抽象的
COVID-19患者血浆可诱发肺微血管屏障功能衰竭,并随病情严重程度增加。本文报道了一个检测血浆介质和屏障稳定化合物治疗潜力的筛选平台。https://bit.ly/3k4C0tB
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大约20%的有症状的患者与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV的-2)感染的进展至重度疾病冠状2019(COVID-19)与临界低氧血症履行急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的标准。急性呼吸窘迫综合征的经典特征一致,严重COVID-19的特征在于,在计算机断层成像和弥漫性肺泡损伤磨玻璃影验尸[1],暗示渗透型肺水肿作为呼吸衰竭的驱动器。与这种概念一致,尸检结果显示出屈服于Covid-19的患者的严重肺内皮损伤[2].
目前,COVID-19中内皮屏障衰竭的程度及其机制尚不清楚。而肺内皮细胞中偶尔存在病毒颗粒已在尸检研究中报道[2],内皮细胞被认为不会在SARS中直接感染[3.].另外,内皮屏障失效也可能是由受感染的空气上皮释放的破坏屏障的介质和连续的免疫反应引起的。如果是这样,这些介质及其屏障破坏作用应可从血液循环血浆中恢复。在这里,我们提供了这一概念的原理证明,并报告了一个内皮屏障调节的筛选平台,该平台可用于1)识别病理介质和2)筛查屏障稳定化合物在COVID-19中的治疗潜力。
将柠檬酸盐等离子体被取样,作为前瞻性观察PA-Covid-19队列研究(伦理批准EA2 / 066/20)中的14例中度(住院,没有侵入性通风;世卫组织严重得分3-4)和19名患者(高流量O.2或插管或机械通气;世卫组织严重评分5-7)COVID-19。血浆样品在不含FCS的细胞培养基中稀释至10% (v/v),并通过1)电细胞-基质阻抗感应(ECIS Z-Theta,应用生物物理学),测试其破坏原代人肺微血管内皮细胞(HPMEC,第4-7条)单层膜屏障完整性的能力。2)使用REMS自动采样器(World Precision Instruments)测量内皮电阻(TEER); 3)内皮VE-cadherin和F-actin免疫荧光检测。15名健康献血者(伦理批准EA2/075/15)的血浆作为对照。real-time RT-PCR检测SARS-CoV-2 RNA。非covid -19患者肺组织(伦理批准EA2/079/13)在血浆刺激24小时后检测VE-cadherin和occludin的蛋白水平。数据以平均值±表示SEM..不同治疗组比较采用Mann-Whitney u检验或双向方差分析,然后采用Tukey’s事后测试。假设统计显着性P.<0.05。
与健康供体血浆相比,来自Covid-19患者的血浆诱导迅速(1-2小时内),持续(> 6小时)的HPMEC单层的内皮渗透性增加(图1A和b)。As shown by two methods, ECIS and TEER, the decrease in monolayer resistance after 6 h was more pronounced in plasma from patients with severe as compared to moderate disease. The barrier-disruptive effect of 10% severe COVID-19 plasma was comparable to that of 50 µmol·L-1血小板活化因子,肺微血管屏障的建立生物破碎。HPMEC单层中断是通过免疫荧光显微镜同样明显,表明交界的损失VE-钙粘蛋白和皮质肌动蛋白,形成的肌动蛋白应力纤维和内皮间间隙的形成响应于来自严重COVID-19的患者血浆相比于健康对照(图1C.).人肺组织暴露于严重COVID-19血浆导致连接分子occludin丢失,而VE-cadherin蛋白水平的变化未达到统计学意义(图1D).所有血浆样品,以及细胞裂解物和上清液从等离子体暴露HPMECs用于SARS-CoV的-2 RNA阴性。
血糖血清血管血管血管血管症2019(Covid-19)患者诱导内皮屏障失效。a)通过电池阻抗传感(ECIS)评估的肺部微血管内皮细胞单层的阻隔完整性响应于健康对照的10%(v / v)血浆(在t = 0 h)的刺激(样品/供体的数量:17/ 14),中等(25/14)或严重(22/16)Covid-19患者。在不同时间点获得来自同一患者的多个样品的情况。数据被标准化为健康供体中的内皮细胞(EC)抗性。b)eC单层对刺激的反式内皮电阻(Teer)响应刺激健康对照(7/7)的10%(v / v)血浆(在t = 0 h)和中等(4/4),或严重(8/7)Covid-19患者,中等对照和血小板激活因子为阴性和阳性对照。c)欧共体单层的代表性免疫荧光图像,其治疗6小时,含有10%(v / v)血浆的健康供体或严重的covid-19染色(左)Ve-cadherin(Cyan)或(中心)f-actin(绿色)。核以蓝色(DAPI)显示。通过自动分割算法(F-actin和Ve-Cadherin通道中的零值的选择像素,使用Fiji / Morpholibj-Plug,通过斐济/ Morpholibj-plug鉴定间隙区域(F-actin图像中的白色在F-actin图像中),并为EC单层定量从健康供体(7/7)或严重的Covid-19患者(7/7)(右)的血浆处理。 d) Representative western blots and quantification of VE-cadherin and occludin protein levels (normalised to healthy donors) in human lung samples from five donors treated for 24 h with plasma of three healthy donors or five severe COVID-19 patients. *: p≤0.05.
这里,我们证明从肺微血管内皮的COVID-19诱导患者强大的屏障功能血浆。该屏障中断等离子体的电位从中度增加至重度疾病,这一发现是与蛋白质组分析表明炎性生物标记物的血浆变化疾病严重程度的一个函数行[4.].而这种障碍破坏效应本身与COVID-19患者相比,COVID-19患者血浆中最近发现的一种独特的生物标志物特征可能不是COVID-19独有的,可能在其他危重患者中也同样明显例如严重的流感病毒感染[4.],表明特定介质或途径参与Covid-19相关内皮屏障失败。
与COVID-19患者血浆健康内皮单层的治疗与内皮显著间隙形成和交界损失相关VE-钙粘蛋白在内皮单层。连接蛋白的损失也是在人肺组织明显的,虽然表达水平大散射导致健康和COVID-19-等离子体处理过的人的肺组织之间存在相当大的重叠。在与下面的SARS-CoV的-2感染的患者的临床过程线,这些发现表明在基线以及响应于刺激COVID-19血浆宿主组织的实质性的生物变异性。值得注意的是,这些效果都不能归因于SARS-CoV的-2对内皮的直接作用,通过不存在病毒RNA的所证明。我们的研究结果为概念提供验证的原则,即1)内皮损伤和阻挡故障是严重COVID-19的特征,2)由内源性等离子体因素造成的,而不是由病毒感染直接损伤,以及3)可以驱动从温和的疾病进展为临界ARDS [2那5.].值得注意的是,内皮激活可能不限于对血管通透性的调节,但也可能有助于Covid-19相关血管病变的其他临床表现,例如微生物血栓形成和血管炎症。
在我们最近的蛋白质结合目前的工作中COVID-19等离子分析[4.]提供多功能平台,以筛选在高通量模式下的内皮渗透性的单个血浆介质的相关性。为此,随着疾病严重程度的函数,血浆介质和屏障失效的相关变化可以指导识别关键信号传导机制。相同的相关性,该平台允许筛选药物的预防或治疗效果,具有证明的障碍保护作用[4.].重要的是,COVID-19从症状发作到轻度、中度和最终严重疾病的缓慢进展的独特时间特征,为应用障碍稳定辅助疗法提供了一种模式情景。因此,我们建议,除抗病毒药物和免疫调节剂外,内皮屏障的药理学稳定应被视为COVID-19治疗的第三个支柱。
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致谢
作者感谢先进的医学生物成像核心设施Charité的-Universitätsmedizin柏林(AMBIO)(柏林,德国),用于采集成像数据的支持。
脚注
作者投稿:L. Michalick,交流Hocke,M. Witzenrath,S. Hippenstiel和W.M.库伯勒设想的研究;L. Michalick,S.韦登菲尔德,B.严峻,D. Fatykhova,P.D.Solymosi,M. Dohmen获得,M.C.布拉克,V.M.科尔曼和S.舒尔茨进行的实验和分析的数据;H.穆勒 - Redetzky,F.库尔特,N. Suttorp,F.贝伦斯,E. Thomasch,S.西蒙斯,J. Neudecker,M.滕尼斯,T.T. Bauer和S. Eggeling提供和收集的样本;F.库尔特和M. Witzenrath领导的临床研究;L. Michalick,A.C. Hocke,M. Witzenrath,S. Hippenstiel和W.M.库伯勒写的稿子; all authors revised and approved the manuscript.
利益冲突:S.韦登菲尔德有没有透露。
利益冲突:B.严峻有没有透露。
利益冲突:D. Fatykhova有没有透露。
利益冲突:P.D.Solymosi有没有透露。
利益冲突:F.贝伦斯有没有透露。
利益冲突:M. Dohmen获得有没有透露。
利益冲突:M.C.布拉克有没有透露。
利益冲突:S. Schulz无需披露。
兴趣冲突:E.托马克没有披露。
利益冲突:S. Simmons没有什么可披露的。
利益冲突:H.Müller-Redetzky无需披露。
利益冲突:萨托普没有什么可披露的。
利益冲突:F.库尔特有没有透露。
利益冲突:J. Neudecker有没有透露。
利益冲突:M. Toennies没有什么可披露的。
利益冲突:T.T.鲍威尔没有透露。
利益冲突:S. Eggeling有没有透露。
利益冲突:V.M.Corman没有披露。
利益冲突:A.C. Hocke没什么可透露的。
兴趣冲突:M. Witzenrath报告授予和个人费用,拜耳医疗保健,Biotest,Boehringer Ingelheim,Noxxon,Pantherna,沉默治疗方法和Vaxxilon,来自Quark Pharma和Takeda Pharma,Aptarion,Astazeneca,Berlin Chemie的个人费用,Chiesi,Glaxosmithkline,Novartis,Sinoxa和Teva,外面的工作;并且具有抑制Ang2 US8829179B2“发出的表达的专利。
利益冲突:S. Hippenstiel有没有透露。
利益冲突:W.M.库伯勒在研究进行期间报告从教育部和研究部(BMBF),德国科学基金会(DFG),德国中心心血管研究(DZHK)和加拿大卫生研究院Resarch(CIHR),补助金。
利益冲突:L. Michalick没有什么可披露的。
Support statement: A.C. Hocke and S. Hippenstiel are supported by Berlin University Alliance GC2 Global Health (Corona Virus Pre Exploration Project), BMBF (RAPID, alvBarriere-COVID-19, PROVID), DFG (SFB-TR 84), BIH, Charite 3R and Charité-Zeiss MultiDim; M. Witzenrath is supported by DFG (SFB-TR84) and BMBF (CAPSyS-FKZ, Phage4Cure-FKZ, SYMPATH, PROVID); W.M. Kuebler is supported by grants-in-aid from the BMBF (SYMPATH, PROVID), the DFG (DFG 1218/9-1, 1218/11-1, SFB-TR84), the German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), and the Canadian Institutes for Health Resarch (CIHR). Funding information for this article has been deposited with the交叉引用出资者注册.
- 收到了2020年6月18日。
- 公认2020年10月11日。
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