甲型流感病毒以人类肺中的II型肺细胞为目标

摘要

背景。高致病性禽流感H5N1病毒优先感染人肺肺泡II型肺细胞。然而，由于其他流感病毒的主要靶细胞尚未被系统研究，因此尚不清楚这种细胞趋向性是否有助于病毒的高毒力。

方法。我们首次比较了人高致病性禽流感病毒H5N1亚型和其他动物甲型流感病毒在人肺器官原代培养中的复制、趋向性和细胞因子诱导。

结果。H5N1亚型病毒和适应人类的H1N1亚型病毒和H3N2亚型病毒在肺组织中有效复制，而典型的猪病毒和低致病性禽病毒繁殖能力很差。然而，所有检测的病毒几乎都只在II型肺细胞中检测到，肺泡巨噬细胞也有少量受累。感染具有低致病性和高致病性的禽病毒会引起明显的细胞因子和趋化因子诱导，而人类和大流行的H1N1-2009病毒只会引发微弱的反应。

结论。这些发现表明，甲型流感病毒在人肺中致病潜力的差异不能归因于不同的细胞取向。更确切地说，病毒致病性的高低与II型肺细胞的高产复制和应对诱导的细胞因子反应的菌株特异性能力有关。

甲型流感病毒是正粘病毒科的典型成员，具有分段RNA基因组，主要在人类、猪和禽类宿主中传播[1］．甲型流感病毒对人类的社会经济影响是重大的，因为它们会导致急性严重呼吸道疾病，仅在美国每年就有3000 - 49000人死亡[2］．禽和猪宿主宿主直接影响人类流感的流行病学，因为具有部分或全部源自动物病毒基因的新毒株偶尔出现并在人群中传播。这些大流行病中最具破坏性的是1918年的西班牙流感，全球有4000万人死于这场流感。3.］．2009年，一种具有猪宿主库基因片段的新型甲型H1N1流感亚型病毒在北美出现，并迅速在全球传播，引发了本世纪第一次流感大流行[4］．

大多数禽流感病毒在人类呼吸道的复制已减弱[5，6]，最初被认为与独特的受体特异性有关。禽病毒的血凝素(HA)分子优先结合具有α-2,3连锁的唾液酸与半乳糖(α-2,3SA)，这对应于α-2,3SA在感染鸟类肠道的高表达，这是禽病毒的主要复制位点[7］．相反，典型人类菌株的HA主要结合在α-2,6 sa上，α-2,6 sa在人类气管中高度表达[8］．然而，最近认识到α-2,3SA和α-2,6SA受体决定因子均存在于人肺中，禽病毒和人病毒均可附着于肺泡上皮细胞[9 - 11］．这些发现表明，除特定受体外，还必须有其他因素限制禽流感病毒在人类宿主中的复制。

H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV-H5N1)是一种特殊的病毒，可引起人类致命的呼吸道疾病，死亡率接近60%，但其确切原因尚不清楚[12，13］．HPAIV-H5N1病毒可诱导高水平的细胞因子和趋化因子，这可能有助于增强免疫病理[在14到18岁］．然而，这种高细胞活力血症对疾病严重程度的意义最近在一项有争议的尸检结果的基础上引起了争论[19]和动物模型[20 - 22］．

感染H5N1病毒的死亡病人的主要病理表现是弥漫性肺泡损伤，而来自这类病人的病毒确实感染了肺泡上皮[12，13］．这导致人们认为，这些病毒的高致病性至少在一定程度上可能与独特的细胞趋向性有关[11，12，23］．人类肺中的各种细胞类型，包括杯状细胞、I型和II型肺细胞以及肺泡巨噬细胞，被认为对病毒攻击有不同的反应[24］．I型肺细胞是扁平的非分裂细胞，占肺泡组织中所有细胞的8%，覆盖95%的肺泡表面，负责气体交换和液体稳态。相比之下，占总细胞15%的立方型II型肺细胞可产生表面活性剂，并可作为分化为I型肺细胞的干细胞[24］．II型肺细胞在其细胞质中显示大量的线粒体和内质网，而这些细胞器在I型肺细胞中仅少量出现[25，26]，分别表示代谢活性高和低。值得注意的是，HPAIV-H5N1主要结合并感染II型肺细胞[10，23，27］．相比之下，季节性流感病毒最初感染上呼吸道的细胞，但在少数病例中，它们也会渗入肺部，导致严重的呼吸道并发症[28，29］．在人类肺组织的固定切片中，它们主要附着在I型肺细胞上[11］．然而，季节性菌株是否也能有效感染这些细胞尚未确定，因为缺乏尸检报告，组织培养系统和动物模型的信息价值也不确定。

为了提高我们对支持或限制流感病毒在下呼吸道中生长的机制的理解，我们使用了人离体肺模型。这使得首次系统地比较了来自人类、鸟类和猪宿主的a型流感病毒的复制、细胞趋向性和细胞因子诱导的实验模型，该实验模型保留了人类肺组织的三维结构和细胞多样性。最引人注目的是，所有检测的病毒主要感染II型肺细胞，尽管我们观察到菌株之间在复制和细胞因子诱导方面存在很大差异。这些结果表明，流感病毒在人肺中的致病性不是由细胞向性决定的，而是与II型肺细胞的复制程度和应对诱导细胞因子反应的能力有关。

材料与方法

肺外植体、组织培养和病毒

新鲜的肺外植体取自柏林胸外科中心接受肺切除术的患者。所有患者均获得书面知情同意，研究得到Charité诊所伦理委员会的批准(项目EA2/050/08和EA2/023/07)。无肿瘤的正常肺组织立即被压成小圆柱(高度~ 3;直径8毫米)，在罗斯威尔公园纪念研究所1649培养基(含0.3%牛血清白蛋白，2毫米l -谷氨酰胺和抗生素)中培养，37°C, 5% CO₂．培养过夜后，肺组织培养物接种4 × 10⁵空斑形成单位(PFU)病毒1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗3步以去除多余的病毒。为了进行生长曲线分析，采用标准斑块法对Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞上清液进行滴定，如其他地方所述[30.］．MDCK细胞在37°C和5% CO中生长₂最低必需培养基(含10%胎牛血清、2 mM l -谷氨酰胺和抗生素)。本研究使用的病毒包括从一致命病例中分离的HPAIV A/泰国/1(坎-1)/2004(泰国/04[H5N1])毒株、大流行A/Bayern/63/2009 (Bay/09[H1N1pdm])毒株、季节性A/新喀里多尼亚/20/1999 (NC/99[H1N1])和A/巴拿马/2007/1999 (Pan/99[H3N2])毒株、低致病性禽病毒A/鸭/阿尔伯塔/60/76 (Dk/Alb[H12N5])毒株和经典猪病毒A/swine/Wisconsin/1/67 (Sw/Wis[H1N1])毒株(表2)1)．我们使用了由反向遗传学产生的a/巴拿马/2007/1999流感病毒株的重组版本，这将在其他地方进行描述。人病毒株是在MDCK细胞上培养的，而鸭和猪分离株是在11天大的胚鸡蛋中培养的。将病毒储存在-80°C，并通过空斑试验在MDCK细胞上滴定。所有有关H5N1病毒的实验都是在地方当局批准的用于处理这些病毒的生物安全3级遏制实验室中进行的。

免疫组织化学和共聚焦显微镜

肺组织用4%多聚甲醛(Sigma)固定。脱蜡后，组织切片在柠檬酸缓冲液中加热(10 mM柠檬酸钠;pH 6.0)， 95°C, 30分钟进行抗原提取，1% Triton-X-100渗透15分钟。用5%足够的血清阻断载玻片30分钟，并用稀释的Alexa Fluor 488标记的甲型流感病毒特异性抗体(Serotec OBT1551;1:30)在4°C过夜。甲型流感病毒粒子抗体使用DyLight 488 Microscale Antibody Labeling Kit (Thermo Scientific)进行标记。如果需要，用矢量红染色法检测凝集素的α-2, 3 -和α-2, 6 -连接唾液酸。然后将组织切片与前表面活性剂蛋白C的一抗(Chemicon AB3786;1:800)， EMP2 (Sigma HPA014711;1:50)，和/或CD68 (Abcam ab955-500; 1:50), respectively. Afterward, the slides were incubated with corresponding Alexa 546– or Alexa 555–conjugated secondary antibodies (Invitrogen), mounted in Mowiol, and analyzed with LSM 780 or LSM5 Pascal confocal microscopes (objectives 40×, Plan-Neofluar/oil, NA 1.3; 63×, Plan-Apochromat/oil, NA 1.4; Zeiss, Jena, Germany).

透射电子显微镜

人肺外植体被病毒感染24小时，随后用2.5%戊二醛(50 mM HEPES)浸泡固定，再用1% OsO固定₄(1小时)，0.1%单宁酸(50毫米HEPES 30分钟)，和2%醋酸铀酰(2小时)。样品在分级乙醇中脱水，并嵌入Epon树脂。使用超微切片仪(Ultracut S，徕卡，Wetzlar，德国)切割薄片，并用2%醋酸铀酰(20分钟)和柠檬酸铅(3分钟)进行反染色。切片用TEM 902显微镜(Carl Zeiss SMT AG)检查。图像数字化使用慢扫描电荷耦合设备相机(Pro Scan, Scheuring，德国)。

细胞因子和趋化因子测定

用0.15% TNBP/Triton X-100在4℃下灭活病毒1小时后，用Procarta细胞因子测定试剂盒(Panomics)测定感染肺外植体上清液中IP-10和MIP-1β的浓度。使用商用酶联免疫吸附试剂盒(Fujirebio, Tokyo, BD Biosciences, Heidelberg)分析上清液中的干扰素β (IFN-β)和白介素1β (IL-1β)水平。

结果

人肺外植体支持甲型流感病毒的复制

系统比较人类和动物甲型流感病毒的复制情况(表2)1)，我们建立了离体外植体模型。肺标本主要由复杂的肺泡组织组成，来源于肺下叶(图1一个)．用季节性Pan/99(H3N2)病毒感染外植体导致生产性感染，培养上清中感染性病毒颗粒数量大幅增加(图2)1B)．通过释放的乳酸脱氢酶(数据未显示)的持续低值判断，标本的活力保持稳定长达96小时。因此，在0小时或1天后，来自同一供体的外植体感染仅导致病毒生长曲线之间的微小差异(图1B)．胰蛋白酶的添加并没有增加病毒滴度，这表明在肺外植体中保留了裂解激活病毒HA所需的蛋白酶活性(数据未显示)。

系统的复制效率比较显示了菌株之间的显著和可复制性差异:季节性的Pan/99(H3N2)和高致病性的泰国/04(H5N1)病毒繁殖效率高，而低致病性的禽Dk/Alb(H12N5)病毒复制效率低2个数量级(图1C)．同样，季节性和大流行性H1N1病毒NC/99(H1N1)和Bay/09(H1N1pdm)复制到类似滴度，而经典猪流感病毒Sw/Wis(H1N1)的生长显著减弱(图1D)．观察到的差异不太可能是特定受体偏好的结果，因为凝集素组织化学分析确定了肺泡腔室中的α-2,3SA和α-2,6SA受体决定因子(补充图1)，以证实先前的报告[9］．总的来说，这些数据表明人类和动物甲型流感病毒在人类肺组织中的生长能力存在显著差异。有趣的是，不同的甲型流感病毒在外植体中复制的能力与它们在人类中引起下呼吸道感染的能力之间似乎存在相关性。

高致病性H5N1和季节性和大流行病毒主要感染II型肺细胞

猪和低致病性禽流感病毒的生长受限可能是由几种因素引起的，包括缺乏初始感染、低病毒基因表达、先天免疫反应的强烈激活或细胞取向的差异。为了在细胞水平上确定人类和动物病毒株之间可能的差异，我们感染人类肺外植体并进行免疫组化分析(图2)．尽管在人肺组织中繁殖不良，但在低致病性禽病毒和典型猪病毒感染的细胞中检测到病毒抗原的比例相似。有趣的是，病毒粒子抗原和II型标记物表面活性剂蛋白C前体[25结果显示，感染Sw/Wis(H1N1)、Dk/Alb(H12N5)、Pan/99(H3N2)、NC/99(H1N1)、Thai/04(H5N1)、Bay/09(H1N1pdm)病毒的细胞绝大多数为II型肺细胞(图2一个和2B)．相反，我们未能在I型肺细胞中检测到任何这些病毒，这是通过标记抗原EMP2的染色判断的3.)和小穴蛋白1(数据未显示)，尽管凝集素染色证实在两种类型的肺细胞上都存在人类和鸟类菌株的受体(图3.C)．病毒抗原和CD68标记物的双染色也检测到所有病毒的流感病毒抗原阳性的肺泡巨噬细胞(补充图2)．最有可能的是，这表明巨噬细胞正在感染，因为在紫外线(UV)灭活病毒孵育后，没有检测到A型流感病毒阳性细胞(数据未显示)，尽管不能排除部分信号是由吞噬病毒抗原引起的。组织横切面上感染细胞类型的定量显示，肺泡巨噬细胞仅占抗原阳性细胞的4%-11%，而根据病毒株的不同，89%-96%为II型肺细胞(图)4)．

为了评估我们在超微结构水平上关于细胞趋向性的免疫组化数据，我们感染了肺外植体并进行了透射电镜处理。数字5图中为感染Pan/99(H3N2) 24小时后肺外植体的肺泡上皮细胞。在细胞顶端观察到病毒颗粒出芽，通过典型的表面活性剂填充的多层体被鉴定为II型肺细胞(图5一个和5B)．在我们所有的标本中，我们都没有观察到病毒从具有I型肺细胞特征的细胞中萌芽。这些数据表明，人类和动物甲型流感病毒对人类肺组织中的II型肺细胞具有相同的细胞趋向性，尽管它们在这些细胞中繁殖的能力显著不同。

人类和动物甲型流感病毒在人肺组织中细胞因子和趋化因子的差异诱导

目前尚不清楚在h5n1感染患者和小鼠中观察到的细胞因子水平升高是否[16，20.，22]主要来源于原感染的上皮细胞和肺泡巨噬细胞或募集的免疫细胞。因此，我们确定了HPAIV和其他病毒在肺组织中诱导细胞因子的情况。季节性NC/99(H1N1)病毒和Pan/99(H3N2)病毒以及大流行Bay/09(H1N1pdm)病毒感染人肺组织后，仅引起非常微弱的IP-10、MIP-1β、IFN-β和IL-1β的分泌(图6)．相比之下，泰国/04(H5N1)病毒引起了这些细胞因子和趋化因子的强烈诱导。令人惊讶的是，低致病性禽病毒Dk/Alb(H12N5)也引起了这些细胞因子和趋化因子的明显诱导，其水平比季节性NC/99(H1N1)高3- 13倍。当用紫外线灭活病毒或尿囊液检测组织时，这种上调几乎没有发生，这表明细胞因子诱导是由病毒感染引发的(补充图3)．典型的猪病毒Sw/Wis(H1N1)引起弱细胞因子反应，仅IP-10达到明显高于季节性病毒的水平。总之，这些发现表明，低致病性禽流感病毒和高致病性禽流感病毒在肺泡组织中诱导的细胞因子反应比人类适应性病毒强得多，即使在没有招募免疫细胞的情况下。

讨论

流感是源自动物宿主的主要人类传染病的一个主要例子，该宿主继续提供病毒基因，以产生具有独特生物学或抗原性的新型人类病毒株[1，31］．流感病毒通过其易出错的RNA聚合酶获得额外的遗传多样性，该酶可以在新宿主中迅速产生具有选择优势的突变变体。因此，已知禽流感病毒的病毒聚合酶和血凝素分子突变可促进对哺乳动物宿主的适应[6］．然而，对促进或限制流感病毒在人体内生长的宿主因素的全面了解才刚刚开始出现[6，32］．

我们的目标之一是更好地了解流感病毒适应严重流感中受到强烈影响的人类下呼吸道的相关过程。在这里，我们系统地比较了移植的人肺组织中来自人、禽和猪宿主的甲型流感病毒的趋向性、复制和细胞因子诱导。HPAIV-H5N1和适应人类的季节性和大流行病毒能够有效繁殖，这一发现支持了肺器官培养对我们研究的适用性。相比之下，低致病性禽病毒和典型猪病毒的复制能力较差，这可能反映了大多数禽病毒在人体内的强烈衰减，以及很少发现人类患者感染猪流感病毒[5，33］．

数学模型表明，特定的细胞取向可能强烈影响流感的严重程度[34］．事实上，靶细胞类型的差异与禽流感和甲型流感病毒在重建的人气管支气管上皮中的复制量相关[35，36］．同样，也有人提出H5N1病毒在人类肺中优先感染II型肺细胞可能解释了患者和非人类灵长类动物的高病毒载量和强烈的病理反应[10，11，23］．这一建议是基于该细胞类型的快速代谢及其在维持肺泡表面张力和启动修复过程中的重要作用[12，27，37］．然而，移植肺组织的免疫组织化学和电子显微镜分析本质上削弱了这一假设，因为HPAIV-H5N1和所有其他检测的病毒显示出强烈的偏好感染II型肺细胞，尽管它们的子代滴度相差几个数量级。这些结果证实并扩展了先前关于在II型肺细胞中检测大流行和季节性毒株的病毒抗原的报道，然而，这些报道并没有涉及在这种细胞类型中产生传染性病毒颗粒[38，39］．我们发现有趣的是，至少有另一种重要的呼吸道病毒病原体，SARS冠状病毒，已经进化到优先在II型肺细胞中复制，尽管它显然使用不同于流感病毒的细胞进入受体[40-42］．这表明II型肺细胞对病毒感染高度敏感，这可能是未来抗病毒治疗发展中重要的考虑因素。

根据流感病毒和II型标记抗原染色的大量重叠，我们没有在I型肺细胞中检测到病毒基因表达，这表明感染在这些细胞中没有超过早期阶段。季节性流感病毒先前被证明主要附着在固定肺切片上形态类似于I型肺细胞的细胞上，但这是否启动了病毒复制周期尚未得到解决[11］．有趣的是，据报道，I型细胞在从肺组织纯化后可被流感病毒感染[43，44］．显然，需要进一步的工作来解决为什么在II型肺细胞也存在的肺器官培养中没有观察到这一问题。

在感染的肺标本中，我们还在一些肺泡巨噬细胞中检测到病毒抗原，无论检测哪种菌株。这一发现与最近的报道一致，这些报道表明分离的肺泡巨噬细胞容易感染人类和禽流感病毒[44，45］．然而，巨噬细胞只占所有感染细胞的很小一部分，它们很可能对病毒的生长没有很大的贡献，但很可能对细胞因子的产生有很大的贡献。季节性H3N2和H1N1病毒仅诱导中度细胞因子反应，表明这些病毒避免或抑制肺上皮组织的强烈激活[46］．此外，甲型H1N1-2009流感大流行病毒引发了弱细胞因子反应，这证实了先前涉及受感染的人类巨噬细胞、树突状细胞和原发肺泡细胞的报道[47，48］．低水平的细胞因子诱导可能是H1N1-pdm病毒在人体内成功繁殖和快速传播的原因。H5N1病毒的复制能力至少与季节性H3N2病毒相同，但在人肺外植体的常驻肺泡细胞中诱导了强烈的细胞因子反应。由于在体外感染模型中不存在被招募的免疫细胞，因此HPAIV-H5N1在感染患者中可能会明显诱导细胞因子[16]已经在被感染的肺泡细胞水平启动。

有趣的是，低致病性禽流感病毒在肺外植体中也引发了强烈的细胞因子反应，尽管病毒生长不佳。这一发现表明，该病毒要么产生大量RNA，导致控制细胞因子诱导的细胞内受体的增强激活，要么鸟类受体决定因子的连接为细胞因子基因的表达提供了信号。后一种可能性与最近的研究结果相一致，这些研究结果表明，与HPAIV-H5N1病毒相比，低致病性禽H5N1病毒感染小鼠肺部的MIP-1α和IL-1β浓度相等甚至更高[22］．此外，Ramos等人最近表明，鸟类受体结合偏好有助于多种人类细胞中强烈的细胞因子诱导，但其确切原因目前尚不清楚[49］．相比之下，典型的猪病毒只引发低水平的细胞因子分泌。因此，动物流感病毒在人肺中的不良生长不一定是由强烈的细胞因子诱导引起的，而可能涉及其他病毒和/或细胞因素。

II型肺细胞被鉴定为流感病毒的共同靶细胞，对人类和高致病性H5N1禽流感毒株复制的选择性支持，以及启动细胞因子反应的能力，突出了人类肺器官培养在提供病理生理过程见解方面的价值。人类肺组织对特定流感病毒的耐受能力是否取决于其在II型肺细胞中的固有复制特性，这是一种抵御诱导的先天反应的特定适应[50]，或两者的组合仍有待确定。我们应该记住，没有任何离体或动物模型能够完全重现人类呼吸道的复杂结构和免疫反应。然而，本研究中获得的实验结果与临床和病理观察结果密切相关，因此可以在未来的分析中对物种适应、先天免疫反应和治疗干预等因素进行更详细的调查。

笔记

致谢我们感谢Andrea Zöhner、Gudrun Heins和Doris Stoll的出色技术支持，以及Matthias butt对手稿的批评意见。

财政支持。这项工作得到了FluResearchNet的支持，FluResearchNet由德国联邦研究和教育部资助(BMBF授予01 KI 07131给S. H.，并授予01 KI 07132和01 KI 1006 C给T. W.)， PROGRESS(肺炎研究网络对严重败血症进化的遗传耐药性和易感性)，由BMBF资助(授予C8给A. c.h .);德国研究机构跨区域合作研究中心SFB-TR84(授予B2给t.w.， Z1a给a.c.h, Z1b给a.d.g.)。J. K.由国际马克斯·普朗克传染病和免疫学研究学院资助。

潜在的利益冲突。所有作者:无冲突报告。

所有作者都提交了ICMJE潜在利益冲突披露表。编辑认为与稿件内容相关的冲突已被披露。

参考文献

作者指出