度比WT-Inf和ΔSAB-Inf高~ 10倍。在相同的气道黏液样本中,HIV VLP的流动性与PS-PEG的流动性相似(数据未显示)。
综上所述,这些结果表明流感病毒可以在不与粘蛋白上的唾液酸结合的情况下被捕获在人气道黏液中,这与人流感病毒具有血凝素的证据非常一致,血凝素优先与气道上皮上的α2,6连接的唾液酸结合,而不是与粘蛋白上的α2,3连接的唾液酸结合[12,13].在人气道黏液中捕获流感可能归因于流感结合抗体的存在,这种抗体可以将单个病毒粒子交联到黏液网状网络上。重要的是,病原体结合抗体和粘液凝胶之间的黏附相互作用提供了一种通用策略,使不同粘膜表面的粘液分泌物相对不适应性和非特异性的生物化学和微观结构得到增强,以适应不断变化的病原体谱。有效的流感疫苗仍然难以找到[14],而且越来越多的证据表明,全身中和抗体滴度可能与保护功效没有很好的相关性[15].我们的研究结果表明,根据诱导和分泌到粘液中的流感结合抗体的数量来评估疫苗的疗效可能很重要。另外,在高危人群中(如。教师和卫生保健工作者),局部注射流感结合抗体可能有助于减少患病的几率以及到达气道上皮的病毒载量。
黏液通常被认为是一种被动的、而不是动态的、适应性的屏障,因此在大多数粘膜感染的研究中被忽视了。从气管内导管收集的气道黏液中持续广泛地捕获流感病毒,这表明气道黏液可以作为对抗呼吸道病毒的有效扩散屏障,而流感病毒不太可能在气管内有效传播。相反,我们推测感染可能始于鼻窦和口腔受粘液保护最少或最容易受到病毒粒子撞击的部分,如软腭[16].病毒也有可能感染较小的传导气道,其中气道黏液屏障特性可能不那么强大。然而,就流感结合抗体固定粘液中的病毒粒子的能力而言,我们还没有确定覆盖下气道(支气管/细支气管)的粘液的屏障特性。在任何一种情况下,一旦初步感染确立,病毒可能会扩散到呼吸道的其他部分通过细胞间扩散[17].
异质性是黏液中纳米级实体(如颗粒和病毒)运输的一个标志。供体-供体之间的差异和粘蛋白网络的网格间距(孔径)的样品内差异都可能是由于样品之间或特定样品内局部粘蛋白或水含量的差异造成的。然而,通过使用相同样本的等份在不同条件下进行直接比较,我们发现流感病毒和VLPs始终被捕获或减慢,而PS-PEG和HIV VLPs明显更快。因为我们没有在任何气道黏液标本中观察到流感的快速流动,所以我们不能将黏液屏障的破坏与潜在的流感感染易感性升高联系起来。虽然流感是一种常见的传染病,但在任何时候,易感染和感染流感的人数都相对较低;事实上,尽管接触率高,病毒株不断进化,季节性流感发作率通常仅为5%至20% [18,19].未来的研究将样本库大大扩大到数百个气道黏液标本,可能会从易感人群中捕获足够数量的标本,以揭示气道黏液对流感的屏障特性的潜在差异。
补充材料
补充材料
请注意:补充材料不是编辑部编辑的,上传时是作者提供的。
电影S1erj - 01709 - 2016 - _movie_s1
电影S2erj - 01709 - 2016 - _movie_s2
电影S3erj - 01709 - 2016 - _movie_s3
电影S4erj - 01709 - 2016 - _movie_s4
披露的信息
确认
我们感谢Christina Parker(北卡罗来纳大学教堂山分校,北卡罗来纳州,美国)的技术援助。试剂由Suryaram Gummuluru(波士顿大学,波士顿,MA,美国)、Julie Nelson(北卡罗来纳大学,教堂山)和Peter Palese(西奈山医学院,纽约,纽约,美国)提供。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com
收稿日期:2016年3月14日|修订后接受日期:2016年10月05日
支持声明:本文的资助信息已存入公开出资人注册处.
利益冲突:可以在本文旁边的网站上找到信息披露www.qdcxjkg.com
- 收到了2016年3月14日。
- 接受2016年10月5日。
- 版权所有©ERS 2017