文摘
西地那非的体外生物转化的主要循环代谢产物,研究了英国- 103320,在人肝微粒体和微粒体包含不同的表达了人类细胞色素。在人肝微粒体,的意思K米(±S.E.)是14.4±2.0μM。屏幕上的化学抑制剂奥美拉唑(10μM)、奎尼丁(10μM), sulfaphenazole(10μM)和酮康唑(2.5μM)只显示检测到与酮康唑抑制。西地那非生物转化(36μM)浓度增加抑制了酮康唑,例如(IC50值小于0.02μM),建立了细胞色素P450 (CYP) 3 a4抑制剂。使用微粒体包含cDNA-expressed细胞色素,英国- 103320形成被发现由四个细胞色素:CYP3A4, 2 c9, 2 c19, 2 d6。估计净内在间隙相对贡献CYP2C9 CYP3A4为79%和20%;CYP2C19和2 d6估计贡献小于2%。这些结果说明CYP3A4是主要的细胞色素调停英国- 103320形成和抑制CYP3A4的药物可能会损害西地那非生物转化。
西地那非(伟哥),cGMP 5型磷酸二酯酶的选择性抑制剂,是一种口服治疗勃起功能障碍(壮族et al ., 1998)。多达3000万人患有某种程度的勃起功能障碍在美国(戈登伯格,1998;卡普兰et al ., 1999)。一份报告显示,1998年8月,西地那非一直以来医药历史上销售最快的药物释放在1998年4月(Nachtsheim 1998),据1998年统计,西地那非是前100名最常用药物之一在美国。最近的临床试验还研究了女性使用西地那非(卡普兰et al ., 1999)。一份报告还发现了非法使用西地那非在英国夜店(奥尔德里奇和Measham, 1999)。鉴于西地那非的广泛使用,可以预期,西地那非将coadministered代理,直接导致性功能障碍或用于治疗疾病与性功能障碍有关。这些包括降压药、抗抑郁药、病毒蛋白酶抑制剂,唑类抗真菌剂。一些案例报告已经推荐使用西地那非药物诱发阳痿(阿什顿和班尼特,1999年;纽伦堡et al ., 1999;罗森博格,1999;夏勒和比哈尔,1999)、性功能障碍的主要原因(Korenman 1998)。因此,西地那非的新陈代谢的理解必须预见并避免重要的药物相互作用。
临床药代动力学数据确定了主要循环代谢产物的形成,英国- 103320,这是一个产品的N -desmethylation (Muirhead et al ., 1996据报道),通过药物的制造商,可能导致大约20%的净西地那非的药理效应。英国- 103320已被确认为西地那非的代谢物老鼠,老鼠,狗和人类(Muirhead et al ., 1996;沃克et al ., 1999)。
产品标签信息表明细胞色素P450 (CYP)的作用1在英国形成3 a4和CYP2C9 - 103320在人类身上。附加报告药物的制造商已经确定了CYP2D6的次要角色以及体内西地那非和强有力的CYP3A4抑制剂酮康唑等之间的互动,例如。然而,除了最近的一项研究在西地那非的交互和病毒蛋白酶抑制剂(快乐et al ., 1999),这些研究的细节并没有广泛应用于医学文献。
本研究检验了西地那非使用人类肝微粒体体外生物转化以及识别特定的细胞色素的作用用化学抑制剂和微粒体包含人类个体表达的细胞色素cDNA-transfected人类lymphoblastoid细胞。
实验程序
材料。
肝脏样本四个人类捐赠者没有已知肝脏疾病得到从肝脏组织采购和分销系统,明尼苏达大学,明尼阿波利斯、锰。样本选择证明高CYP3A活性。微粒体是由差速离心如前所述(冯Moltke et al ., 1993;贝纳et al ., 1997)。微粒体组织在0.1磷酸钾缓冲resuspended含有20%甘油和储存在−80°C到使用。微粒体包含人类个体表达的细胞色素cDNA-transfected人类lymphoblastoid细胞和控制向量(沃本绅士,MA)也存储在−80°C到使用(Crespi, 1995)。
因为纯粹的西地那非的样本没有可用,西地那非提取从商用50片和溶解在甲醇产量最终浓度250μM,为其他基质(如前所述冯Moltke et al ., 1998)。其他化学试剂和材料从商业来源或购买请由制造商提供。参考标准的英国- 103320目前还不清楚。
孵化项目使用人类肝脏微粒体。
不同数量的西地那非从0到250μM被添加到孵化管。甲醇是蒸发在45°C真空烘箱干燥。为了实现底物浓度大于250μM,连续进行了蒸发产生底物浓度范围从0到750μM。孵化样本包含50 mM磷酸盐缓冲剂,MgCl 5毫米2辅酶ii, 0.5毫米+和一个异柠檬酸/ isocitric脱氢酶再生系统。样本preincubated 5到10分钟的37°C。微粒体蛋白(0.05毫克/毫升)被添加到每个反应混合物和样本孵化为20分钟37°C。乙腈的反应是与100年终止μl。20毫升的丁螺环酮(50μM)被添加作为内部标准。样本涡和离心10分钟。上层清液被转移到autosampling瓶进行高效液相色谱分析。所有样品都孵化一式两份。
溶解性研究表明,西地那非是不完全溶于微粒体孵化反应混合物。因此,西地那非含量用于动态分析调整浓度来表示实际的西地那非(范围:0 - 293μM)出现在反应混合物。
样品进行了分析使用30%的流动相乙腈/ 70%磷酸钾缓冲(27.75μM, pH值4.5)1.4毫升/分钟的流量,如前面描述的(库珀et al ., 1997)。分析柱是一个不锈钢30厘米×3.9毫米反相NovaPak C18列(水域Associates米尔福德,MA)和列废水进行了分析使用紫外检测波长230纳米。
识别的英国- 103320西地那非的主要代谢物在孵化混合物是基于外观的主要代谢物定量产品,以及相似的相对保留时间与以前公布的报告参考标准的英国- 103320 (库珀et al ., 1997)。英国的形成- 103320被发现线性时间60分钟和对蛋白质高达0.1毫克/毫升。
孵化项目使用微粒体包含cDNA-Expressed色素。
微粒体的初始屏幕包含一个八cDNA-expressed细胞色素(CYP1A2、2 a6、2 b6, 2 c9, 2 c19 2 d6 2 e1,或3 a4),或一个矢量控制,是由两个西地那非(15到132μM)浓度。孵化项目进行描述的人类肝脏微粒体除了包含cDNA-expressed微粒体酶(1毫克/毫升)被添加在人肝微粒体。完整的动力学曲线随着西地那非含量与微粒体生成包含四种细胞色素(CYP2C9 2 c19 2 d6,或3 a4)。溶解度研究微粒体包含cDNA-expressed矢量控制表明,实际的西地那非集中出现在反应混合物μM范围从0到588。
西地那非生物转化的化学抑制。
一个初始屏幕是用化学抑制剂进行相对特定于CYP2C19(奥美拉唑),2 c9 (sulfaphenazole), 2 d6(奎尼丁),和3 a4(酮康唑)。抑制剂浓度选择,表现出极大的抑制指数相对特异性底物(牛顿et al ., 1995;Ko et al ., 1997)。西地那非(36μM)也添加到孵化管连同sulfaphenazole(0到10μM),奥美拉唑(0到10μM)、奎尼丁(0到10μM),或酮康唑(0或2.5μM)。甲醇是蒸发和孵化项目进行使用人类肝微粒体,如上所述。孵化项目都是在重复进行。
抑制曲线使用人类肝脏微粒体生成的两种药物已知CYP3A4的有力抑制剂。西地那非(36μM)与酮康唑,例如coincubatedμM浓度范围从0到2.5。抑制剂浓度选择基于他们的相对特异性抑制CYP3A4的能力,如前所述(冯Moltke et al ., 1998)。
数据分析。
英国- 103320由人类肝微粒体的形成与Michaelis-Menten动力学与竞争力的底物抑制是相一致的。下面的方程拟合英国- 103320数据点:
形成的英国- 103320 cDNA-expressed酶也适合单一酶Michaelis-Menten模型(CYP2C9和2 c19)或一个酶Michaelis-Menten模型与竞争力底物抑制(CYP3A4)。形成英国- 103320的微粒体包含CYP2D6不能适合Michaelis-Menten动力学。贡献的每一个细胞色素西地那非生物转化是规范化的平均值的相对丰度个人在肝脏细胞色素。CYP2D6 CYP3A4的相对丰度(28.8%)(1.5%),和CYP2C亚型(18.2%)由immunoquantification决定,据岛田et al。(1994);的相对丰度CYP2C亚型是分为相对大量的CYP2C9(14.7%)和CYP2C19(3.5%)使用相对活动因素(Venkatakrishnan et al ., 1998)。内在间隙归因于CYP3A4, CYP2C9和CYP2C19乘以每个细胞色素的相对丰度在肝脏。个人的内在间隙细胞色素的比例相对于整体的贡献三个细胞色素(CYP2C9、2 c19和3 a4)计算。
抑制剂非线性回归分析的数据来确定估计最大程度的抑制(E马克斯)和集成电路50代表所产生的抑制剂浓度的减少代谢物形成的50%控制价值没有抑制作用,如前所述(冯Moltke et al ., 1998)。
结果
代表色谱体外的西地那非生物转化图所示。1。英国- 103320形成在肝微粒体符合single-enzyme Michaelis-Menten动力学与竞争力底物抑制(无花果。2)。估计K米和K年代值如表所示1。
![图1](https://dmd.aspetjournals.org/content/dmd/28/4/392/F1.medium.gif)
色谱从微粒体孵化示范色谱峰对应于英国- 103320,丁螺环酮(内部标准)和西地那非。
![图2](https://dmd.aspetjournals.org/content/dmd/28/4/392/F2.medium.gif)
形成的英国- 103320浓度增加与西地那非在四人肝微粒体的准备。
代谢物形成率(轴)表达相对单位指示色谱峰高比率。线表示函数基于single-enzyme Michaelis-Menten模型没有竞争力的底物抑制。
屏幕使用微粒体包含cDNA-expressed细胞色素CYP2C9的可能角色,2 c19,英国2 d6, 3 a4 - 103320形成。英国的形成- 103320使用微粒体包含CYP2C9或2 c19符合single-enzyme Michaelis-Menten动力学,而代谢物形成使用含有CYP3A4的微粒体符合single-enzyme Michaelis-Menten动力学与竞争力底物抑制(无花果。3)。英国- 103320使用含有CYP2D6的微粒体的形成不能适合Michaelis-Menten动力学。然而,由于CYP2D6只占总数的很小一部分肝脏细胞色素含量(1.5%;岛田et al ., 1994),它不太可能在西地那非生物转化中发挥重要作用。估计K米,K年代,相对V马克斯和相对内在间隙(V马克斯/K米为CYP2C9)值,2 c19, 3 a4如表所示1。贡献的这些细胞色素测定正常化后预测每个细胞色素(表的相对丰度1)。归一化相对丰富的细胞色素确认CYP3A4的主导作用。CYP2C9部分有助于英国- 103320阵型,但CYP2C19和2 d6只是小角色。
英国- 103320形成四个cDNA-expressed细胞色素:CYP2C9, 2 c19, 2 d6, 3 a4。
代谢物形成率(y设在)表达相对单位说明色谱峰高比率。线表示函数基于一个single-enzyme Michaelis-Menten模型与竞争力底物抑制(CYP3A4)或无底物抑制(CYP2C9和2 c19)。数据点对CYP2D6不能适合Michaelis-Menten动力学。
化学抑制剂的初始屏幕(奎尼丁、奥美拉唑、酮康唑和sulfaphenazole)使用人类肝脏微粒体证明只有产生可检测的酮康唑抑制的英国- 103320形成(图。4)。例如和酮康唑生产几乎完全抑制英国在36 - 103320形成μM西地那非。的意思是集成电路50价值观:例如μM 0.010±0.006, 0.019±0.004μM酮康唑(无花果。5)。
![图4](https://dmd.aspetjournals.org/content/dmd/28/4/392/F4.medium.gif)
西地那非抑制生物转化在人类肝微粒体由四个化学抑制剂:sulfaphenazole,酮康唑、奎尼丁、奥美拉唑。
反应速度是表示为控制速度的一小部分没有抑制剂。误差线代表±S.E.
![图5](https://dmd.aspetjournals.org/content/dmd/28/4/392/F5.medium.gif)
酮康唑的影响,例如西地那非生物转化在四人肝微粒体的准备。
意思是集成电路50值是0.01μM例如和0.02μM酮康唑。
讨论
使用含有淋巴母细胞的微粒体cDNA-expressed细胞色素,我们证明了英国- 103320形成是由至少四个细胞色素:CYP3A4, 2 c9, 2 c19, 2 d6。然而,西地那非主要是由CYP3A4代谢。CYP3A4的主要作用是显而易见的,当每个细胞色素规范化的贡献他们的相对丰度在肝脏。的意思是K米英国- 103320形成在肝微粒体(14.4μM)是相似的K米值103320年英国形成的微粒体表达CYP3A4(23.1μM)。这进一步支持英国- 103320形成CYP3A4的角色。
化学抑制剂的研究也支持CYP3A4的作用形成的英国- 103320。酮康唑(CYP3A4抑制剂)强有力地抑制英国- 103320阵型,而sulfaphenazole (CYP2C9抑制剂),奥美拉唑(CYP2C19抑制剂)和奎尼丁CYP2D6(抑制剂)不产生可检测代谢物形成的抑制作用。化验使用微粒体包含cDNA-expressed细胞色素表明CYP2C9可能参与西地那非的新陈代谢。然而,CYP2C9的贡献似乎没有定量大到足以让sulfaphenazole产生可检测的抑制在人类肝脏微粒体。无论是CYP2C19还是2 d6似乎发挥重要作用在体外形成的英国- 103320。例如一种病毒蛋白酶抑制剂,也强烈抑制CYP3A,受损的西地那非生物转化与酮康唑类似效力。的意思是集成电路50价值发现例如(0.01μM)符合最近报道(快乐et al ., 1999)。
由于高频勃起功能障碍在美国(Nachtsheim 1998;罗森,1998),以及各种疾病的可能角色或药理学药剂在性功能障碍的发病机制(Korenman 1998;马丁内斯et al ., 1999),西地那非可能coadministered与其他药物。西地那非已经推荐来抵消药物引起的勃起功能障碍,性功能障碍的主要原因(阿什顿和班尼特,1999年;纽伦堡et al ., 1999;罗森博格,1999;夏勒和比哈尔,1999)。因此,重要的是要理解潜在的药物相互作用与西地那非。
此外,在艾滋病患者阳痿,西地那非可能例注射治疗优势,由于合作伙伴的风险降低接触被感染的血液(Nandwani古尔利,1999年)。这使用西地那非可能招致一个可能是临床上重要的药物相互作用与高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)由于CYP3A4的强有力的抑制蛋白酶抑制剂,如例如和非核苷逆转录酶抑制剂如delavirdine和依法韦伦。在美国,西地那非的修订标记的可能性,包括警告可能的药物相互作用的蛋白酶抑制剂amprenavir讨论在医学出版社。在欧洲,西地那非的制造商已同意更改标签包括例如警告使用西地那非。在欧洲,这些警告将扩展到包括其他蛋白酶抑制剂。
共同服用西地那非和CYP3A4的抑制剂可能会导致增加西地那非的血浆浓度。反过来,这可能导致不良反应的增加通常与西地那非有关,如头痛、冲洗,消化不良,视觉变化(Montorsi et al ., 1999)。根据一项双盲,随机,安慰剂对照,固定剂量514人的研究中,任何造成的负面影响相对频繁的在72%在接受100毫克剂量的病人中33%的病人接受安慰剂(Montorsi et al ., 1999)。尽管如此,95%的副作用被认为是自然界中轻度至中度。大部分的这些反应的发生似乎剂量相关。所述体外研究符合临床研究表明共同服用西地那非的蛋白酶抑制剂,抑制CYP3A4不同程度,可能导致增加等离子体水平的西地那非(快乐et al ., 1999)。
脚注
再版请求发送到:David j .格林布拉特,药理学和实验治疗学称,塔夫茨大学医学院的哈里森大街136号,02111年波士顿。电子邮件:DJ.Greenblatt在}{tufts.edu
这项工作被授予MH34223支持部分,MH01237, RR00054卫生和人类服务部。
- 缩写词使用::
- CYP
- 细胞色素P450酶,
- K 米
- 底物浓度对应于50%V马克斯
- K 年代
- 没有竞争力的底物抑制常数
-
- 收到了1999年8月20日。
- 接受1999年12月17日。
- 美国社会的药理学和实验性疗法