摘要
toll样受体(TLRs)和核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NLRs)是先天免疫传感器的两种主要形式,但它们在稳定性慢性阻塞性肺疾病(COPD)免疫病理中的作用尚不完全研究。我们的目的是研究稳定期COPD支气管黏膜中的TLR和NLR信号通路。
采用免疫组化方法,在不同严重程度的稳定期COPD患者(n=34)、对照组(n=12)和非吸烟者(n=12)的支气管黏膜中检测TLR2、TLR4、TLR9、NOD1、NOD2、CD14、髓样分化主要反应基因88 (MyD88)、toll -白细胞介素-1受体结构域含适应蛋白(TIRAP)以及白细胞介素-1受体相关激酶磷酸化- irak1和IRAK4的表达水平。支气管细菌负荷铜绿假单胞菌,流感嗜血杆菌,莫拉克斯氏菌属复活而且链球菌引起的肺炎采用实时荧光定量PCR检测。
与对照组相比,重度/极重度稳定期COPD患者支气管黏膜TLR4和NOD1表达增加。TLR4支气管上皮表达与CD4呈正相关+和CD8+细胞和气流阻塞。NOD1表达与CD8相关+细胞。支气管负荷铜绿假单胞菌直接相关,但是流感嗜血杆菌与气流阻塞程度成反比。细菌负荷与炎症细胞无关。
重度/极重度稳定期COPD患者支气管上皮TLR4和NOD1过表达,与支气管炎症和慢性阻塞性肺病相关铜绿假单胞菌细菌负荷,可能在COPD的发病机制中起作用。
摘要
TLR4和NOD1在稳定期COPD中的炎症、细菌负荷和积极的抗菌免疫反应http://ow.ly/S1fp308qcwp
简介
炎症在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制中扮演重要角色[1].微生物群与先天和适应性免疫宿主反应之间的共生关系已被假定[2,3.].宿主对微生物群挑战的免疫反应是平衡的,以维持诱导对病原体的保护性反应所需的微生物群多样性[2,3.].先天免疫系统通过模式识别受体(PRRs)识别微生物病原体,PRRs检测病原体相关分子模式(PAMPs)并诱导炎症宿主反应和激活适应性免疫反应[2,3.].
toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)和核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide binding oligomerisation domain, NOD)样受体(nucleotide binding oligomerisation domain, NLRs)是两种主要的PRRs,它们对病原性侵袭或组织损伤提供应答[4].TLR2识别革兰氏阳性细菌的脂磷酸(LTA)和革兰氏阴性细菌的一些非典型脂多糖(LPSs) [5];TLR4识别LPS和一些内源性配体[5], TLR9参与病毒A/D-和细菌B/ k型CpG DNA识别[6].CD14作为一种辅助受体(与TLR4一起)用于检测LPS,但只有在LPS结合蛋白存在的情况下才能结合LPS。尽管LPS被认为是其主要配体,但CD14也识别其他pamp,如LTA [7].
NOD1和NOD2通过识别肽聚糖成分来识别细胞内细菌,例如在几乎所有细菌中发现的一种muramyl二肽通过γ-d谷酰基-内消旋在革兰氏阴性细菌中发现的-二氨基海二酸[8].髓系分化主要反应基因88 (MyD88)依赖和-独立(涉及CD14)信号通路在TLR激活下游被激活[9,10].在受体刺激下,MyD88将白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)家族成员IRAK4招募到TLRs中,并诱导IRAK1磷酸化,随后依次激活蛋白AP-1激活和核易位和/或IκB降解和NF-κB核激活[11- - - - - -14].toll -白细胞介素-1受体域包含适配器蛋白(TIRAP)是通过TLR2和TLR4激活myd88依赖的信号通路所必需的[15].
这些先天传感器介导过程中的任何异常都可能导致过度炎症,这是由于先天免疫信号过度活跃或持续的代偿性适应性免疫激活[4,5].这些特征已在稳定期COPD患者的下气道中观察到[1].我们假设在更严重的COPD中检测到细菌蛋白的程度更高。本研究的目的是研究不同严重程度的稳定期COPD患者和对照组的支气管黏膜TLR和NLR信号通路与支气管细菌负荷的关系。
方法
主题
所有接受支气管镜检查和支气管活检的COPD患者和对照组均来自Veruno研究所(Veruno,意大利)Salvatore Maugeri基金会的呼吸医学部门。在COPD患者中,气流阻塞的严重程度根据当前全球慢性阻塞性肺病倡议(GOLD)标准进行分级(http://goldcopd.org).所有的戒烟者都停止吸烟至少1年。慢性阻塞性肺病和慢性支气管炎的定义是根据国际指南(http://goldcopd.org).所有COPD患者在支气管镜检查前6个月内病情稳定,无加重。所有受试者在支气管镜检查前一个月均未使用茶碱、抗生素、抗氧化剂、粘液溶解剂和/或糖皮质激素治疗。这项研究符合《赫尔辛基宣言》,并得到Salvatore Maugeri基金会(意大利维鲁诺)和费拉拉大学医院(意大利费拉拉)伦理委员会的批准。每位受试者均获得书面知情同意,并根据当地伦理委员会指南进行支气管活检。
受试者详细描述,肺功能检查,纤维支气管镜检查及支气管活检处理,免疫组织化学,免疫组织化学评分系统,双染色,细菌负荷定量,在体外在正常人支气管上皮细胞上进行的实验,并在补充材料中提供了统计分析的细节。
统计分析
每组使用的患者数量是基于之前的研究,这些研究检查了支气管活检中炎症细胞数量的差异[16].功能数据采用方差分析分析组间差异。方差分析后采用非配对t检验进行组间比较。形态学数据采用Kruskal-Wallis检验,组间比较采用Mann-Whitney u检验。采用Spearman秩法计算相关系数。p<0.05的概率值被认为是显著的。
结果
受试者的临床特征
我们获得并研究了58名受试者的支气管活检:34名稳定期COPD患者,12名肺功能正常的对照组吸烟者和12名肺功能正常的非吸烟者(表1).COPD患者分为两组:轻度/中度(GOLD I-II期,n=16)和严重/非常严重(GOLD III-IV期,n=18)。四组研究对象的年龄没有差异。三个吸烟组的吸烟史相似。1 s用力呼气量(FEV)1) % pred和FEV1/用力肺活量(FVC) %在总COPD患者(轻度/中度和严重/非常严重)和对照组(健康吸烟者和健康非吸烟者)之间差异显著。重度/极重度COPD患者的肺功能与轻度/中度COPD患者也有显著差异(ANOVA: FEV p<0.0001)1% pred和FEV1/FVC %值)。慢性阻塞性肺病患者总数的35% (n=12)和肺功能正常的健康吸烟者中25% (n=3)也有慢性支气管炎症状,但这并不显著。
支气管活检中的炎症细胞
免疫组化分析结果总结于表2.这些数据来自稳定的COPD患者,证实了先前报道的结果,重度/极重度COPD患者中性粒细胞数量较高(表2) [16].CD8也有升高的趋势+重度和极重度患者的细胞数量,但根据Kruskal-Wallis试验,这没有达到显著性。COPD合并慢性支气管炎患者与无慢性支气管炎的COPD患者中性粒细胞数量相似[16,17].
免疫组织化学
TLR和NLR信号通路的免疫组化研究结果总结在表2.
支气管上皮免疫组化
与不吸烟对照组相比,重度/极重度稳定期COPD患者支气管上皮中TLR4的表达增加(p=0.0027) (表2和补充图E1)。这些COPD患者与肺功能正常的对照吸烟者之间有显著性趋势(p=0.054)。与不吸烟对照组相比,轻/中度稳定期COPD患者支气管上皮中TLR4的表达也增加(p=0.024)。同样,与轻度/中度稳定型COPD患者(p=0.036)和不吸烟对照组(p=0.006)相比,重度/非常重度稳定型COPD患者支气管上皮中NOD1的表达增加(表2和补充图E2)。重度/极重度稳定期COPD患者与肺功能正常的吸烟者之间NOD1表达也趋于显著性(p=0.054)。
两种MyD88的支气管上皮表达(Kruskal-Wallis: p=0.059;Mann-Whitney: p=0.012和p=0.038)和TIRAP (Kruskal-Wallis: p=0.082;Mann-Whitney: p=0.035和p=0.047)在重度/重度稳定期COPD患者中,与轻度/中度COPD患者和肺功能正常的对照吸烟者相比,也倾向于增加(表2).研究的其他分子没有发现显著差异(表2).这些数据也总结在图1一个.
支气管固有板免疫组化研究
与对照组相比,重度/极重度COPD (p=0.027)和轻度/中度COPD (p=0.015)患者TLR4增加(表2和补充图E1)。与对照组吸烟者(p=0.022)和对照组非吸烟者(p=0.002)相比,重度/极重度COPD患者NOD1增加。与对照组非吸烟者相比,轻度/中度COPD患者也增加(p=0.023)。表2和补充图E2)。IRAK4在轻/中度COPD中呈升高趋势(Kruskal-Wallis: p=0.071;Mann-Whitney: p=0.017)与对照组相比(表2).研究的其他分子没有观察到统计学差异(表2).这些数据总结在图1 b.双染色鉴定CD8+CD68 (t细胞)+(巨噬细胞)和CD31+(内皮细胞)共表达TLR4和NOD1的细胞在3例具有代表性的COPD患者中进行。均值±seCD8百分比+TLR4+、CD68+TLR4+和CD31+TLR4+双染细胞分别为51±11%、54±12%、61±5%;均值±seCD8百分比+NOD1+、CD68+NOD1+和CD31+NOD1+双染细胞分别为31±10%、30±5%和43±5%(补充图E3)。
支气管活检中细菌负荷的定量
在支气管活检中定量细菌负荷的结果总结在表3而且图1 c.当数据用绝对数字表示时,流感嗜血杆菌与轻度/中度COPD (p=0.011)和对照吸烟者(p=0.0013)相比,重度/极重度COPD降低。两组间无显著差异铜绿假单胞菌,复活的而且肺炎链球菌(表3).为了评估所研究的每种细菌相对比例的变化,我们将这些数据表示为由所研究的四种细菌之和构成的总负载值的百分比。百分比铜绿假单胞菌与肺功能正常的对照吸烟者相比,重度/极重度稳定期COPD倾向于增加(Kruskal-Wallis: p=0.050;Mann-Whitney: p = 0.012);百分比流感嗜血杆菌重度/极重度COPD与轻度/中度COPD相比(p=0.029)和对照组(p=0.010)显著降低(表3而且图1 c).
TLR4 mRNA的定量分析在体外H2O2处理过的支气管上皮细胞
支气管上皮细胞用H2O2(100µM) 2 h后TLR4 mRNA水平显著升高(图1 d).
支气管活检中临床参数、炎症细胞数量、TLR和NLR信号通路表达与细菌负荷之间的相关性
在所有吸烟者中,支气管上皮TLR4免疫染色的程度与CD8的数量呈正相关+细胞(r = 0.630;p=0.018)和CD4+细胞(r = 0.580;P =0.029)在支气管固有板。此外,在所有吸烟者中,支气管上皮TLR4免疫染色程度与FEV呈负相关1% pred (r=−0.36;p=0.019)和FEV1/FVC % (r= - 0.39;p = 0.009)。当分析仅限于稳定的COPD患者时,支气管上皮TLR4免疫染色程度与FEV之间的相关性1% pred (r=−0.37;p=0.037)和FEV1/FVC % (r= - 0.50;P =0.005)维持(图2).在所有吸烟者中,固有层NOD1免疫染色与FEV呈负相关1% pred (r=−0.39;p=0.019),与CD8数量呈正相关+细胞(r = 0.538;p = 0.044)。
有趣的是,在所有吸烟者中,支气管负荷铜绿假单胞菌与FEV成负相关1% pred (r=−0.41;p = 0.012) (图3),而支气管负荷则相反流感嗜血杆菌,与FEV呈正相关1% pred (r=0.458;p = 0.005) (图3).单独研究时,COPD患者组也保持了这种相关性(r=0.424;p = 0.025)。
临床参数、细菌受体表达、炎症细胞数与细菌负荷之间无统计学意义。
讨论
本研究显示,与对照组相比,重度/极重度COPD患者支气管黏膜中TLR4和NOD1蛋白表达增强。此外,支气管上皮TLR4的表达与CD4的数量呈正相关+和CD8+细胞在支气管黏膜内与气流阻塞程度有关。NOD1表达也与CD8相关+细胞数量。气流阻塞程度与负荷的增加呈正相关铜绿假单胞菌减少的负荷流感嗜血杆菌在所有吸烟者和稳定期COPD患者的支气管活检中。
既往研究发现,轻/中度稳定期COPD患者支气管黏膜TLR4表达与对照组无显著差异,而CD8的表达比例与对照组差异无统计学意义+共表达TLR4的细胞数量增加[18].本文报道的结果之间的差异可能是由于所研究的COPD患者数量较少(n=8)和对照组(n=5) [18],也与COPD患者的严重程度不同有关。在所有吸烟者和COPD患者中,我们发现TLR4上皮表达与CD8数量显著正相关+和CD4+显示稳定期COPD患者支气管炎症与TLR4上调之间存在关联。此外,与我们目前的数据一致,通过Western blotting研究发现,与对照组非吸烟者相比,GOLD IV期COPD患者TLR4表达增加[19].相反,Leeet al。[20.]报道了TLR4水平下降与吸烟者肺裂解物中支气管梗阻增加和肺气肿评分增加有关,证实了需要进一步调查以正确定位我们目前的数据。这里,我们展示了CD8+、CD68+和CD31+在COPD患者支气管活检中,TLR4和NOD1的上调主要是由细胞参与的。一致,流式细胞术分析CD8+与对照组相比,COPD患者外周肺组织中共表达TLR4的细胞也有所增加[21].
TLR4识别革兰氏阴性细菌的主要表面成分LPS [5].脂质A是LPS的促炎成分,TLR4是识别脂质A的必要条件铜绿假单胞菌[22],提示其在重度/非常重度稳定型COPD患者支气管上皮的过表达可能对这些患者下气道的持续定殖有重要的感知和反应[23].有趣的是,在体外, TLR4激活NF-κB,并传播和维持细胞氧化/亚硝化应激,这些都参与了稳定型COPD的发病机制[1,24].
氧化应激在晚期COPD中更为明显[1),而在体外与烟草的接触[18]和氧化应激[25]可能上调TLR4的表达。在我们的在体外实验采用人支气管上皮细胞(16HBE)经H2O2,我们发现氧化应激诱导TLR4 mRNA表达。吸烟小鼠的最新证据[26].此外,臭氧-指示香烟烟雾显著增强tlr44周和12周后mRNA表达(分别为1.77倍和1.53倍)增强tlr4小鼠肺部的mRNA在暴露6周后完全消融N-乙酰半胱氨酸(I.M. Adcock,未发表数据)。综上所述,这些数据表明,氧化应激的增加可能也能够上调稳定期COPD患者支气管中的TLR4,尽管需要在人类中进行具体的研究来证实这一假设。
我们还发现,与对照组相比,稳定期COPD患者的支气管上皮和固有层中NOD1的表达增加,这表明这种细胞质蛋白参与了稳定期COPD患者支气管黏膜细菌细胞壁成分的识别过程[27].在体外人支气管上皮细胞挑战复活的显示被NOD1抑制剂阻断的CXCL8表达增加[28].此外,在体外NOD1激动剂激活人内皮细胞NF-κB [29],支持NOD1在维持支气管炎症中的作用。
与肺功能正常的对照组相比,重度/极重度稳定型COPD患者的支气管上皮中MyD88表达增加,CD14表达无显著差异,提示MyD88依赖的下游信号通路参与了稳定型COPD患者支气管黏膜的免疫病理。这与我们的数据一致,我们的数据显示,重度/非常重度COPD患者的支气管上皮中TIRAP表达增加,这是myd88依赖通路激活的一个指标(图1而且4) [15].
的减少流感嗜血杆菌与轻度/中度COPD患者相比,我们在重度/非常重度稳定型COPD患者和肺功能正常的对照组吸烟者的支气管黏膜中观察到的负荷与先前的研究一致,这些研究表明TLR4激活在清除小鼠肺中的这种细菌中起着基本作用[30.,31].这也与之前的研究结果一致流感嗜血杆菌在严重/非常严重的COPD肺组织中几乎不存在,在轻度COPD中增加[32].没有流感嗜血杆菌也可能为其他致病菌如新菌株的定植提供生态位铜绿假单胞菌[32,33].
我们关于支气管细菌负荷的数据与以前在肺实质组织中进行的研究不一致。这表明晚期稳定COPD患者与对照组患者的细菌总负荷无显著差异[34],并可反映所检查的不同下气道腔室。先前的研究清楚地表明,细菌总负荷从上气道到下气道和肺实质逐渐减少[32,33,35],这使得在总细菌负荷非常低的情况下,更难确定不同严重程度的稳定期COPD患者与对照受试者之间的显著差异。与对照组相比,这种差异也可能影响COPD患者支气管和肺组织(不同腔室)中发生的相关免疫宿主反应。C .的数据也加强了这些考虑abrera -Rubio等.[36]表明在稳定期COPD患者中,通过支气管活检和支气管肺泡灌洗分析得到的菌群组成比痰液和支气管抽吸样品分析得到的菌群组成更能代表下气道的细菌组成[36].
既不铜绿假单胞菌也不流感嗜血杆菌,以绝对数量或百分比表示,与炎症细胞(CD8+、CD68+中性粒细胞)或细菌相关分子(TLR4, NOD1)主要在支气管活检中表达。这一发现表明,在病情稳定的情况下,微生物群可能与支气管黏膜中发生的经典COPD炎症反应没有直接关系。这似乎与COPD加重期间的情况相反,后者伴随支气管炎症的增加[37],微生物群负荷[38和TLR4的表达[39]已被观察到。然而,目前尚缺乏对加重期COPD患者支气管活检中病原相关细菌及相关炎症反应的全面研究。此外,肺和肠道中微生物组成的变化与免疫反应的器官相关改变有关。然而,尚未有研究调查COPD病情加重患者肠道菌群的变化[40].
有趣的是,在日本COPD患者中,NOD2基因的某些单核苷酸多态性与更严重的疾病相关[41这个领域值得在未来进行更多的研究。此外,在我们目前的研究中,IRAK4和phospho-IRAK1都有利于NF-κB核活化[11,在所有研究对象的支气管上皮和固有层中均过表达。这表明支气管黏膜在COPD中被激活(图1而且4).一项使用下一代测序的更广泛的研究可能会确定这些患者炎症和免疫的精确差异。
作为本研究的局限性,并与其他作者一致[33],我们不能排除由于反复抗生素治疗导致的细菌负荷量化偏差,特别是在严重/非常严重的COPD患者中,即使在我们的方案研究中应用了抗生素治疗的1个月洗脱期。此外,该研究并没有检测戒烟对这些参数的影响,需要进一步的更大规模的研究来证实这些数据以及这里进行的亚组分析。
综上所述,重度/极重度稳定期COPD患者支气管上皮中TLR4和NOD1的过表达与支气管炎症和炎症的增加有关铜绿假单胞菌细菌负荷,可能在本病的发病机制中起作用。
补充材料
补充材料
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补充方法和表格erj - 02006 - 2016 - _supplement
图E1。对照组非吸烟者(图a)、肺功能正常的吸烟者(图b)、轻/中度COPD(图c)和严重/非常严重COPD患者(图d)的支气管黏膜显微照片,免疫染色(箭头表示一些免疫阳性细胞),以鉴定支气管上皮和固有层中的TLR4。结果具有代表性的来自12名非吸烟者,12名肺功能正常的吸烟者,16名轻/中度COPD患者和18名严重/非常严重COPD患者。阴性对照免疫染色,在鼻息肉切片中进行,包括不相关的山羊一抗(未显示)。酒吧= 30微米。erj - 02006 - 2016 - _figure_e1
图E2。对照组非吸烟者(图a)、肺功能正常的吸烟者(图b)、轻/中度COPD(图c)和严重/非常严重COPD患者(图d)的支气管黏膜显微照片,免疫染色(箭头表示一些免疫阳性细胞),用于识别支气管上皮和固有层中的NOD1。结果具有代表性的来自12名非吸烟者,12名肺功能正常的吸烟者,16名轻/中度COPD患者和18名严重/非常严重COPD患者。阴性对照免疫染色,在鼻息肉切片中进行,包括不相关的兔一抗(未显示)。酒吧= 30微米。erj - 02006 - 2016 - _figure_e2
图E3。重度COPD患者支气管黏膜显微照片,双免疫染色鉴定支气管固有层中共表达TLR4(分别为a、b、c)(棕色)和NOD1(分别为d、e、f)(棕色)的CD8+ (a、d)、CD68+ (b、e)和CD31+ (c、f)细胞(红色)。TLR4和NOD1用双氨基联苯胺底物显示,炎症细胞(CD8+, CD68+)和内皮细胞(CD31+)用快红底物显示。箭头表示双染细胞。酒吧= 15微米。erj - 02006 - 2016 - _figure_e3
披露的信息
补充材料
确认
作者贡献:A. Di Stefano, F.L.M. Ricciardolo, G. Caramori和I.M. Adcock参与了研究设计、数据解释和手稿撰写;P.J. Barnes, K.F. Chung, f.s Andò, P. Brun, a . Leonardi, L. Righi, D. Vallese, F. Cappello和B. Balbi对手稿进行了批判性修订;I. Gnemmi、D. Vallese和A. Di Stefano对数据的生成和数据分析的准确性做出了贡献。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作得到了毛盖里临床科学研究所的支持,SpA Società Benefit, Ricerca Corrente。I.M. Adcock和P.J. Barnes得到了威康基金会093080/Z/10/Z的资助。I.M. Adcock, K.F. Chung和P.J. Barnes得到了皇家布朗普顿和海尔菲尔德NHS基金会信托基金和伦敦帝国理工学院国家卫生研究所(NIHR)呼吸疾病生物医学研究部门的支持。本文的资助信息已存入公开出资人注册处.本出版物中表达的观点是作者的观点,不一定是NHS、NIHR或卫生部的观点。
利益冲突:可以在本文旁边的网站上找到信息披露www.qdcxjkg.com
- 收到了2016年10月12日。
- 接受2017年1月20日。
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