文摘
气道黏膜下腺体浆液性细胞表达网站的囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)和对液体分泌进行航空公司很重要。阐明如何神经肽调节浆液性细胞,我们测试了如果人类鼻鼻甲骨浆液性细胞分泌碳酸氢盐(HCO3−),重要的粘液聚合和抗菌肽的功能,在刺激cAMP-elevating——血管活性肠肽(VIP)和如果这需要雌性生殖道。浆液性细胞刺激与VIP展出∼15 - 20% cAMP-dependent降低细胞体积和0.15∼单位减少细胞内的pH值(酸碱度我),反映了Cl的激活−和HCO3−分别分泌。HCO3−分泌物是直接依赖于雌性生殖道和CF患者细胞中缺席。相比之下,神经肽Y (NPY)减少VIP-evoked阵营增加,雌性生殖道的激活和Cl−/ HCO3−分泌。文化的主要模型保持浆液性浆液性细胞表型确认VIP、NPY的激活和抑制的影响,分别在流体和HCO3−分泌。此外,VIP增强抗菌肽分泌和抗菌功效的分泌物而NPY降低抗菌功效。相比之下,NPY增强细胞因子释放而VIP减少细胞因子释放CFTR通过一种机制,要求检测。作为VIP、NPY水平上调过敏等疾病,哮喘,慢性鼻窦炎,平衡这两个肽在气道粘液浆液性细胞流变学和炎症反应控制。此外,雌性生殖道电导在浆液性细胞的损失可能导致CF病理生理学通过增加浆液性细胞炎症反应除了直接损害Cl−和HCO3−分泌。
文摘
VIP、NPY在过敏和哮喘,神经肽上调分别反向调节CFTR-dependent分泌和炎症气道黏膜下腺体浆液性细胞,并分泌的液体线进行航空公司http://bit.ly/2FWNT29
介绍
分享几个阻塞性气道疾病表型的浓稠粘液,包括慢性鼻窦炎(CRS),囊性纤维化(CF)、哮喘和慢性阻塞性肺病(1- - - - - -3]。从鼻鼻甲骨到小支气管,很大一部分airway-surface液体(ASL)和粘液是由粘膜下层的外分泌腺(3]。腺的浆液性细胞的表达CF跨膜电导调节器(雌性生殖道)[3]。观察堵塞腺导管和腺肥大、增生和感染在CF (3)表明,缺陷CFTR-dependent浆液性分泌物有助于CF病理学。完整的CF腺体分泌较少的液体在回应cAMP-elevating受体激动剂等——血管活性肠肽(VIP)与non-CF腺[3]。腺肥大、导管堵塞、过量粘液也观察到在COPD和哮喘3),与腺肥大在致命的哮喘(更常见4]。
重碳酸盐(HCO3−)由浆液性细胞分泌促进聚合由近端粘液细胞分泌黏蛋白(5)(补充图S1a)。HCO3−抗菌肽分泌的功效也是至关重要的浆液性细胞(3]。然而,浆液性细胞分泌HCO机制3−是未知的。确定这些机制可能产生见解CF和其他疾病的病理生理学表现出改变粘液分泌或流变学。我们之前研究鼻HCO浆液性细胞3−在cholinergic-induced分泌分泌(6),这在很大程度上是完整的CF (3),因为它是由Ca2 +激活的氯−和HCO3−通道(中国)TMEM16A [7]。我们最初的目标是直接测试如果浆液性细胞还分泌HCO3−通过雌性生殖道VIP刺激期间,如果发生这种情况,如果TMEM16A可以替代在雌性生殖道的损失。
进一步的目标是了解贵宾和神经肽Y (NPY)、两个调节气道炎症性疾病,交互控制气道分泌物。副交感神经VIPergic [8,9]和NPYergic [10,11)神经元存在于呼吸道,可能增加粘膜从过敏性鼻炎患者12)或刺激性的有毒鼻炎(13]。一些神经co-express VIP、NPY (14),包括附近的腺体(15,16]。VIP、NPY在鼻息肉的椎弓根,暗示他们可能在息肉形成中发挥作用17]。激活巨噬细胞(18)或上皮细胞(19)也可以NPY,也许是因为NPY直接抗菌效果(20.]。高架NPY在哮喘21)可能把心理压力与过敏哮喘急性加重(22]。老鼠缺乏NPY或NPY1R减少过敏性气道炎症(23]。外的其他研究气道建议NPY增加T辅助(Th) 2反应(24,25]。NPY和NPYR1表达升高小鼠肺流感后,和淘汰赛NPY减少疾病的严重程度和白介素6 (IL)的水平(18]。过敏性鼻炎患者鼻腔分泌物与VIP浓度升高而控制个人在基线26]在过敏原的挑战[27]。
最近强调了需要说明的神经肽调节黏膜下腺体在阻塞性肺部疾病28]。VIP的cAMP-dependent活化剂的作用建立分泌(3),但NPY的作用尚不清楚。鸡尾酒的NPY和去甲肾上腺素抑制培养气管腺糖蛋白分泌细胞(29日在雪貂,NPY抑制大量粘液分泌气管(30.),但几乎没有机械的数据如果/ NPY如何影响浆液性细胞。NPY受体通常是G我耦合,可以减少营对G的反应年代耦合的VIP受体(31日),减少分泌降低CFTR蛋白激酶A (PKA)激活检测。此外,VIP、NPY免疫调制剂(32)和细胞因子调节腺分泌。
我们检查了VIP、NPY的影响在初级浆液性细胞分离人类鼻腺。细胞研究强烈以及气液界面(ALI)文化模型,保留的浆液细胞标记物的表达,促进分化的研究和与人类巨噬细胞共培养。结果有助于我们理解以下呼吸道浆液性细胞和雌性生殖道分泌物和炎症的作用,表明阻塞性气道疾病的治疗靶点。
方法
实验程序
隔离主要浆液腺泡的细胞,免疫荧光和活细胞成像的细胞体积,pH我,Cl−进行了描述(6,33]。文化腺浆液性细胞进行了描述(34]。美国手语高度,手语pH值测量,elisa和细菌化验报告(27,35]。更详细的方法和试剂提供的使用补充材料。
研究批准
组织是依法获得宾夕法尼亚大学指南关于剩余临床材料研究(IRB协议# 800614),美国卫生与人类服务部标题45 CFR 46.116,和《赫尔辛基宣言》。鼻甲42 non-CF样本和9 CF患者(7ΔF508 /ΔF508ΔF508 / G542X之一,和一个ΔF508 / E585X)使用(补充表S1)。
统计数据
数据分析在GraphPad棱镜。多重比较方法使用方差分析Bonferroni(预选的成对比较),Dunnett(比较一组控制)或Tukey-Kramer测试后(所有值的比较)。一个假定值< 0.05被认为是显著的。所有数据都意味着±扫描电镜从独立实验用细胞≥4个病人。最小的患者身上观察变化之外的影响雌性生殖道基因,如所描述的补充材料。数据点在每个图代表独立的实验中,其中一些使用单独的细胞培养,起源于同一个病人(常见的研究使用阿里文化)。在这种情况下,同等数量的独立实验中,通常两个,从每个病人使用细胞执行,以确保每个病人的细胞同样代表从任何一个病人防止细胞影响结果的准确性。
结果
VIP刺激Cl−和HCO3−通过雌性生殖道分泌
粘膜下腺体腺泡的细胞(补充图印地鼻甲)从人类分离(33]。展出浆液腺泡分泌颗粒溶菌酶免疫荧光(补充图就是S1c),基底为VIP受体免疫荧光(补充图S1d和e),顶端TMEM16A和雌性生殖道免疫荧光(补充图S1f和g)所描述的6,7,33]。孤立的浆液细胞分泌研究使用联立微分干涉对比(DIC)测量细胞体积和定量指标染料的荧光显微镜测量浓度的离子参与驾驶分泌(Cl−/ HCO3−),一个技术开创了唾液细胞用于浆液性细胞(6,7,33]。
营人类鼻浆液性细胞的刺激导致囊性纤维化跨膜受体(雌性生殖道)端依赖Cl−和HCO3−分泌。)图显示使用细胞体积测量跟踪液分泌,主要由Cl−结合同步量测pH值我跟踪HCO3−分泌。b) Non-cystic纤维化(CF)浆液性细胞刺激腺苷cyclase-activating forskolin(上)或G年代耦合的受体激动剂——血管活性肠肽(VIP)(底部)展出∼15%收缩反映液体分泌的激活。c和d)细胞non-CF病人,forskolin (c)或VIP (d)性收缩(∼15%;绿色)伴随着瞬态降低pH值我(0.1∼-0.15单元;灰色)持续二级alkalinisation紧随其后。CF细胞表现出明显减少收缩和酸化;随后的alkalinisation完好无损。超高频)酒吧图表显示收缩峰值(绿色)和酸化(灰色)non-CF (eg)和CF (h)细胞。Forskolin-induced收缩和酸化被雌性生殖道抑制异烟肼172(10µM) (e)。VIP-induced收缩和酸化被雌性生殖道抑制异烟肼172 K+每通道抑制剂clofilium和克霉唑(30µM) (f), Ca2 +激活的氯−通道抑制剂NFA(100µM), T16A异烟肼-A01(10µM),中国商用飞机有限责任公司异烟肼-A01(10µM)或4,4’-diisothiocyanostilbene-2-2”-disulfonic酸(做;1毫米)没有影响VIP-induced反应(f),但阻止碳酰胆碱(CCh;100µM)反应。CF细胞表现出最小反应VIP但完整的反应。”VIP反应恢复TMEM16A-activator E行为(25µM)。所有实验在37°C公司为5%2/ 25毫米HCO3−。在超高频数据意味着±扫描电镜5 - 8个人实验从≥4个人的病人(1 - 2实验每名患者)。意义由单向方差分析,Bonferroni期末测验。我)图显示激活的浆液细胞分泌VIP, Cl−和HCO3−通过雌性生殖道流出(水、局部完整腺体)导致细胞体积和pH值降低我。涌入的Cl−尽管NKCC1和HCO涌入3−通过NBC(两管基底局部无损腺体)维护Cl的驱动力−和HCO3−射流在持续分泌。* *:p < 0.01与控制;# #:p < 0.01与贵宾;¶¶:p < 0.01与CCh;+ +:p < 0.01与non-CF。
上皮分泌液体的主要驱动因素是Cl−。浆液细胞收缩在受体激动剂刺激反映流出细胞K+和Cl−在激活osmotically义务水的分泌和运动。细胞肿胀在切除受体激动剂反映了溶质的吸收通过机制,维持分泌,如Na+K+2氯−co-transporter NKCC1 [7)(图1一个)。人类鼻腔浆液性细胞萎缩了∼20%当刺激cAMP-elevating受体激动剂forskolin或VIP (图1 b),因为之前报道(33]。
神经肽Y (NPY)减少分泌反应——血管活性肠肽(VIP)通过减少离子流出尽管囊性纤维化跨膜受体(雌性生殖道)在原发性鼻腺浆液性细胞。)代表痕迹显示细胞体积(绿色)和pH值我(灰色)细胞刺激与VIP炒NPY (scNPY;左)或NPY(右)。b)条形图显示峰值响应。细胞刺激与VIP NPY的存在表现出减少收缩(Cl−分泌)和初始酸化(HCO3−分泌)。意义由1路的方差分析与Dunnett测试后(VIP只是作为对照组)。* *:p < 0.01与控制。c)代表不3−替换实验显示6-methoxy——的变化N——(3-sulfopropyl) quinolinium (SPQ)荧光细胞外Cl的替换−没有3−导致减少(Cl−]我SPQ荧光和变化。荧光的变化反映了相对质膜离子渗透率。向下偏转等于减少(Cl−]我。d)左边是条形图的初始速率SPQ荧光变化的VIP刺激后,由NPY抑制但不是scNPY。在雌性生殖道的存在异烟肼172(10µM),利率SPQ荧光变化减少∼10倍和NPY的没有效果。正确显示利率SPQ荧光变化的VIP、NPY浓度范围,显示出剂量依赖性的VIP激活离子的渗透性和NPY抑制离子渗透率。与Bonferroni测试后由1路的意义方差分析;a和c显示代表的痕迹,而b和d秀意味着±扫描电镜从≥6实验用细胞≥3例(≥2实验每名患者),与* *:p < 0.01与只贵宾。
收缩是伴随着瞬态酸化细胞内的pH值(酸碱度我)随后更持续alkalinisation (图1 c和d)。Agonist-evoked酸化是HCO缺席3−无媒体(补充图S2a-c),二级alkalinisation被抑制的Na+HCO3−co-transporter(美国全国广播公司(NBC);补充图S2d)。因此,瞬态酸化反映HCO3−在激活期间流出的分泌物,而NBC的alkalinisation反映了激活,维持HCO3−(HCO分泌,保持细胞内3−)高。这类似于cholinergic-evoked浆液细胞酸化和随后alkalinisation Na+/小时+换热器(nh) [6),但揭示了一个重要的机械的营地和Ca的区别2 +通路。
酸化被消除导电HCO的驱动力3−流出使用离子替换(补充图S2e),这表明酸化是由离子通道。Forskolin——或者VIP-induced收缩和细胞酸化缺席CF患者(图1 c和d),是由雌性生殖道抑制剂抑制雌性生殖道异烟肼172 K+通道抑制剂clofilium和克霉唑non-CF细胞(图1 e和f),证明要求雌性生殖道和反离子K+流出。VIP-evoked反应并不减少TMEM16A抑制剂尼氟酸(NFA) T16A异烟肼-A01,中国商用飞机有限责任公司异烟肼-A01或4 4“-diisothiocyanato-2 2”-silbenedisulfonic酸(做)(图1 f)。代表痕迹在补充图S3a和b。
相比之下,碳酰胆碱(CCh)激活Ca2 +借分泌(7,33),刺激收缩和酸化被TMEM16A抑制剂NFA, T16A异烟肼-A01,中国商用飞机有限责任公司异烟肼-A01或做(图1 g)。CCh-induced分泌在CF完整细胞(图1 h)。药理TMEM16A激活(E行为在CF)恢复分泌反应VIP细胞(图1 h)。代表痕迹在补充图S3c和d。E的浓度行为这里使用没有急性(2 - 3分钟)对细胞内钙的影响在这些细胞(补充图S3e)
因此,营地海拔激活Cl−和HCO3−直接通过分泌雌性生殖道(图1我),并针对TMEM16A HCO可能恢复3−在CF腺体分泌。我们发现没有证据表明Cl−/ HCO3−exchanger-mediated HCO3−流出(补充图S4),同意数据显示Calu-3细胞(36),支气管线常用浆液细胞替代,分泌HCO3−主要通过雌性生殖道而Cl−/ HCO3−换热器pendrin (SLC26A4)更重要的是在表面的上皮细胞。这些数据显示HCO存在的根本缺陷3−CF细胞分泌雌性生殖道电导造成直接损失,这可能是由CFTR药理检测校正直接恢复。
NPY减少CFTR-mediated流体和HCO3−在贵宾刺激分泌
Calu-3s表达大量的NPY1R相对于其他气道行(补充表S2和S3)。我们因此检测NPYRs在初级浆液性细胞。我们观察到没有分泌反应NPY,但VIP-evoked酸化的大小与NPY和收缩减少(图2一个和b)。我们提出,G我耦合NPYRs可能冲VIP-evoked营级的增加,减少雌性生殖道激活。我们测量Cl−渗透率使用6-methoxy -N——(3-sulfopropyl) quinolinium (SPQ), Cl染料淬火−但不是没有3−。细胞外Cl的替换−没有3−导致减少细胞内(Cl−)和SPQ荧光的产生率增加相当于阴离子渗透(7,33,35]。的贵宾,荧光快速增加3−替换。这是减少∼50% NPY (图2 c和d)。在雌性生殖道的存在异烟肼172年,阴离子渗透几乎完全减少和NPY没有效果(图2 d)。即使24小时刺激与NPY、孤立的浆液细胞表现出减少VIP-activated Cl−渗透在急性VIP刺激(补充图S5)。
雌性生殖道被PKA激活下游的阵营。我们成像实时阵营改变使用mNeonGreen阵营生物传感器(石蚕)[37]。贵宾诱导迅速、可逆的营地被VIPR拮抗剂VIP的增加(6-28)(图3一和b)。营地增加独立的Ca2 +(图3 c)。在营地里增加non-CF没有差别或CF细胞(补充图S6),与以往相比,这个假设的缺陷信号在营地CF (38]。然而,NPY减少VIP-evoked营地响应(图3 d和e);NPY效应消除了NPY1R拮抗剂BIBO 3304或百日咳毒素(PTX), G,使其失去活性我蛋白(图3 d和e)。因此,NPY减弱CFTR-mediated Cl−,HCO3−,液体分泌信号通过减少营地。
神经肽Y (NPY)抑制——血管活性肠肽(VIP)全身的阵营增加主要鼻腺浆液性细胞。石蚕的痕迹)代表荧光(向上的挠度跟踪=增加阵营)显示出可逆VIP-activated阵营增加被VIP受体拮抗剂贵宾6-28。b)剂量反应显示峰石蚕与VIP荧光变化。每个数据点都是一个独立的实验;图表显示的数据从≥≥3浆液性细胞3例(1实验每个病人)为每个(VIP)。c)代表痕迹和条形图显示完整的石蚕与钙螯合反应10µM BAPTA-AM加载(30分钟)和刺激在溶液中不含添加钙EGTA + 1毫米。条形图显示意味着±扫描电镜5实验用细胞从5个不同的病人(1实验每名患者)。学生无显著差异t以及。0.5 d)峰值阵营应对µM和5µM VIP(左上)被抑制NPY(右上角);NPY减少营地反应被NPY1R拮抗剂BIBO废除3304(5µM;左下)或百日咳毒素(PTX;6小时。预处理)。e)酒吧图表显示(平均±峰值响应扫描电镜从实验中D在两个不同的(VIP);数据点从≥6实验用细胞至少有三个病人(≥2实验每名患者)。由1路的意义方差分析与Dunnett发布测试(VIP只控制);* *:p < 0.01与只贵宾。
NPY和VIP反对对Cl的影响−和HCO3−浆液性细胞的分泌主要文化中
促进分化的研究中,我们使用文化保存方法,浆液性表型(34]。浆液性细胞培养在阿里表示标记Muc7 VIPR1, VIPR2,溶菌酶,NKCC1和α1抗胰蛋白酶,以及NPY1R和NPY4R (图4一- c)。溶菌酶、Muc7 VIPR1和VIPR2免疫荧光探测到在浆液性细胞(图4 d和e)和Calu-3细胞(补充图S7和S8)。ELISA和qPCR确认Muc7但不是Muc5AC表达或Muc5B(浆液性文化补充图S9)。浆液爱丽丝也表示CFTR功能检测。顶端替换Cl−没有3−导致减少(Cl−]我增强的贵宾,CFTR被检测异烟肼172年,钝化NPY (图5一个)。类似于前面提到的新孤立的细胞,TMEM16A抑制剂并不影响VIP-activated Cl−磁导率(图5一个)。爱丽丝是抵抗病毒的石蚕的表达,但稳态营水平测量5分钟后与VIP±NPY刺激。NPY阵营增加,减少,这是废除PTX (图5 b)。
浆液细胞标记物的表达主要鼻浆液阿里的文化。中鼻甲)腺泡的细胞分离培养和主题为浆液细胞标记Muc7免疫印迹,——血管活性肠肽(VIP)受体VIPR1 VIPR2, NKCC1和α1抗胰蛋白酶(α1在)。结果从文化2 - 3例所示,代表从至少三个独立的实验观察到的结果。b)免疫印迹NPY1R和NPY4R(运行在二聚物的分子量由于未煮开的样品;看到补充的方法)文化从三个病人(从三个独立实验代表污点)。c)代表rtPCR显示在浆液阿里NPY1R mRNA的表达;代表三个独立的实验结果从三个病人。d)固定文化为浆液性标记应用溶菌酶和Muc7,显示点状的胞质染色类似serous-like分泌颗粒。VIPR e)免疫细胞化学和VIPR2透露侧膜染色GLUT1和NKCC1相似。所有图片在d和e代表文化从≥3单独的病人。酒吧是20µm规模。
流体和HCO调制3−分泌——血管活性肠肽(VIP)和神经肽Y (NPY)在浆液气液界面(ALI)的文化。一)顶端没有3−替换实验(代表痕迹,左)和利率SPQ变化(条形图,右)在刺激与VIP(1µM)±NPY(100海里)的存在与否表明抑制剂。b) ELISA结果稳态测量营地与VIP或异丙肾上腺素刺激期间±NPY或炒NPY (scNPY)。µM浓度显示。c)代表德州正交切片红dextran-labelled气道表面液体(ASL)主要浆液爱丽丝;酒吧都是10µm规模x和z。d)手语高度刺激基底15分钟后表示。e)主要人类巨噬细胞被孵化24小时十四烷酸有或没有佛波醇酯(PMA),其次是洗涤去除PMA和进一步24小时孵化苯酚red-free媒体。美国手语高度测量在爱丽丝孵化的巨噬细胞和基底macrophage-conditioned媒体化合物作为显示添加的。f)手语pH值(酸碱度美国手语)测量中使用SNARF-1-dextran文化刺激为2 h表示。SNARF-1比率计,对体积变化不敏感。µM浓度显示。g) pH值美国手语在爱丽丝孵化的巨噬细胞和基底在e macrophage-conditioned媒体化合物作为显示添加的。所有酒吧图表显示意味着±扫描电镜从≥≥6个独立的实验使用阿里文化3例(≥2文化每个病人)。意义在每个柱状图与Bonferroni期末测验由单向方差分析;* *:*:p < 0.05, p < 0.01与将组织;和# #:p < 0.05#:在f p < 0.01与如果条件。
美国手语是标签与德克萨斯红葡聚糖跟踪液分泌。VIP手语高度增加;这是被NKCC1抑制剂布美他尼,PKA抑制剂H89或贵宾(6-28)(图5 c和d),支持,这反映了液体分泌。NPY抑制VIP-induced分泌(图5 c和d)和isoproterenol-induced分泌(图5 d),但不是Ca2 +激活CCh-induced分泌(图5 d),显示效果的NPY特有的阵营。测试如果phagocyte-produced NPY能产生这些影响,我们主要使用人类monocyte-derived巨噬细胞启动十四烷酸与佛波醇酯(PMA),产生NPY (补充图S10)。浆液阿里transwells被转移到盘子上面的巨噬细胞24小时macrophage-conditioned媒体基底外侧。VIP的美国手语高度增加,但这是减少PMA-primed巨噬细胞的存在,这效果是逆转BIBO 3304 (图5 e)。
跟踪HCO3−分泌,手语与seminaptharhodafluor标签(狼吞虎咽)1-dextran用全氟化碳,允许测量生理手语没有添加水液pH值(39]。稳态如果美国手语pH值(酸碱度美国手语)为7.2±0.04,相当于HCO∼15毫米3−在5%股份有限公司2([HCO3−]我= 1.2毫米×10pH值−6.1);pH值美国手语降低了NBC抑制剂dnd (6.9±0.06;7.6毫米HCO3−),但不是光靠NPY (图5 f)。VIP pH值增加美国手语(7.6±0.04;38毫米HCO3−),这表明VIP HCO刺激3−分泌;pH值增加美国手语降低了NPY(7.3±0.05)或dnd (7.1±0.03)。PTX NPY被封锁的影响。NPY同样抑制forskolin和异丙肾上腺素(图5 f)。注意,增加美国手语卷(图5 c)和缓冲能力,实际的HCO分泌3−会比的变化[HCO3−]。
浆液爱丽丝与如果孵化或PMA-stimulated巨噬细胞如前所述和稳态pH值美国手语测量2 h后;pH值美国手语如果巨噬细胞持平,但PMA-stimulated巨噬细胞降低pH值吗美国手语(图5克)。这是3304年BIBO抑制。VIP的pH值增加美国手语(图5克)。观察到的影响是使用实时HCO验证3−分泌物化验,确诊依赖于顶端分泌雌性生殖道(补充图S11)。
2型炎症建议上调Cl−/ HCO3−换热器pendrin在气道上皮细胞表面40,41]。我们检查了如果NPY或IL-13诱导改变pendrin或Cl的表情−渠道在初级浆液性细胞,或许将浆液性细胞从雌性生殖道向更加TMEM16A——和/或pendrin-dominated分泌表型。然而,没有变化SLC26A4(编码pendrin),ANO1(编码TMEM16A)或雌性生殖道表达主要浆液爱丽丝24 h后IL-13或NPY (补充图S12)。老年病的观察pendrin表面上皮细胞(补充图S12),配件缺少的角色pendrin浆液性细胞(36]。
VIP敏锐地增加抗菌分泌物和杀菌活性而NPY降低它
碳酸盐岩和/或HCO3−已报告加强气道分泌物的抗菌活性42]。我们观察到一个小HCO的效果3−抗菌活性的分泌物由Calu-3细胞(补充图向)。然而,我们提出,NPY可能通过抑制的HCO更深远的影响3−分泌通过雌性生殖道和减少浆液细胞抗菌肽分泌,可能由本构和监管水泡释放由Ca2 +营,在唾液和胰腺外分泌腺泡的细胞(43,44]。减少营地的NPY可能降低抗菌分泌对雌性生殖道功能独立的影响。
Forskolin和VIP浆液细胞分泌增加抗菌素溶菌酶,Muc7β-defensin 1 (hβD1) / 2 h以ELISA;这是降低NPY (图6)。没有影响雌性生殖道或TMEM16A分泌的抑制这些抗菌素(补充图S14a)。溶菌酶和hβD1分泌减少文化源自CF患者(补充图S14b)。NPY没有影响CCh-activated分泌溶菌酶或hβD1 / 2 h (补充图S14c),支持一个特定的NPY对营地的影响。拟合与抗菌肽分泌增加,VIP敏锐地增加浆液美国手语的抗菌效应对临床分离株的洗液铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;图6 b和c)。NPY钝化VIP的影响(图6 b和c)。荧光live-dead染色铜绿假单胞菌确认降低NPY + VIP-stimulated美国手语(杀菌功效补充图S15)。
抗菌肽分泌和抗菌功效的浆液细胞分泌物敏锐地增强——血管活性肠肽(VIP),但降低了神经肽Y (NPY)。)气液界面培养(爱丽丝)刺激基底(2小时)和forskolin(10µM)或VIP(1µM)±NPY(100海里)或炒NPY (scNPY;100海里)表示。收集的美国手语是洗顶端表面有25%生理盐水和溶菌酶化验,Muc7, hβD1 ELISA。结果均值±扫描电镜≥3爱丽丝从≥3患者个体(每个病人一个阿里)。c)从类似的实验,还夹杂着美国手语铜绿假单胞菌(b)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(c)与慢性鼻窦炎(CRS)患者其次是孵化(2小时;37°C;5%的公司2镀)、稀释和集落形成单位计算。酒吧图表显示意味着±扫描电镜≥5实验使用爱丽丝从≥3种不同的病人。* *:p < 0.01 *: p < 0.05括号组之间。意义与Bonferroni测试后由单向方差分析。
VIP和NPY单独有长期(24 - 48小时)影响的表达hβD1 qPCR (补充图S16a)尽管分泌增加超过48小时(补充图s16b)。脂多糖(LPS)治疗上调hβD2表达和分泌(补充图S16a-c),但这并不影响NPY、VIP。溶菌酶表达显著增加了VIP在24小时(补充图S16d),溶菌酶和Muc7分泌也增加了在24小时(补充图S16e)。VIP-treated文化表现出更多的杀菌手语即使在48 h,降低NPY即使在有限合伙人的存在(补充图S16f)。因此,慢性VIP、NPY刺激可以有长期影响浆液细胞抗菌素。
NPY是促炎
我们提出,呼吸道腺体细胞因子分泌VIP和/或NPY可能调制。我们首先关注上皮细胞来源的细胞因子参与了哮喘和过敏,VIP的改变和/或NPY的报告。在浆液爱丽丝,白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α,IL-1β,和集落刺激因子(gm - csf)释放增加48 h后治疗toll样受体4 (TLR4)催化剂有限合伙人,TLR3活化剂保利(我:C) TLR2活化剂lipotechoic酸(LTA) TNFα或2型细胞因子(il - 4 + IL-13;补充图S17a-d)。虽然NPY、VIP独自没有影响il - 6, TNFα,或gm - csf释放,NPY增加IL-1β释放∼2倍基线。NPY也增加了IL-1βmRNA在4 h (补充图S17e)
NPY还会释放这些细胞因子结合有限合伙人,LTA, il - 4 + IL-13, TNF-α(补充图S17a-d)。NPY也增强LPS-induced il - 6和引发mRNA以及IL-13——或者TNF-α-induced gm - csf mRNA在4 h (补充图S17f-g)。NPY效果被PTX,暗示G我信号(补充图S17a-d)。相比之下,VIP细胞因子分泌减少25 - 50%;消除了这些降低NPY (补充图S17a-d)。Co-stimulation il - 4 + IL-13增加细胞因子在回应保利(我:C)或有限合伙人,这是进一步增强NPY (补充图S18a),这表明NPY的上下文中是促炎症甚至Th2炎症中观察到气喘等呼吸道疾病的人。
NPY也增强细胞因子释放,以应对heat-killed临床分离株铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(图7- c),可能激活通常如前所述。验证结果的爱丽丝,我们刚孵化的浆液性细胞与TNFα或聚(我:C)±NPY;NPY增强细胞因子分泌(补充图S18b),确认NPY促炎症,炎症可能导致增加气喘等呼吸道疾病的人。
浆液细胞细胞因子分泌,以应对细菌增加了神经肽Y (NPY)和减少——血管活性肠肽(VIP)在囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)端依赖的方式。两者主要的浆液细胞(爱丽丝)治疗水、气液界面文化heat-killed细菌,紧随其后的是24小时孵化基底±NPY(100海里)或炒NPY (scNPY;100海里)。管基底媒体收集量化的白介素(IL) 6 (a),集落刺激因子(gm - csf) (b)和肿瘤坏死因子(TNF) -α(c)条图显示意味着±扫描电镜≥5实验利用≥3种不同病人的细胞生长。d)主要浆液爱丽丝治疗基底与VIP(100µM)和/或NPY CFTR(100海里)和水处理检测抑制剂雌性生殖道异烟肼172(15µM), TMEM16A活化剂E行为(15µM)和/或TMEM16A抑制剂中国商用飞机有限责任公司异烟肼-A01(15µM)。管基底媒体24小时后收集。并为IL-1β化验。e-f)主要浆液爱丽丝与heat-killed顶端被治疗铜绿假单胞菌基底,紧随其后的是24小时孵化±NPY和/或贵宾以及±顶端雌性生殖道异烟肼172和/或E行为和/或1-EBIO(150µM)。管基底媒体收集和分析gm - csf (e)、il - 6 (e),引发由ELISA (f)。意义与Bonferroni单向方差分析测试后对比每个单独的三块菌株a - c和d e比较相等的酒吧。* *:p < 0.01;*:p < 0.05。
抗炎作用的贵宾需要CFTR功能检测电导;TMEM16A可以替代
在气道细胞,Cl−电导可以抗炎(45,46(Cl),增加−]我促进炎症(47]。这可能对CF的影响;与VIP浆液性细胞刺激,(Cl−]我可能更高CF细胞由于缺乏CFTR-mediated流出。我们测试了如果雌性生殖道有助于抗炎作用的贵宾使用NPY增加释放IL-1β,有些孩子的肺部细胞因子调节CF (48,49]。NPY-induced IL-1β不被雌性生殖道改变异烟肼172或TMEM16A活化剂E行为(图7 d)。然而,VIP IL-1β减少了> 50% (图7 d)。雌性生殖道异烟肼172逆转VIP的效果,而E行为恢复效果的贵宾,E的效果行为与中国商用飞机有限责任公司进一步扭转异烟肼-A01 (图7 d)。我们看到类似的结果与heat-killed当浆液性细胞被刺激铜绿假单胞菌。VIP减少释放gm - csf和il - 6,另一个细胞因子参与早期CF炎症(48];这是被雌性生殖道异烟肼172年,但随后恢复了E行为(图7 e)。
因此,雌性生殖道的抗炎作用需要贵宾,但TMEM16A可以替代。然而,激活Cl−由E电导行为没有足够的抗炎效果没有VIP (图7 e(Cl),可能因为减少−]我需要抗衡离子(K+)通量激活下游的促分泌素33),但不激活E行为一个人。支持这个K+通道激活1-ethyl-2-benzimidazolinone (1-EBIO) [7结合E行为在浆液性炎细胞(图7 e)。贵宾也减少铜绿假单胞菌全身释放引发(图7 f),另一个细胞因子调节CF (48,49]。
讨论
这项研究表明浆液性细胞分泌HCO3−除了Cl−在CFTR VIPergic刺激直接通过检测(图8)。NPY损害VIPergic流体和抗菌肽分泌减少营地信号(图8 b)。这部小说逆NPY和VIP分泌的调节之间的关系表明,这些神经肽的平衡影响粘液流变学通过促进或抑制Cl−和HCO3−从浆液性细胞分泌,控制水化的黏蛋白由更近端腺分泌的粘液细胞。
模型——血管活性肠肽(VIP) -ergic和神经肽Y (NPY) -ergic浆液细胞调节功能和气道疾病的影响。VIP受体)激活允许Gα浆液性细胞年代(Gs)激活腺苷酸环化酶(AC),海拔营地,Cl−和HCO3−射流通过蛋白激酶A (PKA)激活囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)。相比之下,活化乙酰胆碱的毒蕈碱的受体(ACh)刺激Gα问(《Gq》)端依赖钙(Ca2 +)高程和Cl−/ HCO3−通过分泌TMEM16A(基于数据和3,7])。而由两个独立的通道,我们的数据表明雌性生殖道和TMEM16A功能与阴离子流出途径。Cl的结果−流出(和并行K+流出,没有显示7)是一个减少细胞内Cl−浓度([Cl−]我相比之下,)(b) NPY受体激活Gα我(Gi)蛋白抑制交流,减少VIP-activated营地反应。这充分发挥CFTR-mediated离子分泌以及VIP-activated抗菌肽(AMP)分泌,可能有泡的分泌。NPY对胆碱能没有影响阴离子或AMP分泌,因为它是由Ca2 +而不是阵营。c)我们假定,在囊性纤维化,VIP不能引起阴离子和液体分泌通过雌性生殖道。而且,由于[Cl−]我依旧保持高位,炎症反应可能会增加。d)在哮喘、高架NPY可能会增加胃肠道活动冲营反应VIP的下游,减少雌性生殖道活动和液体分泌以及水泡AMP分泌。NPY也促炎效应。
本研究揭示了一些见解与CF发病机理(图8 c)。我们发现没有证据表明Cl−/ HCO3−交易所(如。pendrin)活动在浆液性细胞,这表明雌性生殖道的损失函数直接导致HCO受损3−分泌。针对雌性生殖道通过校正和/或电位器将恢复HCO浆液性细胞3−和Cl−独立于其他分泌蛋白。此外,营地信号在CF细胞完整,表明适当的药理修正CFTR突变检测可能恢复适当分泌的内源性生理刺激(如。VIP)。CF患者不能受益于雌性生殖道校正(如。过早终止密码子突变),激活TMEM16A也可以恢复Cl−/ HCO3−流出。雌性生殖道可能调节等其他渠道和转运蛋白上皮Na+频道或pendrin表面上皮细胞(36,40,41],TMEM16A激活可能不会完全取代雌性生殖道。然而,这项研究和以前的工作6建议TMEM16A可以支持水平的Cl−和HCO3−射流从浆液性细胞相当于雌性生殖道。
这些结果也揭示潜在的病理生理机制在阻塞性气道疾病如哮喘(图8 d)。高架VIP在过敏性鼻炎可以促进水浆液性分泌物通过流体和HCO升高3−分泌粘液变薄。然而,增加NPY的条件下(如。在哮喘),刺激流体和HCO VIP的能力3−通过雌性生殖道分泌物和抗菌肽分泌受损由于削弱信号。也能减少气道纤毛拍频NPY (50),这可能会进一步损害黏膜纤毛的清除和天生的防御。增加炎症通过高架NPY可能会加剧这些影响。总之,我们的数据表明,在某些哮喘,慢性阻塞性肺病或CRS病人,NPYR1拮抗剂可能有用的薄分泌粘液,增强抗菌分泌,和/或减少炎症。
在高架NPY尚未报道CF肺,一项研究表明高架NPY在雌性生殖道的嗅觉上皮基因敲除小鼠(51]。也许NPY可能发挥作用在一个子集的CF患者;偏向Th17或Th2形象可能是一个风险因素铜绿假单胞菌CF肺部感染(52]。在这些患者中NPY可能升高。NPY不会将大大影响运输离子CF浆液性细胞整个通路已经缺席是因为雌性生殖道的损失函数;然而,NPY仍然可以减少抗菌分泌或促进炎症。NPY的角色CF肺部和NPYR抑制的潜在治疗价值需要进一步调查。不管NPY CF病理生理学的相关性,增加粘液粘度在CF和哮喘可以共享,至少部分的常见机制减少雌性生殖道功能。在CF,这是通过CFTR直接检测突变。哮喘、减少CFTR-mediated分泌由于高架NPY和钝化营地信号可能导致糟糕的水化腺粘液CFTR独立于直接检测的缺陷。
外分泌细胞炎症的重要贡献是建立在腮腺和胰腺腺泡的上下文中干燥综合征和胰腺炎,分别为(53]。但是,这是研究气道。支气管腺体积可能≥50倍体积的杯状细胞(3]。腺腺泡可能是细胞因子的重要贡献者(54),特别是当腺肥大和增生发生在COPD和哮喘3]。我们的数据支持以前的观测(45,46),氯−雌性生殖道炎在贵宾通道活动刺激,并可能导致hyperinflammatory表型在CF (45,46]。外分泌腺泡的细胞积累Cl−以上电化学平衡(≥65毫米(Cl−]我)[7)来支持他们的专用fluid-secreting角色。VIP刺激降低(Cl−]我在浆液性细胞(∼30毫米)通过氯化钾射流通过雌性生殖道和K+频道。改变浆液细胞胞内(Cl−]在刺激很可能大于表面上皮细胞的变化,细胞内(Cl休息的地方−]我较低(≤40毫米)。因此,高架的促炎效应(Cl−]我在浆液性细胞可能更明显,增加缺乏雌性生殖道炎症的作用。类似于Cl−和HCO3−分泌,我们的数据表明,激活CFTR TMEM16A可以弥补损失的检测,表明可能的抗炎有利于针对TMEM16A腺体的病人不能使用雌性生殖道电位器/校正器治疗。
有趣的是,NPY增加细胞因子生产期间co-stimulation toll样受体激动剂,但它不影响β-defensin 2,这也是受TLR-stimulated核转录因子(NF)κB。这可能表明,NPY强化TLR-induced细胞因子分泌通过non-NFκB机制,支持的观测,仅NPY没有诱导il - 6或引发。未来的工作需要更多的分子细节完全解剖NPYR气道细胞信号通路,包括激活转录因子。
补充材料
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确认
我们感谢n·科恩(费城VA医学中心)细菌隔离,j·莱利(宾夕法尼亚大学人类免疫学核心)获取人类单核细胞,m .维多利亚(宾夕法尼亚大学)援助与巨噬细胞分化和分子生物学,b·陈(宾夕法尼亚大学)援助增长最初的浆液性文化,和J.K. Foskett(宾夕法尼亚大学)首次在许多技术培训。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
.凯里,作者贡献:D.B. cooper麦克马洪,硕士Kohanski和R.J.李进行实验和分析数据。.凯里、硕士Kohanski C.C.L.通,p . Papagiannopoulos北达科他州Adappa和J.N.帕默辅助组织采购、原代细胞采集和文化,维护临床记录和智力贡献。.凯莉和R.J. D.B. cooper麦克马洪,李起草的手稿关键输入和所有作者的批准。
利益冲突:D.B. cooper麦克马洪没有披露。
利益冲突:.凯莉没有披露。
利益冲突:硕士Kohanski没有披露。
利益冲突:C.C.L.通没有披露。
利益冲突:p . Papagiannopoulos没有披露。
利益冲突:北达科他州Adappa没有披露。
利益冲突:J.N.帕默没有披露。
利益冲突:R.J.李报道赠款NIH /国家过敏和传染病,NIH /国家耳聋和其他沟通障碍研究所和囊性纤维化基金会,在进行这项研究的。
支持声明:囊性纤维化基金会的资助工作(LEER16G0 LEE19G0)和美国国立卫生研究院(R21AI137484 R01DC016309)。主要人类单核细胞从宾夕法尼亚大学获得人类免疫学核心,由国立卫生研究院P30CA016520 P30AI045008。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2019年7月12日。
- 接受2020年1月13日。
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