摘要gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba新型人类冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)(又称2019-nCoV)的持续爆发已成为一个全球健康问题。迫切需要快速、简便的诊断技术来诊断SARS-CoV-2感染。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba我们设计了一种逆转录多重交叉位移扩增(RT-MCDA)与基于纳米颗粒的生物传感器检测(RT-MCDA- bs)结合的方法,用于快速、灵敏和特异性地诊断2019冠状病毒病(COVID-19)。针对SARS-CoV-2的开放阅读框1a/b和核蛋白基因设计了两组引物。共采集了183份临床样本,包括65例新冠肺炎患者和118例其他病原体感染患者,验证了该方法的可行性。利用生物传感器可视化报告诊断结果。gydF4y2Ba
发现gydF4y2Ba设计的实验是用一个简单的仪器进行的,该仪器可以在64°C的恒定温度下维持反应仅35分钟。整个COVID-19 RT-MCDA-BS检测过程可在1小时内完成。COVID-19 RT-MCDA-BS可以检测到多达5个目标序列副本。在来自新冠肺炎患者的65份临床样本中,从粪便、鼻、咽和肛门拭子中获得22份(33.8%)阳性结果gydF4y2Ba通过gydF4y2BaCOVID-19 RT-MCDA-BS检测,而实时逆转录pcr检测仅检测到20例(30.7%)阳性结果。非covid -19感染的临床样本未获得阳性结果。gydF4y2Ba
解释gydF4y2BaCOVID-19 RT-MCDA-BS是一种快速、可靠、低成本和易于使用的检测方法,可为在多个临床标本中诊断COVID-19提供一种有吸引力的实验室工具,特别是对资源匮乏环境中的现场、临床实验室和初级保健设施。gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
我们设计了一种新的方法(COVID-19 RT-MCDA-BS)来诊断COVID-19。其快速、低成本和易于使用使该方法成为野外、初级和临床实验室使用的理想工具,特别是在资源匮乏的环境中。gydF4y2Bahttps://bit.ly/3j08CU2gydF4y2Ba
简介gydF4y2Ba
2019年12月底,一种新型人类冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2);也称2019-nCov)出现在中国湖北省武汉市[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].新型冠状病毒在中国迅速传播,并扩散到中国以外的200多个国家/地区[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].截至2020年5月28日,SARS-CoV-2在全球范围内已影响到55 593 631名患者(353 334例死亡)[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].由于其传播速度快(RgydF4y2Ba0gydF4y2Ba3.28)、可能的致命进展和强传染性,2019冠状病毒病(COVID-19)引起了全球的严重关注[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].因此,迫切需要一种快速、易于使用和可靠的检测工具来诊断感染、治疗患者和控制COVID-19的传播。gydF4y2Ba
仅根据COVID-19的表现进行早期诊断极其困难,其变量很大[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].COVID-19的临床表现包括无症状感染、非特异性流感样临床表现(如咳嗽和发烧)和呼吸衰竭[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].暴露后2天至2周可出现明显临床表现。因此,设计一种快速和早期的诊断方法对治疗和疾病控制至关重要。目前,COVID-19感染的最终诊断严重依赖基于pcr的方法,如逆转录(RT)-PCR和实时RT -PCR [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].然而,它们需要昂贵的热循环设备和非常熟练的实验室工作人员。此外,基于聚合酶链反应的技术由于其在临床诊断的COVID-19患者中的敏感性限制而获得的62%的阳性率并不能有效地控制感染[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].因此,需要一种易于使用、成本效益高、灵敏度高的检测方法作为现场和临床环境中应对COVID-19的一线技术。gydF4y2Ba
最近,人们设计了几种环介导等温扩增(LAMP)方法,用于在临床和受刺激患者样本中快速检测COVID-19 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].然而,COVID-19 LAMP检测只检测到一个目标基因(开放阅读框1a/b (F1ab))。当它们被用于检测含有高度同源序列的临床样本时,如蝙蝠严重急性呼吸综合征样冠状病毒(GenBank)的基因,可能会产生假阳性结果gydF4y2BaKY417152.1gydF4y2Ba).此外,还报道了LAMP结果gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba琼脂糖凝胶电泳、SYBR染料或pH指示剂。特别是,电泳是一个繁琐和耗时的过程,在模板浓度低导致的模糊测试中,用肉眼评估颜色变化可能是主观的。人们不断需要能够克服这些技术困难的新技术。gydF4y2Ba
多重交叉位移扩增(MCDA)技术是一种易于操作和可靠的诊断方法,它在短时间(20-40分钟)内扩增目标核酸(通常在58°C到69°C之间);通常为30分钟)[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].简单的设备(如水浴,加热块,甚至保温杯)就足以进行MCDA测试。MCDA技术已被用于诊断各种感染性疾病,其阳性结果可达目标序列的三个副本,显示出其快速、简单和高特异性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].为了实现多靶点的同时检测和MCDA产品的快速分析,基于纳米粒子的生物传感器检测与MCDA相结合,以实现客观的检测结果。该生物传感器测定方法简单,易于进行,成本低,不需要复杂的仪器和熟练的人员[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
我们设计了一步,单管反转录MCDA (RT-MCDA)结合基于纳米颗粒的生物传感器检测(RT-MCDA- bs) (gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),可以通过同时检测F1ab和核蛋白(N)基因来诊断COVID-19。整个检测过程可在1 h内高精度完成。因此,RT-MCDA-BS方法可能使COVID-19诊断更容易、更快和更可靠,即使在资源有限的情况下也是如此。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
纳米粒子生物传感器的制备gydF4y2Ba
基于纳米颗粒的生物传感器(4×60 mm),如图所示gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,由一个样品垫、一个共轭垫、一个硝化纤维素(NC)膜和一个吸收垫组装在塑料胶粘剂衬底卡上(捷易生物技术,上海,中国)。捕获试剂包括羊抗地高辛抗体(抗dig, 0.25 mg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Abcam,剑桥,英国),兔抗荧光素抗体(抗fitc, 0.2 mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Abcam)和生物素化牛血清白蛋白(生物素- bsa, 4 mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Abcam),分别作为测试线1 (TL1)、测试线2 (TL2)和对照线(CL)涂在NC膜上,每条线间隔5mm。检测试剂(链霉亲和素染料涂层聚合物纳米颗粒(SA-DPNs), 129 nm, 10 mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;将100 mM硼酸盐,pH为8.5,0.1% BSA, 0.05% t20 - 10 mM EDTA)喷洒在生物传感器的共轭区。因此,该生物传感器可以检测三个目标,包括两个目标产物(F1ab-MCDA扩增子和N-MCDA扩增子)和色谱控制。最后,组装好的生物传感器被切成4毫米的试纸,在室温下干燥储存以备使用。gydF4y2Ba
RT-MCDA底漆设计gydF4y2Ba
两组RT-MCDA引物(F1ab- mcda和N- mcda引物组),分别靶向SARS-CoV-2的F1ab基因和N基因(GenBank)gydF4y2BaMN908947gydF4y2Ba,武汉-沪1号),按MCDA原理设计(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).每个MCDA引物组由两个置换引物(F1和F2)、两个交叉引物(CP1和CP2)和6个扩增引物(C1、D1、R1、C2、D2和R2)组成。F1ab-和N-MCDA引物的特异性使用国家生物技术信息中心基本局部对齐搜索工具进行分析。此外,OligoAnalyzer在线软件(V3.1;采用集成DNA技术,Coralville, IA, USA)进行引物、二聚体和二级结构研究。RT-MCDA引物设计、引物位置、序列和修饰的细节列于gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba.所有低聚物均由天一汇源生物技术公司(北京,中国)以HPLC纯化等级合成和纯化。gydF4y2Ba
RT-MCDA反应gydF4y2Ba
标准RT-MCDA (F1ab-MCDA/N-MCDA)在含12.5 μL 2×等温反应缓冲液(40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 40 mM KCl, 16 mM MgSO的25 μL混合物中一步反应gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 20 mM (NH4)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba2 M甜菜碱和0.2% Tween-20)(天津惠德新生物技术有限公司);8u Bst 2.0 DNA聚合酶(New England Biolabs;伊普斯维奇,马萨诸塞州,美国);禽成髓细胞病病毒逆转录酶(Invitrogen;Waltham, MA, USA);1.4 mM dATP;1.4 mM dCTP;1.4 mM dGTP;1.4 mM dTTP;0.1 mM生物素-14- dctp; 0.1 mM biotin-14-dATP; 0.4 μM each of displacement primers F1 and F2; 0.8 μM each of amplification primers C1, C2, D1, D1, R1 and R2; 0.8 μM each of cross-primers CP1* and CP1; 1.6 μM cross-primer CP2; and template (1 μL for the standard plasmid).
此外,COVID-19 RT-MCDA在含有12.5 μL 2×等温反应缓冲液(40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 40 mM KCl, 16 mM MgSO的25 μL混合物中一步反应完成gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 20 mM (NH4)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba2 M甜菜碱和0.2% Tween-20)(惠德新生物技术);8u Bst 2.0 DNA聚合酶(New England Biolabs);10 U的禽成髓细胞病病毒逆转录酶(Invitrogen);1.4 mM dATP;1.4 mM dCTP;1.4 mM dGTP;1.4 mM dTTP;0.1 mM生物素-14- dctp;0.1 mM生物素-14- datp;F1ab-F1和F1ab-F2的0.275 μM; 0.55 μM of F1ab-C1, F1ab-C2, F1ab-D1, F1ab-D2, F1ab-R1 and F1ab-R2; 0.55 μM of F1ab-CP1* and CP1; 1.1 μM of F1ab-CP2; 0.125 μM of N-F1 and N-F2; 0.25 μM of N-C1, N-C2, N-D1, N-D2, N-R1 and N-R2; 0.25 μM of N-CP1* and CP1; 0.5 μM of N-CP2; and template (1 μL for the each standard plasmid, 5 μL for samples).
采用实时浊度(LA-320C)、视觉检测试剂(VDR)和生物传感器对MCDA反应进行了演示,确定了最佳扩增温度。gydF4y2Ba
RT-MCDA-BS试验的敏感性gydF4y2Ba
分别含有F1ab和N基因的两个质粒(F1ab-质粒和N-质粒)由天益汇源生物技术(北京,中国)商业构建。根据制造商的说明书,F1ab-和n质粒的初始浓度为5×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba本·µLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.然后,10倍连续稀释(5×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba利用f1ab -质粒和n -质粒的拷贝,评估新冠病毒RT-MCDA、F1ab-RT-MCDA和N-RT-MCDA法的检出限(LoD)。这些检查是独立进行的,一式三份。同时,质粒浓度在LoD水平上用于确定COVID-19 RT-MCDA试验的最佳等温时间。gydF4y2Ba
COVID-19 RT-MCDA-BS检测的特异性gydF4y2Ba
通过比较从各种病毒、细菌和真菌中提取的模板,评估COVID-19 RT-MCDA-BS方法的分析特异性。gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
利用临床样本验证COVID-19 RT-MCDA-BS的可行性gydF4y2Ba
收集新冠肺炎急性期和恢复期患者的粪便和肛门、鼻、咽拭子等临床样本65份,并将其送往贵州省疾病预防控制中心(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba).使用COVID-19 RT-MCDA-BS法分析这些RNA模板得到贵州省疾控中心的批准。咽、鼻和肛门拭子样本使用蜂群无菌塑料拭子涂抹器收集,并将其置于病毒通用病毒传输介质(HiDNA;益美生物技术,江苏台州)。对于粪便样本,等量(~ 1 g)的粪便被放置在一个管子中,其中包含1.5 mL UVIM。粪便样品在5000×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后,将上清液放入新的试管中。UVIM(咽、鼻和肛门拭子样本)等分物(200µL)和粪便样本上清液进行RNA模板提取过程,使用快速RNA提取试剂盒(天龙生物技术,杭州,中国)只需要15分钟。用模板5µL的等分进行RT-PCR和COVID-19 RT-MCDA-BS方法。从不同类型的临床样本中提取RNA模板,在贵州省疾控中心进行rRT-PCR检测后,使用官方批准的临床RT-PCR试剂盒进行检测。RT-PCR诊断试剂盒LoD为500 copies·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba根据它的手册。周期阈值(Ct)值<37定义为COVID-19感染阳性结果;Ct值为>40,如果未获得Ct值,则定义为COVID-19感染阴性结果;Ct值在37-40之间是不确定的,应该再次检查。此外,我们还检测了来自非COVID-19患者的118份咽拭子样本,以验证COVID-19 RT-MCDA-BS方法的特异性。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
COVID-19 RT-MCDA-BS检测机制示意图gydF4y2Ba
在COVID-19 RT-MCDA体系中,F1ab-CP1和N-CP1两个核心引物分别在5 '端用地高辛(Dig)和FITC标记。新的F1ab-CP1和N-CP1引物被命名为F1ab-CP1*和N-CP1*。同时,将两种组分(生物素-14- dctp和生物素-14- datp)添加到COVID-19 RT-MCDA反应混合物中(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba).如gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,首先在扩增温度(64℃)下,补充禽成髓细胞病病毒逆转录酶,将SARS-CoV-2模板(RNA)转化为cDNA。然后,cDNA作为MCDA扩增的模板。F1ab-CP1*和N-CP1*引物退火到目标区域,并被置换酶(gydF4y2BaBstgydF4y2Ba2.0),因此生物素-14- datp和生物素-14- dctp被纳入新合成的产品。结果,大量可检测的双标记产物由同时标记Dig和生物素的F1ab-MCDA扩增子和FITC和生物素的N-MCDA扩增子形成(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
COVID-19 RT-MCDA结果生物传感器可视化原理gydF4y2Ba
纳米粒子生物传感器的细节见gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba.扩增后,新冠病毒RT-MCDA产物等分物(1 μL)沉积在生物传感器的样品垫上(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,步骤1),然后在同一区域(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,步骤2)。运行的缓冲液可通过毛细管作用沿生物传感器移动,然后在共轭区使固定的SA-DPNs再水化。F1ab-MCDA扩增子被固定在TL1上的anti-Dig捕获,而N-MCDA扩增子被固定在TL2上的anti-FITC捕获。新冠病毒MCDA产品的生物素可以结合SA-DPNs进行可视化。多余的SA-DPNs被固定在CL中的生物素化BSA捕获,评估生物传感器的工作状态(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,步骤3)。COVID-19 RT-MCDA结果的解释gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba生物传感器显示在gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba.gydF4y2Ba
F1ab-、N-和COVID-19 RT-MCDA产品的确认和分析gydF4y2Ba
使用VDR, F1ab-, N-和COVID-19 RT-MCDA阳性血管用肉眼可见为浅绿色,而阴性和空白对照的血管仍然是无色的(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba,第一行)。在生物传感器中,F1ab-RT-MCDA阳性扩增的TL1和CL中出现两个红色条带(gydF4y2Ba补充图S1agydF4y2BaN-RT-MCDA阳性扩增的TL2和CL (gydF4y2Ba补充图S1bgydF4y2Ba,最下面一行)。TL1、TL2和CL生物传感器同时出现红色条带表明COVID-19 RT-MCDA扩增阳性(gydF4y2Ba补充图S1cgydF4y2Ba,最下面一行)。CL中的红色带只表示阴性和空白控件(gydF4y2Ba补充图S1a-cgydF4y2Ba,最下面一行)。这些数据表明,F1ab-和N-MCDA引物组合以及COVID-19 RT-MCDA检测是可行的靶序列检测方法。然后确定了COVID-19 RT-MCDA的最佳反应温度为64℃(gydF4y2Ba补充图S2和S3gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
新冠病毒RT-MCDA-BS检测的敏感性gydF4y2Ba
如gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba在美国,COVID-19 RT-MCDA-BS法可以在血管中检测到多达5个f1ab -质粒或n -质粒副本。值得注意的是,SARS-CoV-2的F1ab和N基因通过自己的引物在一步、单管反应中同时被正确扩增(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba).得到的结果gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba生物传感器与VDR试剂和实时浊度一致,而VDR和实时浊度方法不能实现多目标检测(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba最重要的是,F1ab-和N-RT-MCDA检测也显示出一个反应中有5个靶序列拷贝的检出限,这与COVID-19 RT-MCDA检测一致(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充图S4和S5gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
对扩增阶段新冠病毒RT-MCDA-BS方法所需的最佳反应时间进行了测试。最低模板级别(5×10gydF4y2Ba0gydF4y2Ba当等温反应在64°C下进行25 min时,F1ab-或n -质粒的副本显示三个红色条带(TL1, TL2和CL) (gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba).因此,在临床样品分析中,建议反应时间为35 min,包括反转录过程(10 min)。因此,COVID-19 RT-MCDA- bs技术的整个诊断过程,包括样品采集(3分钟)、快速模板制备(15分钟)、RT-MCDA反应(35分钟)和结果报告(<2分钟),可在1小时内完成(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
COVID-19 RT-MCDA-BS检测的特异性gydF4y2Ba
COVID-2019 RT-MCDA-BS试验特异性检测阳性对照(含5×10gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF1ab-和n-质粒的拷贝),而未检测到来自非covid -19病毒、细菌和真菌的其他靶模板(gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba).这表明COVID-2019 RT-MCDA-BS方法具有很好的特异性。gydF4y2Ba
临床标本中COVID-19 RT-MCDA-BS检测方法的评价gydF4y2Ba
对贵州省疾控中心于2020年首次使用rRT-qPCR检测到的急性期和恢复期患者的65份RNA样本进行了检测,以验证我们方法的可行性。我们的COVID-19 RT-MCDA-BS检测从不同类型的临床标本中检测到22例(33.8%)阳性结果(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba排泄物及鼻、肛门及咽拭子),而rRT-PCR仅检出20例(30.7%)阳性结果(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba).这些数据表明,我们的COVID-19 RT-MCDA-BS检测在检测COVID-19患者方面更有效,特别是对那些病毒载量非常低的患者。此外,从非covid -19患者收集的这些样本中未获得阳性结果(gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
随着武汉意外发生新型冠状病毒感染症(SARS-CoV-2),新型冠状病毒开始在中国境内传播,并向其他地区/国家传播[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba].因此,开发足够的诊断技术,为检测新冠病毒感染提供简单、快速、可靠和易于使用的策略至关重要。不仅在COVID-19正在传播的国家,在受到COVID-19威胁的国家也需要这种诊断方法。为了有效地应对大流行,我们成功地设计了一种诊断COVID-19的新方法,称为COVID-19 RT-MCDA-BS试验。gydF4y2Ba
新冠病毒RT-MCDA-BS检测结合了反转录、cDNA等温扩增和纳米生物传感器的多重检测,通过一步、单管反应实现了对新冠病毒的快速诊断。对于COVID-19 RT-MCDA-BS检测,非常简单的仪器,如加热块、水浴,甚至可以保持固定温度(64°C) 30分钟的保温杯都足够。重要的是,该生物传感器提供了一个易于使用的平台,可以客观、直观地显示COVID-19 RT-MCDA结果,无需使用特殊的比色指标,如电泳和光学设备。COVID-19 RT-MCDA-BS的整个诊断过程,包括临床标本采集(3 min)、快速模板制备(15 min)、等温扩增(35 min)和结果报告(2 min),可在1 h内完成。其中,COVID-19 RT-MCDA-BS是一种经济、快速、技术简单的方法,为“现场”、现场和临床环境,特别是经济贫困地区提供了一种实用性的测量方法。gydF4y2Ba
设计了F1ab- mcda和N- mcda引物,分别针对F1ab和N基因的10个区域,确保了新冠肺炎诊断的高选择性。特异性分析表明,从非sars - cov -2模板(包括细菌、真菌和病毒基因组模板)中,COVID-19 RT-MCDA-BS可正确诊断目标病原体,未观察到假阳性结果(gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba).此外,COVID-19 RT-MCDA-BS可以通过一步等温反应同时检测两个靶基因(F1ab和N),确保了COVID-19诊断的可靠性,与其他仅检测单个分子标记物的新冠肺炎诊断方法相比,消除了出现假阳性或假阴性结果的可能性。gydF4y2Ba如。gydF4y2BaF1ab生物标记)。gydF4y2Ba
检测限分析表明,新冠病毒RT-MCDA-BS对目标序列的可靠检测是敏感的。COVID-19 RT-MCDA-BS的灵敏度非常高,每次反应纯质粒模板可达5个拷贝(每个F1ab-plasimd或n -质粒),完全符合F1ab-RT-MCDA-BS和N-RT-MCDA-BS试验的检测结果(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充图S4和S5gydF4y2Ba).与单一的F1ab-RT-MCDA-BS和N-RT-MCDA-BS方法相比,COVID-19 RT-MCDA-BS分析灵敏度没有下降或提高。gydF4y2Ba
从COVID-19患者的粪便和鼻、肛门和咽拭子中分离出65个RNA样本,以验证该方法在临床的可行性。数据表明,COVID-19 RT-MCDA-BS方法能够分析不同类型的临床样本(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba).新冠病毒RT-MCDA-BS检测RNA阳性22份,贵州省疾控中心rRT-PCR检测RNA阳性20份。研究结果表明,我们的COVID-19 RT-MCDA-BS试验在检测COVID-19患者方面更有效,特别是那些病毒载量非常低的患者(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba).rRT-PCR的低诊断率可能是由于存在特异性影响rRT-PCR检测的抑制剂,或者是由于SARS-CoV-2 RNA模板的拷贝数较低,超出了rRT-PCR检测的检测限。此外,基于等温扩增的方法,包括基于mcda的方法(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaRT-MCDA-BS试验),对各种抑制剂不太敏感,或不太受样品缓冲液中各种盐的存在影响,或能耐受大量核酸的抑制作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].特别是,在非COVID-19样本中未得到阳性结果,这进一步验证了COVID-19 RT-MCDA-BS方法的分析特异性。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
我们设计了一种方法(COVID-19 RT-MCDA-BS),通过逆转录、多重检测和等温扩增结合纳米颗粒生物传感器诊断COVID-19。我们的数据表明,COVID-19 RT-MCDA-BS是一种高度特异性和敏感性的诊断方法,可以作为一种有吸引力的实验室工具,用于诊断不同类型的临床标本的COVID-19。新冠病毒RT-MCDA-BS诊断试验可在1小时内完成,不需要昂贵的试剂和仪器。总的来说,COVID-19 RT-MCDA-BS方法快速、低成本和易于使用,使其成为现场、初级保健和临床实验室使用的理想工具,特别是在资源匮乏的环境中。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
请注意:gydF4y2Ba补充材料不由编辑部编辑,上传时由作者提供。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Baerj - 02060 - 2020。补充gydF4y2Ba
可共享的PDFgydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们要感谢Chao Yang(美国纽约州纽约威尔康奈尔医学院特殊外科医院HSS研究所)在修改本稿过程中的语言帮助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
本文的补充资料可从gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
作者贡献:王毅和李世军构思和设计了这项研究。李世军、蒋维佳、黄俊飞、刘颖、任丽娟、庄力、郑钦妮、王明、杨睿、曾毅和王毅进行了实验。李世军,蒋维佳,黄俊飞和王毅分析了这些数据。李世军、蒋维佳、黄俊飞、刘颖、任丽娟、庄黎、郑钦妮、王明、杨睿和曾毅贡献了试剂和分析工具。李世军、蒋维佳、黄俊飞、任丽娟、庄莉、郑勤妮、王明、杨睿、曾毅对资料有贡献。王毅(音译)进行了软件测试。李世荣和王毅起草了手稿。易王修改了原稿。gydF4y2Ba
利益冲突:李s没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:蒋先生没有什么可透露的。gydF4y2Ba
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利益冲突:曾轶可没什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:王颖没有什么可透露的。gydF4y2Ba
支持声明:本研究由贵州省科技厅钱客河支持计划[2020]-4Y182、钱客河平台人才[2018]-5606、钱客河[2016]-4021、钱客河平台[2018]-5767资助。本文的资助信息已存入gydF4y2BaCrossref基金管理人登记处gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2020年3月25日。gydF4y2Ba
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