文摘
淋巴滤泡的肺实质特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。有报道称,改变CD4 t调节细胞数量在COPD的肺,但这些细胞的位置在COPD肺组织特定的毛囊没有被调查。
CD4细胞的存在+FOXP3+手术切除肺组织t调节细胞评估从12 COPD患者,11吸烟者与正常肺功能和7个非吸烟者结合免疫荧光和免疫组织化学。
有组织的淋巴滤泡被观察到在所有三组的患者,以及淋巴集群缺乏组织。t调节细胞的CD4细胞百分比显著增加(p = 0.02)在慢性阻塞性肺病(16%)毛囊与吸烟者(10%)和不吸烟者相比(8%)。相比之下,没有变化(p > 0.05)在集群或t调节细胞的百分比之间的subepithelium组。
在慢性阻塞性肺病患者增加了t调节细胞淋巴滤泡。因此,慢性阻塞性肺病淋巴滤泡内t调节活动可能被改变。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是进步的气道炎症。改变适应性免疫被认为扮演一个角色在这种疾病的病理生理学,CD8都有所增加+t淋巴细胞和B淋巴细胞数量在慢性阻塞性肺病患者的气道与控制1- - - - - -3,这些细胞的数量也与疾病严重程度增加1,4。它提出了慢性阻塞性肺病有自身免疫性组件5,6,但抗原刺激淋巴细胞激活负责还不清楚。可能性包括病原体驻留在航空公司,如病毒或细菌,或吸烟改变自我抗原的表达,包括弹性蛋白4,6。COPD患者肺淋巴细胞活动的规定并不完全理解。
调控t细胞CD4细胞的一个子集,通过抑制分子的释放抑制激活淋巴细胞,如白介素(IL) -10和转化生长因子(TGF) -β,或通过细胞间接触机制7,8。具体的一员forkhead或有翼的螺旋家族转录因子被认为是t调节细胞的发育和功能的必要条件9,10,被认为是最具体的可用标记t调节细胞11,12。
t调节标记包括FOXP3被用来表明吸烟者支气管肺泡灌洗液中t调节细胞的数量增加13,14与非吸烟者相比。之一,这些研究还显示t调节数字减少慢性阻塞性肺病患者相比,吸烟者肺功能正常,建议减少t调节功能在慢性阻塞性肺病。t调节细胞数量也被报道在分散的肺组织淋巴细胞减少肺气肿患者控制相比,与整个组织FOXP3 mRNA水平降低和il - 10生产,进一步支持这一概念,t调节功能是减少慢性阻塞性肺病患者6。
淋巴细胞组织网站吸引的炎症可以形成组织结构称为三级淋巴滤泡。这些都是在肠道和关节等组织报道15,16,也被观察到在COPD患者的肺实质4,17。这些毛囊核心与外围t细胞b细胞17。树突细胞也存在于这些毛囊,表明这些结构是一个网站为慢性淋巴细胞抗原表达17。有人建议,树突细胞参与COPD毛囊内异常的免疫反应18。据我们所知,t调节细胞肺淋巴滤泡在慢性阻塞性肺病患者先前没有被研究。
我们研究了t调节细胞数量在中度COPD患者的肺实质,专注于淋巴滤泡。我们假定的实质t调节细胞数量会改变COPD患者与正常对照组相比。使用双重荧光免疫细胞化学我们描述了CD4细胞的特定位置+FOXP3+慢性阻塞性肺病患者的肺实质内t调节细胞。
材料和方法
研究对象
总共30个病人接受手术切除为疑似或确诊肺癌(表1⇓)招募了。慢性阻塞性肺病的诊断是基于历史的吸烟≥10 pack-yrs,典型症状(排痰性咳嗽、呼吸困难、喘息)和气流阻塞,定义为用力呼气量在1 s (FEV1)< 80%的预测,FEV1/用力肺活量(FVC)比< 0.7。这些病人都是中度慢性阻塞性肺病(全球倡议慢性阻塞性肺疾病(黄金)第二阶段)。Non-COPD病人被归类为吸烟者和非吸烟者,其中包括烟pack-yr≤1年的历史。所有科目给书面知情同意。这项研究是由当地研究伦理委员会批准(南曼彻斯特研究伦理委员会)。
组织采样和处理
两个组织块是来自邻近地区获得相同的肺,尽可能远远端肿瘤,然后福尔马林固定,石蜡包埋。对于每一个病人,都组织块是免疫组织化学染色分析。主要的抗体使用如下:CD3(克隆PS1, Novocastra、纽卡斯尔、英国),CD4(克隆IF6, Novocastra) CD8(克隆C8/144B, Dako斯特鲁普,德国),CD20 (L26,向量实验室)、CD62L(克隆9类推,Novocastra)和FOXP3 (Ab10563 Abcam,剑桥,英国)。
肺组织切成4-µm部分和解除到polysine镀膜玻璃幻灯片。热诱导抗原决定基检索后Tris-EDTA缓冲pH值8(10毫米三基地,1毫米EDTA, 0.5%渐变20)肺部分微波了20分钟在800 W。主要抗体稀释1.5%正常血清(向量实验室,彼得伯勒、英国)是应用在一夜之间在4°C。内源性过氧化物酶就熄了孵化部分3% H2O2在室温下甲醇为30分钟。发现FOXP3使用生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白G (Ig)二级抗体(向量实验室)与一个avidin-biotin过氧化物酶复杂的(向量实验室)和diaminobenzidine衬底。部分与梅尔的苏木精复染色(σ,普尔,英国)。遗漏的初级抗体染色协议和替换的初级抗体同形像控制抗体(向量实验室)被用作消极的控制。
结合免疫荧光和免疫组织化学
部分与Tris-EDTA缓冲预处理的pH值8如上所述,阻塞正常山羊血清培养在鼠标反CD4 (1:10;Novocastra)或鼠标反CD62L (1:50;Novocastra)一夜之间在4°C。后检测使用Alexa 568共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(1:200;表达载体,佩斯利,英国)部分清洗和孵化兔子反FOXP3 (1:800;Abcam)一夜之间在4°C和检测到所述。部分被孵化在4′,6-diamidino-2-phenylindole(英杰公司)作为荧光核复染色。省略一个或其他主要抗体,或两者兼而有之,进行并行部分提供控制。
图像分析
CD4细胞的数量+FOXP3+t调节细胞在炎症性毛囊和集群计算,和牙龈层内的小型航空公司;航空公司缺乏软骨和腺组织和内部周边< 6毫米。获得双标签图片,明亮的字段和荧光图像相同的字段被抓获和数字来确定CD4合并+FOXP3+细胞。Eclipse使用尼康数码显微图得到80年我显微镜(尼康英国有限公司、萨里、英国)配有打印大师数码相机(英国媒体控制论,马洛)和ImagePro + 5.1软件(媒体控制论)。量化的个体细胞计数,卵泡大小和长度的气管腔的周边进行了使用ImagePro + 5.1软件。CD4细胞与小航空公司在一个面积100µm牙龈。细胞计数计算和标准化的阳性细胞的数量·毫米−2感兴趣的领域(集群,滤泡或subepithelia)。
统计分析
数据不是正态分布,因此三方使用非参数方差分析比较组进行。由方差分析发现显著差异,定义为p < 0.05,随后Mann-Whitney U-tests为双向进行比较。分析使用GraphPad InStat version 3.06 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。
结果
三级淋巴分布结构
三级淋巴滤泡中观察到每个病人的样本组。毛囊检测与气道壁(图1⇓),也是肺实质内孤立的结构(图1 b⇓),如前所述4,17。这些毛囊组织组成的稠密的人口的细胞排列成同心层(图1氟⇓)。毛囊有大型CD20+b细胞CD3的核心与外层+,t细胞CD4细胞组成+和CD8+细胞。炎症集群没有组织结构也观察到(图1 g⇓和h)。在集群中,t细胞数量不再只关联到一个分布式或分散在外层也。大多数卵泡(89.4%;76 85)和集群(86.4%;38的44岁)被发现在肺实质内,其余相关航空公司(表2⇓)。
代表图像的免疫组织化学分析三级淋巴滤泡和炎症的炎性细胞组件集群,在4-µm厚部分人类的肺部组织。免疫组织化学分析进行串行部分识别存在的t细胞,b细胞和巨噬细胞。)苏木精和伊红染色来说明一个典型的淋巴滤泡与小气道和b)薄壁组织的淋巴滤泡。c) 3、3′-diaminobenzidine CD20的检测(布朗)+b细胞(anti-CD20克隆L26)形成一个核心。d) CD3+t细胞(anti-CD3克隆PS1), e) CD4细胞+t细胞(anti-CD4克隆IF6)和f) CD8+t细胞(anti-CD8克隆C8/144B)卵泡的外围。炎症集群观察似乎不如毛囊组织,但也由g)的t细胞和b细胞h)。所有的部分都与迈耶的苏木精复染色(蓝色)。f)酒吧= 50µm规模;酒吧= 30µm g和h)规模。
在60个样本30科目(即。慢性阻塞性肺病,吸烟者和非吸烟者的总和)数值增加观察每个样本的毛囊数量在COPD患者中,有意义的趋势(p = 0.068)。数量没有显著差异之间的集群组(p = 0.11)。
CD4细胞分布
方差分析分析显示慢性阻塞性肺病之间的显著差异,吸烟者和非吸烟者在CD4的数量+细胞在毛囊(p = 0.004)。Mann-Whitney U-tests表明,CD4细胞的数量+细胞在慢性阻塞性肺病增加毛囊(平均4390毫米−2)相比,吸烟者(中位数3370细胞·毫米−2;p = 0.0009)。尽管数值之间的差异也观察到CD4的数量+t细胞在慢性阻塞性肺病和不吸烟者毛囊,这些没有统计学意义(p = 0.1)。
方差分析分析显示慢性阻塞性肺病之间的显著差异,吸烟者和非吸烟者在CD4的数量+细胞subepithelia (p = 0.02;表3⇓)。随后Mann-Whitney紫外线测试分析表明CD4的增加+t细胞在慢性阻塞性肺病subepithelia(平均448个细胞·毫米−2)相比,吸烟者(中位数200细胞·毫米−2;p = 0.015)和非吸烟者(平均260个细胞·毫米−2;p = 0.04),但没有吸烟者和非吸烟者之间的差别(p > 0.05)。
慢性阻塞性肺病方差分析分析显示没有区别,吸烟者和非吸烟者在CD4的数量+细胞集群。
CD4+FOXP3+t调节细胞
CD4+FOXP3+t调节细胞主要是观察炎性毛囊周围(图2⇓集群内),而t调节细胞分散在观察。CD4的绝对数量+FOXP3+在牙龈层细胞较低的小航空公司(图2 a - c⇓和表3⇑)。FOXP3观察免疫反应性与细胞核。所有FOXP3+确认也CD4细胞+。CD8+FOXP3+细胞并不确定(图2 f⇓)。没有观察到当FOXP3免疫反应产物主要抗体是省略的协议,或与一个同形像控制取代抗体,在相邻的串行部分(图2 g⇓和h)。
代表图像的双重CD4免疫组织化学和免疫荧光检测+FOXP+t调节细胞内人类的肺部组织。细胞核与f) 4, 6-diamidino-2-phenylindole复染色(蓝色污点)或g和h)梅尔的苏木精(蓝着色)。一)CD4+细胞被发现使用一个alexa - 488共轭山羊anti-mouse二级抗体(红染色)和具体+细胞被发现使用3、3′-diaminobenzidine后间接免疫组织化学(棕色污点)。b)增加高亮区域的放大(a)展示了不同的核染色FOXP3(棕色污点)也CD4细胞+(红色污点,由箭头表示)。单个CD4 c)+FOXP3+细胞(箭头)检测到在一个气道黏膜下层。d) CD4+FOXP3+在人口的CD4细胞检测+FOXP3- - - - - -肺泡隔内t细胞。e)表达丰富的淋巴滤泡在一些CD62L CD62L+FOXP3+细胞(箭头所指)。f) Sub-epithelial FOXP3+靠近CD8细胞(箭头)+FOXP3−细胞(红色污点)。g) FOXP3+细胞在炎症病灶发现。h)代替anti-FOXP3主要抗体同形像控制抗体在毗邻的连续切片导致没有免疫反应性被发现在相应的区域。1)酒吧= 50µm规模;g和h) = 25µm规模酒吧。a、c、d和e)绿色/黄色荧光是由于内在荧光组织组件(弹性纤维和红细胞)。自体荧光是由形成有别于积极荧光复合图像的红色,绿色和蓝色通道。自体荧光是可见的在所有三个频道,结果出现的融合三种颜色,而积极的荧光是可见的只有一个通道和显示为纯色(红色)。
有t调节细胞数量增加毛囊的COPD患者与毛囊在吸烟者和非吸烟者相比,是否表示为总数的百分比CD4细胞(表3所示⇑)。Mann-Whitney U-tests表明,CD4细胞的百分比+FOXP3+从慢性阻塞性肺病(中位数160细胞细胞在毛囊·毫米−2)相比显著增加了吸烟者(平均100个细胞·毫米−2;p = 0.032)和非吸烟者(平均80个细胞·毫米−2;p = 0.027)。吸烟者和非吸烟者毛囊没有差异(p = 0.36)。
没有明显差异在集群或t调节细胞数量之间的subepithelium组,是否表示为总数的百分比CD4细胞(表3所示⇑)。
在COPD患者中,FOXP3的CD4总人口的百分比+在毛囊而显著增加集群或subepithelium(表3⇑)。在吸烟者和非吸烟者没有差异FOXP3 CD4人口总数的百分比+在毛囊之间,集群和subepithelium(表3所示⇑)。
CD62L表达式由t调节细胞
以决定是否CD4+FOXP3+t调节细胞表达次级淋巴tissue-homing受体CD62L,双标签CD62L和FOXP3的表达进行每个病人一个块(图2 e⇑)。CD62L的比例之间没有明显差异+FOXP3+细胞之间的组(p = 0.68)。中位数(范围)47(6 - 75)%,42(22-50)%和46对慢性阻塞性肺病(4 - 75)%,分别吸烟者和非吸烟者。
讨论
这是第一个研究量化和描述CD4的本地化+FOXP3+t调节细胞内人类肺实质的慢性阻塞性肺病患者。先前的研究特征t调节细胞从支气管肺泡灌洗液(BALF),分散的肺细胞和外周血6,13,14。主要的发现是,CD4+FOXP3+t调节细胞在炎症显著增加毛囊吸烟者和非吸烟者相比,中度COPD患者肺功能正常。
我们观察到炎性淋巴聚集出现无序结构(称为集群)在慢性阻塞性肺病的肺部组织。同样,松散、肠道炎症可能代表描述了未成熟卵泡的集群19。我们假定,炎症集群观察到在我们的研究中也反映了不成熟或早期三级淋巴滤泡。
有更高比例的t调节细胞内毛囊的COPD患者相比,吸烟者和非吸烟者。然而,在集群和subepithelia t调节细胞的比例没有区别之间的组织。已经提出,树突细胞在慢性阻塞性肺病卵泡未能适当诱导t细胞反应,而是主要诱发CD8+t细胞增殖18。这些CD8细胞退出毛囊和积累在航空公司和实质18。因此,局部免疫微环境在慢性阻塞性肺病毛囊似乎涉及多种细胞类型,和我们的观测还表明t调节细胞内微环境的作用。我们推测,增加t调节细胞数量出现在慢性阻塞性肺病卵泡抑制树突状细胞之间的相互作用,导致CD8 t细胞增殖。这个假设应进一步研究。
最近的研究也称t调节细胞的三级淋巴滤泡内风湿性关节炎患者15,在粘膜活检患者的炎症性肠病16。随着卵泡b细胞核心,有人建议,具体+t调节细胞可以直接调节b细胞活动20.。我们推测,另一个可能的慢性阻塞性肺病t调节细胞淋巴滤泡的作用是抑制b细胞活化。
我们研究了t调节细胞的数量在肺组织内,并还需要进一步的研究来解决这些细胞的功能,如调节细胞因子il - 10的表达和TGF-β。据报道,il - 10在COPD患者肺组织减少,生产减少t调节活动的暗示6。虽然我们观察t调节细胞在慢性阻塞性肺病淋巴滤泡,增加其功能能力是否保存是一个关键问题。
之前的研究表明,吸烟者数量增加的BALF t调节细胞与非吸烟者相比。有证据表明从一项研究中,但不是在自己进行的一项研究中,慢性阻塞性肺病患者减少了t调节细胞数量相比,吸烟者肺功能正常。使用分散在不同研究肺淋巴细胞,t调节细胞的数量减少肺气肿患者相比,吸烟者和非吸烟者的混合对照组。相比之下,我们当前的观测表明慢性阻塞性肺病患者的t调节细胞数量增加。研究之间的差异可能是由于这样的事实,我们专门研究淋巴滤泡,对比研究采样气道腔灌洗。细胞在这些不同的隔间可能有不同的特点。先前的研究已经CD4CD25high表达式使用流式细胞仪作为评价的主要方法t调节细胞数量。然而,众所周知,一些CD4CD25high细胞被激活,而不是监管淋巴细胞,而最好的调控t细胞的标志是用在当前的研究中,即具体。
FOXP3+t调节细胞已经被归类为次级淋巴归航t细胞或归航FOXP3 nonlymphoid组织+t细胞20.,21。微分贩卖受体的表达,包括CD62L,被用来区分淋巴t调节细胞归巢21。t调节细胞在毛囊和集群在当前的研究中表示CD62L,表明t调节细胞招聘类似于次要的淋巴结21,22。慢性阻塞性肺病的存在并没有改变CD62L的表达,表明t调节细胞在慢性阻塞性肺病卵泡数量的增加并不是由于这个贩卖受体的表达。
只有∼FOXP3的50%+t调节细胞CD62L+,可能是因为对淋巴细胞趋化因子受体切换发生在迁移到淋巴器官21。毛囊内抗原表达可能导致二次开关使淋巴细胞趋化因子受体有效地迁移到nonlymphoid组织23。我们发现只有50%的调控t细胞表达CD62L可能是由于趋化因子受体切换。
本研究的主要目的是分析t调节细胞在毛囊数量。我们也收集数据样本的毛囊数量COPD患者和控制。我们确定了毛囊与小航空公司如前所述4,17,以及毛囊内的肺实质如前所述17。然而,这不是我们的目的,进一步研究卵泡数量群体之间的差异,因为这已经被广泛报道在别处使用样本大小比当前的研究4,17。此外,我们只包括中度COPD患者,先前的研究包括一个更大范围的病人包括严重的(黄金阶段3)和非常严重(黄金阶段4)患者。这是重要的豪格et al。4表明出现了一个急剧增加的毛囊数量严重和非常严重的慢性阻塞性肺病患者。牢记的局限性方面目前的研究范围的疾病,很明显,我们的研究没有通知我们任何小说卵泡患病率。我们会强调我们没有着手调查。
先前的研究显示卵泡数量的增加吸烟者与不吸烟者相比24吸烟者和轻度到中度慢性阻塞性肺病,但没有区别4,25。我们的研究显示,t调节细胞数量的增加在毛囊中度COPD与吸烟者相比。我们推测,这是一个指标的免疫活动增加毛囊内包含树突细胞抗原呈递的中度COPD患者,CD8细胞和大量的b细胞。有人提出,慢性阻塞性肺病有自身免疫性组件5,6,所以在中度COPD t调节活动的增加可能会试图控制自身免疫。严重慢性阻塞性肺病的进展,与毛囊的数量急剧增加4从监管机制的失败,可能出现抑制自身免疫。
参与本研究的受试者接受调查疑似肺癌。我们不能完全排除任何影响肺癌可能有结果。然而,我们的观察,> 80%的三级淋巴滤泡分布在肺实质而不是支气管相关淋巴组织依照最近的一项研究中,使用非癌变从肺减容手术肺组织和肺移植患者17。
总之,我们观察到的比例增加t调节细胞内实质中度COPD患者的毛囊。t调节细胞在正常情况下调控持续的免疫反应,防止自身免疫。改变函数或数量的这些T调节细胞可能与免疫调节的变化有关。慢性阻塞性肺病淋巴滤泡内t调节细胞的确切作用需要进一步关注。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2008年7月3日。
- 接受2009年1月20日。
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