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临床医学新型冠状病毒肺炎免疫学传染性疾病免费访问|10.1172 / JCI137244
1传染病科及研究所,
2呼吸疾病科
3.检验医学学系,
4急诊医学系,还有
5华中科技大学同济医学院同济医院儿科
通讯地址:武汉430030华中科技大学同济医学院同济医院传染病科及研究所秦宁或吴迪电话:86.27.8366.2391;电子邮件:qning@vip.sina.com(问:宁);woody_1984@163.com吴(d)。
作者注:GC、DW、WG和YC是共同第一作者。DH、HW、TW、XZ为共同第二作者。
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2020年3月27日发布更多信息
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒大流行传染病(COVID-19)正在全球迅速蔓延。在这一期的JCI中,Chen和同事比较了中、重度COVID-19的临床和免疫学特征。作者发现入院时呼吸窘迫与不良预后相关。细胞因子水平(IL-6、IL-10和TNF-α)升高、淋巴细胞减少(CD4+和CD8+ T细胞)以及CD4+ T细胞中IFN-γ表达降低与严重的COVID-19有关。总体而言,该研究表征了严重COVID-19中的细胞因子风暴,并为免疫治疗和疫苗设计提供了见解。
萨凡纳·f·彼得森,何雅芝
背景。自2019年12月以来,由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)在武汉暴发,目前已成为全球威胁。我们的目的是描述和比较重症和中度COVID-19的免疫学特征。
方法。回顾性分析21例新冠肺炎患者(男17例,女4例)的临床及免疫学特征。根据中国国家卫生健康委员会发布的指南,这些患者分为重度(11例)和中度(10例)。
结果。重度和中度病例的中位年龄分别为61.0岁和52.0岁。常见临床表现为发热、咳嗽、乏力。与中度患者相比,重度患者更多出现呼吸困难、淋巴细胞减少、低白蛋白血症,丙氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、c反应蛋白、铁蛋白、d -二聚体水平升高,IL-2R、IL-6、IL-10、TNF-α水平明显升高。T淋巴细胞,CD4的绝对数量+T细胞和CD8+几乎所有患者T细胞均下降,重症患者T细胞明显降低(294.0、177.5和89.0 × 10)6/L分别为640.5、381.5和254.0 × 106分别为/ L)。CD4细胞对IFN-γ的表达+重症患者的T细胞水平(14.1%)低于中度患者(22.8%)。
结论。SARS-CoV-2感染可能主要影响T淋巴细胞,特别是CD4+和CD8+T细胞,导致数量减少以及CD4产生的IFN-γ+T细胞。这些潜在的免疫学标志物可能很重要,因为它们与COVID-19疾病严重程度相关。
试验注册。这是一项没有试验注册号的回顾性观察性研究。
资金。本工作由同济医院试点项目资助,国家传染病科学技术“十三五”项目(2017ZX10202201)资助。
冠状病毒(CoVs)是一大类呼吸道病毒,可引起从普通感冒到中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等疾病(1,2),两者均为人畜共患,可引致致命的下呼吸道感染及肺外表现。这种新型冠状病毒,正式命名为SARS冠状病毒2 (SARS-CoV-2),是中国疾病预防控制中心(CDC)在武汉首次发现的β-冠状病毒B谱系的成员。3.,4)。最近的报告提供了SARS-CoV-2在家庭和医院环境中人际传播的证据(5,6)。截至2020年2月27日,全球SARS- cov -2病例数已超过82567例,大大超过2003年疫情期间的SARS病例总数,目前已有2810多人死亡。2019冠状病毒病(COVID-19)的爆发使中国和全球卫生部门处于高度戒备状态。
研究显示,SARS-CoV-2的基因组序列与SARS-CoV相同75%至80%,与几种蝙蝠冠状病毒有更多相似之处(7)。COVID-19患者的临床和流行病学特征表明,SARS-CoV-2感染可引起临床表现与SARS-CoV非常相似的严重呼吸道疾病聚集性病例,导致重症监护病房(ICU)住院和高死亡率(8)。临床表现包括发热、疲劳、干咳、呼吸短促和急性呼吸窘迫综合征。此外,一项对首批41例实验室确诊的COVID-19病例的研究表明,63%的患者患有淋巴细胞减少症,细胞因子风暴可能与疾病严重程度有关。然而,关于重症和中度COVID-19之间免疫学特征的信息很少(8)。
在本研究中,我们对武汉同济医院收治的21例COVID-19患者的特征进行了综合评估。我们的目的是比较重症和中度病例的临床和免疫学特征。这些发现可能有助于我们扩大对SARS-CoV-2感染中与疾病严重程度相关的风险因素的理解。
重症和中度COVID-19患者人口统计学和基线特征。截至2020年1月27日,同济医院确诊肺炎住院患者21例。在这些患者中,只有4例(包括3例家族聚集性确诊病例)直接接触过华南海鲜市场。根据中国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊断和管理指南(第6版)》(9经皮血氧饱和度(SpO) 11例(52.4%)2) 93%或更低或室内空气呼吸频率为30/min或更高,需要高流量鼻插管或使用双水平气道正压通气(BiPAP)模式进行无创机械通气以纠正低氧血症的患者被归类为重症COVID-19,而10例(47.6%)未达到重症COVID-19标准的患者被视为中度。重度和中度均以男性患者为主。重度病例的中位年龄(61.0岁)明显高于中度病例(52.0岁)(表1)。更严重的病例有合并症。从出现症状到首次住院的中位时间,重症病例为8.0天,中度病例为7.0天。
11例重症病例中有4例在发病后平均20天死亡。4例死亡患者均为男性,年龄在50岁及以上,其中2例患有高血压。死亡病例的中位年龄为64.0岁。3例患者有动脉氧张力/吸气氧分数比(PaO)2/ FiO2),收费不超过100元。
除1例因意识障碍(昏迷)无明确病史的患者(归类为重症)外,发病时最常见的临床表现为发热、咳嗽、疲劳、肌痛。较不常见的症状包括咳痰、腹泻、头痛和咯血。与中度病例相比,重度病例胸闷更常见。此外,呼吸急促和呼吸困难仅在严重病例中出现。严重者均出现呼吸困难,其中9例伴SpO293%或更低的人没有改善SpO2即使使用高流量鼻插管;9例均采用BiPAP通气模式治疗低氧血症。10例患者入院时行动脉血气(ABG)检查,其中重度6例,中度4例。其中,PaO2/ FiO2重度患者(104.8)明显低于中度患者(371.7),6例重度患者中有3例低于100。
重症和中度COVID-19的实验室检查结果和CT扫描。与正常范围相比,3例(30%)中度患者入院时全血计数轻度白细胞减少,而所有重症患者入院时白细胞计数正常或略高于正常上限(ULN) (表2)。重型病例白细胞计数和中性粒细胞计数明显高于中度病例,而淋巴细胞计数明显低于中度病例(0.7 × 109(1.1 × 10)9/ L)。淋巴细胞减少(淋巴细胞计数<0.8 × 10)9重度8例(72.7%),中度1例(10.0%)。P= 0.008)。总体而言,重症患者白细胞计数增加(P= 0.003),但淋巴细胞计数(P= 0.049)。
重度患者谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平明显高于中度患者。重症患者白蛋白浓度明显低于中度患者,低白蛋白血症(白蛋白< 32 g/L)在重症患者中更为常见(表2)。重度患者乳酸脱氢酶(LDH)水平、血清高敏c反应蛋白(hsCRP)、铁蛋白和d -二聚体水平明显高于中度患者。此外,严重病例的血清降钙素原水平往往高于中度病例。这些结果表明,在严重的情况下,全身性炎症水平增加。
所有患者入院时胸部CT扫描均发现肺间质异常。21例患者中,10例(90.9%)重度患者和7例(70%)中度患者入院时双侧受累(表2)。重症COVID-19入院时胸部CT典型表现为双侧磨玻璃影及亚节段性实变区(图1一个),然后迅速进展,双肺可见高密度团块影(图1 b)。中度COVID-19代表性胸部CT表现为双侧磨玻璃影(图1 c)。4天后胸部CT显示双侧毛玻璃样混浊已消除(图1 d)。
COVID-19患者胸部计算机断层扫描。62岁女性重症COVID-19患者,症状出现后第6天胸部CT轴位肺窗显示双侧磨玻璃影和亚节段实变区(一个),典型表现为在症状出现后第8天出现双侧多小叶和亚节段实变的白色肺外观(B)。32岁男性中度新冠肺炎患者胸部CT轴位肺窗,症状出现后第7天双侧磨玻璃影(C),症状出现后第11天双侧毛玻璃混浊消失(D)。
重症和中度COVID-19的免疫学特征。我们评估了血浆细胞因子水平,以检查这些患者中细胞因子风暴的存在。入院时的血清细胞因子评估显示,重症患者的白细胞介素2R (IL-2R)、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子α (TNF-α)水平明显高于中度患者(图2和补充表1;本文提供的在线补充材料;https://doi.org/10.1172/JCI137244DS1)。在几乎所有重症或中度COVID-19患者中均检测不到IL-1β浓度(<5 pg/mL)。总的来说,我们发现巨噬细胞相关的促炎细胞因子,特别是IL-6、IL-10和TNF-α,在大多数重症病例中显著升高。值得注意的是,IL-6水平在中度和重度病例中均升高。
COVID-19患者血浆细胞因子水平重症患者血浆细胞因子水平系列比较(n= 9),中度病例(n= 7)。所有数据均以平均值±SEM表示。使用未配对的2-sided Student’s来检验差异t测试。
接下来,我们检查了外周血中免疫细胞的比例和效应功能(图3和表3)。循环免疫细胞亚群的初步分析,如下图所示表3,证明了T淋巴细胞、CD4的绝对数量+T细胞和CD8+绝大多数重症或中度患者的T细胞均低于正常(LLN)下限,重症患者的T细胞减少更严重(294.0、177.5和89.0 × 10)6/L分别为640.5、381.5和254.0 × 106/L) (图3,A和B)。重度患者B细胞比例(20.2%)明显高于中度患者(10.8%)。这可能部分是由于在严重病例中T淋巴细胞的显著减少。此外,8例重症患者中有6例(75.0%)除B细胞外所有淋巴细胞亚群均明显减少,总T细胞计数低于400 × 106/ L, CD8+T细胞计数低于150 × 106/L, NK细胞计数低于77 × 106/ L。在这6例患者中,3例(50%)最终死亡。
COVID-19患者免疫细胞亚群数量及IFN-γ表达比例(一个NK细胞、CD4细胞流式细胞术分析+T细胞,CD8+T细胞和treg细胞以及通过CD4产生IFN-γ+T细胞,CD8+T细胞和NK细胞来自一个有代表性的病人。(B) T淋巴细胞和B淋巴细胞、CD4淋巴细胞的绝对数目的一系列比较+T细胞,CD8+T细胞和NK细胞在重症病例(n= 8),中度病例(n= 6)。C) CD4细胞产生IFN-γ的一系列比较+T细胞,CD8+T细胞和NK细胞在重症病例(n= 6),中度病例(n= 7)。所有数据均以平均值±SEM表示。使用未配对的2-sided Student’s来检验差异t测试。
调节性T细胞(Tregs) (CD4+CD25+CD127罗)和CD45RA+在几乎所有的重度和中度病例中,Tregs都降低(低于LLN), CD45RA也降低+重度患者Treg比例(0.5%)明显低于中度患者(1.1%)。CD4减少干扰素γ (IFN-γ)的表达+T, CD8+部分重症(分别为50%、16.7%和16.7%)和中度(分别为14.3%、0%和14.3%)患者均有LLN以下的T、NK细胞。CD4细胞对IFN-γ的表达+重症患者T细胞水平(14.1%)低于中度患者(22.8%)(表3和图2 c)。但CD4细胞产生IFN-γ的平均荧光强度差异无统计学意义+T, CD8+T细胞或NK细胞(数据未显示)。总的来说,我们发现CD4显著减少+T细胞计数和严重病例中IFN-γ表达的交界性降低。
COVID-19的并发症和临床结局。关于并发症,如补充表2在美国,严重病例中常见的并发症包括急性呼吸窘迫综合征(占可获得ABG数据患者的100.0%)和呼吸衰竭(83.3%)。重症患者较少见的并发症包括继发性感染(27.3%)、急性心脏损伤(9.1%)、缺氧性脑病(18.2%)、急性肾损伤(18.2%)、休克(9.1%)和急性肝损伤(9.1%),其中大部分在康复病例中未发生。
所有重型和中度病例均给予经验抗菌药物治疗(莫西沙星和/或头孢菌素等)。7例(63.6%)重症病例和所有中度病例接受抗病毒治疗(奥司他韦和/或更昔洛韦)。此外,所有重症和中度病例在住院期间给予皮质类固醇(甲基强的松龙)。重症9例(81.8%),无中度病例需要无创机械通气。截至2020年2月2日,11例重症病例中有4例(36.4%)死亡,中度病例中无一例(0.0%)死亡,从发病到死亡的中位天数为20天。1例重度和1例中度患者康复。经实验室确诊为SARS-CoV-2感染的患者被转移到指定医院。
这是据我们所知的第一个描述性评估实验室确诊的SARS-CoV-2感染患者免疫学特征的初步研究。最近报道了COVID-19患者的临床和流行病学特征(5,6,8,10)。然而,对病理生理参数,特别是免疫指标的认识不足,无法理解COVID-19的发病机制。与以往报告(8),本研究表明,与SARS-CoV相似,男性在COVID-19发病率中占主导地位,这表明男性比女性更容易感染SARS-CoV-2。老年男性(50岁至50岁),特别是那些有潜在合并症的男性,可能更容易患上严重的COVID-19。发病时最常见的临床表现包括发热、咳嗽、疲劳和肌痛。严重者更常出现呼吸困难和急性呼吸窘迫综合征。实验室检查结果:白细胞增多(≥10 × 109/L)和淋巴细胞减少(<0.8 × 109/L)在重度病例中比在中度病例中更常见。ALT、LDH、d -二聚体和炎症标志物(包括hsCRP和铁蛋白)在重度病例中显著高于中度病例。血清促炎因子和抗炎因子浓度,包括IL-2R、IL-6、TNF-α和IL-10,在大多数重症病例中均升高,且明显高于中度病例,提示细胞因子风暴可能与疾病严重程度相关。同样,SARS也表现为强烈的炎症反应和肺损伤。先前使用SARS小鼠模型进行的一项研究表明,SARS- cov复制的快速动力学和IFN-I信号传导的延迟促进了炎症单核细胞-巨噬细胞积聚,导致肺细胞因子/趋化因子水平升高、血管渗漏和T细胞反应次优(11)。COVID-19细胞因子积累的细胞起源和机制有待进一步探索。
此外,我们注意到SARS-CoV-2感染可导致循环淋巴细胞和T细胞亚群显著减少。虽然大多数患者外周血T细胞亚群的比例保持在正常范围内,但CD4下降+和CD8+在严重和中度病例中,低于LLN的T细胞计数相当频繁。更重要的是CD4的数量+和CD8+重症患者T细胞明显低于中度患者。相比之下,大多数患者的B细胞比例和数量都没有减少,75.0%的重症患者B细胞比例增加。这可能部分是由于这些患者的T淋巴细胞明显减少。值得注意的是,8例重症病例中有6例,而有可用免疫学数据的中度病例中没有一例显示出除B细胞外所有淋巴细胞亚群的广泛而显著的下降。在这6例患者中,3例最终死亡。此外,CD4细胞产生IFN-γ+T细胞,而不是CD8细胞+重症患者的T细胞或NK细胞水平往往低于中度患者。这些数据表明,SARS-CoV-2感染可诱导淋巴细胞减少,尤其是CD4细胞减少+和CD8+T细胞,以及通过CD4抑制IFN-γ的产生+与COVID-19疾病严重程度相关的T细胞。
虽然重度和中度患者总Treg比例相当,但重度患者的CD45RA比例明显较低+幼稚Tregs (nTregs)和其记忆对应体CD45RO的比例略高+内存treg (mtreg)。nTregs可能在外周被抗原激活,随后转化为mTregs,因此被认为是抗原经历的mTregs的前体细胞,与mTregs相比具有同样强的抑制能力(12)。据报道,外周内稳态机制在控制Treg多样性和维持健康个体的免疫耐受方面至关重要。这些机制的紊乱可能产生有害的后果,并可能导致某些疾病的发展,特别是自身免疫性疾病(12)。当前研究中观察到的Treg比例的改变是否与COVID-19的严重程度有关,或者是否与病毒血症有关,还有待进一步调查。
CD4+T细胞在调节免疫反应,协调免疫细胞,特别是CD8的缺失和扩增中起着关键作用+T细胞。CD4+T细胞通过B细胞的T依赖性激活促进病毒特异性抗体的产生(13)。然而,CD8+T细胞主要通过两种机制发挥作用,对靶细胞的细胞溶解活性或细胞因子的分泌,包括IFN-γ、TNF-α和IL-2,以及许多趋化因子(14)。IFN-γ的产生对于抵抗各种病原体(如病毒、细菌和寄生虫)的感染至关重要(15)。作为IFN-γ的主要来源,T细胞对感染的反应能力是适应性免疫反应的一部分,需要数天时间才能产生显著的IFN-γ反应。
在这项研究中,虽然减少了CD8的数量+重症病例检测T细胞中CD8的比例+HLA-DR+T细胞略高于中度病例,这与最近的一份病例报告(16)。CD8+发现T细胞含有高浓度的细胞毒性颗粒成分,包括穿孔素和颗粒素(16)。此外,几乎所有这些人群都表现出细胞因子风暴;1例死于SARS-CoV-2的重症病例目前唯一可用的组织学检查显示肺间质单核炎性浸润,以淋巴细胞为主,肺泡内间隙多核合胞细胞伴不典型增大的肺细胞(16)。这些发现提示细胞毒性CD8的过度激活+T细胞以及促炎细胞因子的过量产生可能至少部分解释了COVID-19的免疫原性。然而,这些细胞因子的细胞来源(T细胞、树突状细胞或巨噬细胞)仍有待确定。
在SARS-CoV和MERS-CoV感染的背景下,T细胞反应的作用已经被研究过。SARS-CoV和MERS-CoV感染后存活的患者通常比未存活的患者有更好的免疫反应(17)。免疫系统在这两种疾病中都起着重要作用,但受这两种病毒(18)。一项对小鼠SARS-CoV模型的研究表明,CD8的消耗+T细胞在感染时并不影响病毒的复制或清除。然而,CD4的消耗+T细胞导致免疫介导的间质性肺炎增强和sars冠状病毒从肺部清除的延迟,证明了CD4的重要作用+T细胞,而不是CD8细胞+T细胞在原发性sars冠状病毒感染中的作用(19)。中国一项针对sars - cov感染患者的研究表明,肺间质浸润性炎症细胞以CD8为主+在病毒清除和免疫介导的损伤中起重要作用的T细胞(20.)。通过比较T细胞缺陷小鼠和B细胞缺陷小鼠,发现T细胞能够在mers - cov感染的肺部存活并杀死病毒感染的细胞(21)。这些数据强调了T淋巴细胞,CD4的重要性+特别是T细胞,而不是B细胞,在控制和微调SARS-CoV和MERS-CoV感染的发病机制和结果方面。然而,一项针对SARS-CoV感染适应性免疫反应的队列研究显示,尽管总T细胞反应与疾病进展之间没有显著相关性,但疾病严重程度与高水平CD4密切相关+T细胞反应,而不是CD8+记忆T细胞反应(22)。值得注意的是,本研究中评估的免疫反应是在完全康复的患者中;因此,这些反应是否有助于康复或疾病进展尚不清楚(22)。
Chu等人证明MERS-CoV,而非SARS-CoV,可以有效感染外周血和人淋巴器官的T细胞并诱导T细胞凋亡,这涉及激活外源性和内在凋亡途径(23)。这可能部分解释了在中东呼吸综合征冠状病毒感染患者中观察到的淋巴细胞减少(23)。SARS-CoV还能显著降低外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群这与疾病的发病有关(24)。可能涉及几种潜在的机制,包括由病毒感染引发的自身免疫抗体或免疫复合物的发展,直接感染并促进造血干细胞和祖细胞的生长抑制和凋亡。使用糖皮质激素也可能是一些非典型肺炎患者淋巴细胞减少的原因(25)。目前,对SARS-CoV-2感染导致淋巴细胞减少的机制知之甚少。在本研究中,我们不能排除一些淋巴细胞减少症可能因住院期间使用类固醇而加重的可能性。需要进一步研究以确定在COVID-19背景下皮质类固醇对淋巴细胞的影响。
我们的研究有一些局限性。首先,我们主要评估了T细胞亚群和NK细胞的数量及其IFN-γ的产生;这些细胞的功能以及浸润肺间质活化的巨噬细胞和淋巴细胞的作用仍有待阐明。其次,本研究只纳入了少量患者;因此,结果应谨慎解释,统计不显著可能不能排除重度和中度病例之间的差异。第三,由于没有关于SARS-CoV-2病毒的病毒谱数据,需要进一步研究病毒载量动力学与细胞免疫反应动力学之间的相关性。澄清这些问题将有助于进一步解剖复杂的SARS-CoV-2发病机制,对治疗方法和疫苗的开发具有潜在意义。
综上所述,SARS-CoV-2感染引起细胞因子风暴和淋巴细胞减少,特别是CD4下降+和CD8+T细胞计数,以及通过CD4抑制IFN-γ的产生+T细胞,这可能与COVID-19的疾病严重程度有关。深入了解影响SARS-CoV-2感染患者淋巴细胞的因素,特别是T淋巴细胞计数及其与疾病严重程度的关系,对COVID-19的临床管理具有重要意义。
研究参与者
2019年12月下旬至2020年1月27日,同济医院传染病科隔离病房共有21例患者最初出现发热或呼吸道症状,胸部CT扫描显示肺部浸润,经当地卫生部门确诊为SARS-CoV-2感染。4例有华南海鲜市场接触史。
我们对21例COVID-19患者的病史、体格检查以及血液学、生化、放射学、微生物学和免疫学评价结果进行回顾性评价和分析。从电子病历中获得流行病学、临床、实验室和放射学特征和治疗以及结果数据。数据收集表由2名研究人员独立审核。
临床分类及并发症定义
根据中国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗指南(第6版)》(9), COVID-19的临床分类如下:
轻症:临床症状轻,影像学未见肺炎表现。
中度病例:患者有发热、呼吸道症状等症状,影像学可见肺炎表现。
严重病例:出现以下任何一种情况——呼吸窘迫,呼吸频率≥30次/分;热点;2静止≤93%;和PaO2/ FIO2≤300。肺部影像学检查24 ~ 48小时内病变进展大于50%的患者应按重症处理。
危重病例:满足以下任何一种情况-发生呼吸衰竭,需要机械通气,休克,其他器官衰竭并发症,需要在ICU监测和治疗。
急性呼吸窘迫综合征和休克的定义参照世界卫生组织SARS-CoV-2 (26)。
低氧血症定义为PaO2/ FiO2比例小于300。
根据肾病改善全球结局(KDIGO)分类,根据最高血清肌酐水平或尿输出标准确定和分类急性肾损伤。
急性肝损伤定义为黄疸,总胆红素水平为3mg /dL或更高,ALT急性升高至少为正常范围上限的5倍和/或碱性磷酸酶升高至少为正常范围上限的2倍。
如果心脏生物标志物(如肌钙蛋白I)的血清水平高于参考上限的第99个百分位,或在心电图和超声心动图中显示新的异常,则诊断为心脏损伤。
继发性感染包括细菌和真菌感染,如果患者有院内肺炎或菌血症的临床症状或体征,并在入院后48小时或更长时间内从呼吸道标本或血液样本中培养出新的病原体阳性,则诊断为继发性感染。
实验室测量
SARS-CoV-2的实时反转录PCR检测。呼吸道标本由当地疾控中心采集,然后运往指定的权威实验室检测SARS-CoV-2。采用实时反转录(RT-PCR)方法检测呼吸道标本中SARS-CoV-2的存在。采用针对冠状病毒包膜基因的引物和探针,序列为:正向引物5′-TCAGAATGCCAATCTCCCCAAC-3′;反向引物5 ' -AAAGGTCCACCCGATACATTGA-3 ';探针5'CY5-CTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGC-3'BHQ1。扩增条件为50°C 15分钟,95°C 3分钟,95°C 15秒,60°C 30秒45次循环。
临床实验室测量。最初的临床实验室检查包括全血细胞计数、血清生化检查(包括肝肾功能、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和电解质)、凝血检查以及免疫学检查(包括血清细胞因子、外周免疫细胞亚群和免疫细胞表达IFN-γ)。对呼吸道标本(包括鼻咽拭子或痰液)进行检测,以排除其他病毒感染的证据,包括流感、呼吸道合胞病毒、禽流感、副流感和腺病毒。同时进行常规细菌和真菌检查。
细胞因子测量。为了探讨SARS-CoV-2感染对细胞因子分泌的影响,根据制造商的说明,通过化学发光免疫测定(CLIA)在所有患者入院后不久提取的血清样本中评估IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8(也称为CXCL8)、IL-10和TNF-α。IL-1β (LKL11)、IL-2R (LKIP1)、IL-8 (LK8P1)、IL-10 (LKXP1)和TNF-α (LKNF1)的CLIA试剂盒购自DiaSorin。IL-6试剂盒(05109442 190)购自罗氏诊断公司。
外周血免疫指标的评价
NK, CD4的比例和数量+T, CD8+T、Treg和B细胞,以及CD4细胞表面标记物的表达和IFN-γ的表达+T, CD8+对这些实验室确诊的SARS-CoV-2感染患者的T细胞和NK细胞进行了研究。针对人体表面和细胞内分子的流式细胞术抗体是市售的。使用的抗体如下:抗cd28 (CD28.2、PE、555729)、抗cd8 (RPA-T8、PE- cy7、557746)、抗cd45 (2D1、PerCP、347464)、抗hla - dr (G46-6、APC、560744)、抗cd3 (SK7、APC- cy7、557832)、抗cd4 (RPA-T4、V450、560345)、抗cd45ra (HI100、FITC、555488)、抗cd45ro (UCHL1、PE、5618898)、抗cd127 (HIL-7R-M21、PE- cy7、560822)、抗cd45 (2D1、PerCP、347464)、抗cd25 (M-A251、APC、561399)、抗cd3 (SK7、APC- cy7、557832)、抗cd4 (RPA-T4、V450、560345)、抗cd3 (UCHT1、FITC、561806)、抗cd8 (RPA-T8、PE、555367),抗cd56 (B159, PE-Cy7, 557747),抗ifn -γ (4S。抗cd4 (RPA-T4, APC- cy7, 557871)。所有试剂均购自Becton, Dickinson, and Company (BD)。所有样品均采用BD FACSCanto II流式细胞仪检测,并使用BD FACSDiva软件进行分析。
免疫细胞中IFN-γ细胞内染色步骤如下:将GolgiStop (BD Biosciences, 554724)加入细胞培养4小时后,将细胞重悬于FACS缓冲液中进行流式细胞仪抗体染色。外周血单个核细胞在4°C下表面抗体染色30分钟,用FACS缓冲液洗涤,然后在4°C下黑暗中固定/渗透(BD Cytofix/Cytoperm, 554722) 20分钟。固定/渗透的细胞用Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences, 554723)洗涤两次,然后在含有预定最佳浓度的荧光染料偶联抗ifn -γ抗体或适当阴性对照的50 μL Perm/Wash缓冲液中彻底重悬,在4°C黑暗中孵育30分钟。流式细胞术分析前,用Perm/Wash缓冲液洗涤细胞两次,并在FACS缓冲液中重悬。
统计数据
连续变量用中位数(IQR)表示,并与未配对的双侧Student’s进行比较t测试;分类变量以数字(%)表示,并用χ进行比较2也就是中度和重度病例组之间的Fisher精确检验如果双侧α值小于0.05,则认为具有统计学意义。统计学分析采用SPSS (version 19.0, IBM)。
研究批准
本研究按照良好临床实践和赫尔辛基宣言的伦理研究原则进行。本研究方案经华中科技大学(中国武汉)同济医学院同济医院机构审查委员会批准。由于这种传染病的迅速出现,放弃了书面知情同意。
QN和DW设计了研究,对研究中的所有数据有完全的访问权,并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。GC和DW参与了患者招募、数据收集、数据分析、数据解释、文献检索和手稿撰写。WG和YC负责患者招募、数据收集和临床管理。DH、HW、TW、张晓云、HC、HY、张晓云、MZ、SW、JS、TC、MH、SL、XL、JZ在患者管理、实验、数据收集、数据分析、数据解释等方面发挥作用。所有作者都对数据采集、数据分析或数据解释做出了贡献,并审查和批准了手稿的最终版本。GC、DW、WG、YC为第一作者,DH、HW、TW、张晓云为共同第二作者;它们列出的顺序是由工作负载决定的。
我们感谢参与这项研究的所有患者及其家属,以及众多医生、护士和平民共同努力抗击SARS-CoV-2。
利益冲突:作者已声明不存在利益冲突。
资金来源的作用:资金来源支持传染病研究,包括新出现的传染病。
版权:©2020,美国临床研究学会。
参考信息:J临床投资。2020, 130(5): 2620 - 2629。https://doi.org/10.1172/JCI137244。
参见相关评论SARS-CoV-2:风暴正在肆虐。