文摘
粘液生产过剩是典型的囊性纤维化(CF)呼吸道疾病。人类calcium-activated氯通道,hCLCA1,据报道,调节了白介素(IL) 9和调节黏蛋白的表达。因此,IL高9的表达IL 9受体(IL量9 r)和肺之间的hCLCA1 CF患者和健康对照组比较。
支气管粘膜的内镜活检样本从10 CF患者和6个对照组与周期性acid-Schiff染色。IL高9 IL 9 r和hCLCA1表达式是由免疫细胞化学。hCLCA1 mRNA的表达也决定了原位杂交。
目前的研究发现显著增加IL高9 IL 9 r和hCLCA1免疫反应性,hCLCA1 mRNA表达,和数字的食用细胞粘膜的CF患者与对照组相比。地理之间的正相关性被发现IL 9 r阳性细胞与IL量9阳性细胞和hCLCA1-positive细胞,并与hCLCA1-positive PAS-positive细胞间细胞和IL 9 r检测阳性的细胞。hCLCA1 mRNA的表达与IL colocalised 9 r表达和PAS-positive在上皮细胞染色。
增加表达白介素9和白介素9应承担的受体,以及人类的upregulation calcium-activated氯通道,hCLCA1,食用上皮的囊性纤维化患者,支持假设白介素9生产过剩导致粘液囊性纤维化应承担的呼吸道疾病。
这项工作得到了Genaera公司和加拿大卫生研究院的研究中,加拿大。惠普霍伯的接受者的资助Christiane-Herzog Stiftung。
粘液生产过剩的一个特点是囊性纤维化肺病(CF)。先前的报道表明,嗜中性粒细胞弹性蛋白酶是一个强有力的黏液促分泌素1,2和脂多糖的铜绿假单胞菌可以直接粘蛋白基因的诱导upregulation MUC2吗3,4。相反,细菌等金黄色葡萄球菌5和P。绿脓杆菌6能够绑定到黏蛋白。因此,粘液生产过剩和细菌感染可以相互支持。然而,CF粘液分泌过多的发病机制尚未完全阐明。
最近,细胞因子,如白介素(IL)》9日报道,粘液分泌过多的发病机制中发挥重要作用在各种肺部疾病。淋巴细胞产生的细胞因子,高9牵连和粘液分泌过多在哮喘气道高反应的发病机制7- - - - - -10。它扮演着主导的角色在MUC2和MUC5AC生产过剩在体外和在活的有机体内8,9,发现移植calcium-activated氯通道在航空公司(CLCA)10。小鼠mCLCA3表达IL高9转基因老鼠在肺的肺和气管内的IL 9灌注物控制老鼠的显著增加mCLCA3表达式10。随后,异位表达mCLCA3或人力同系物hCLCA1人类粘液表皮样细胞系NCI H292 upregulation MUC5AC的结果11。人类calcium-activated氯通道hCLCA1已被证明是在支气管上皮粘液生产密切相关的哮喘患者12。此外,增加表达hCLCA1最近被证明在鼻腔和鼻窦粘膜的CF患者13。因此,在CF, hCLCA1可能贡献至少部分粘液生产过剩,类似于它在哮喘中的作用。
在目前的研究中,作者试图研究IL高9的表达IL高9受体(IL量9 r)和hCLCA1支气管粘膜的CF患者与正常对照组相比,并展示他们与粘液生产的关系。当前提出CF患者的支气管上皮粘液分泌过多的表达增加有关IL高9 IL必经9 r, hCLCA1。
方法
受试者的特征
本研究所有参与机构的伦理委员会批准。支气管粘膜的内镜活检样本取自10 CF患者和6名健康对照组。每个病人和控制有三到四个粘膜活检从subcarinae低叶或叶。特点为病人和对照组列于表1⇓。CF患者在病情稳定的恶化(免费≥6个月)没有任何恶化的迹象的时候活组织检查。七个CF患者慢性感染P。绿脓杆菌。患者接受吸入抗生素、β2高受体激动剂在胰酶替代和维生素。没有患者接受静脉注射抗生素的活检。所有的病人和对照组不吸烟者。
组织准备
免疫细胞化学,活检标本立即snap-frozen异戊烷在液态氮冷却。为原位杂交(ISH),立即活检标本固定在4%多聚甲醛/ PBS 2 h,洗了三次PBS /蔗糖15%,嵌入在最佳切削温度(美国CA Tissue-Tek,樱花Finetek)然后snap-frozen异戊烷在液态氮冷却。低温恒温器部分10µm厚被削减到0.1% poly-l-lysine-coated幻灯片,一夜之间在烤箱烤37°C,然后储存在−80°C,直到进一步的使用。
调查准备
硫35的35)贴上互补的RNA探针hCLCA1信使RNA编码是准备从cDNA如前所述14。短暂,互补dna插入表达向量,使直线化和转录在体外在存在的年代35utp, T7和SP6聚合酶在两个方向都反义(互补)和探测器(mRNA相同)。
原位杂交
部分支气管组织处理的伊什识别hCLCA1 mRNA如前所述13。简而言之,permeabilisation之后,部分prehybridised 50%甲酰胺在2×15分钟的标准柠檬酸钠在37°C。杂交是一夜之间在42°C与适当的杂交混合物的年代35标签或反义探针(0.75×106cpm·幻灯片−1)。Post-hybridisation涉及一系列的洗,执行与降低浓度的柠檬酸saline-sodium缓冲42°C。样本与核糖核酸酶解20分钟洗42°C到删除任何的RNA探针。与标准的放射自显影法检测杂交信号。所有实验都是一式三份。
组织化学和免疫组织化学
支气管部分与4%多聚甲醛固定,然后沾周期性acid-Schiff (PAS)来识别粘液glycoconjugates和食用的杯状细胞。检测t细胞,中性粒细胞,高9 IL高9 r和hCLCA1疣状进行使用的碱性phosphatase-anti-alkaline磷酸酶(APAAP)技术如前所述15。使用的抗体是anti-CD3 (pan早期;米西索加,Dako,加拿大),anti-elastase(中性粒细胞;Dako),反检测IL量9(研发系统,明尼阿波利斯,美国),anti-IL-9R(研发系统)和anti-hCLCA1(礼物Genaera公司,普利茅斯会议上,PA,美国)。短暂,部分被孵化主要抗体在4°C一夜之间,洗,然后接受兔子兔子anti-mouse抗体或抗体抗体(IL 9)应承担的30分钟,在室温下。antibody-antigen复杂开发与APAAP复杂或biotin-streptavidin复杂(IL必经9)和快速红(σ化学公司,Weinham,德国)。至少两张幻灯片被染色为每一个标记每个病人和控制。
结合原位杂交和histochemistry-immunocytochemistry
研究hCLCA1表达式之间的关系和IL 9 r,放射性标记cRNA调查地理编码与IL hCLCA1 mRNA 9 r抗体同时应用,如前所述14。的colocalisation hCLCA1食用细胞,部分是先用PAS染色,随后杂交和S35标记探针hCLCA1编码。所有的实验都是在重复完成。
量化
所有幻灯片都读蒙蔽(编码)和阳性细胞数。上皮细胞(≥200个细胞)计数和细胞PAS染色阳性,阳性细胞IL必经9 r或hCLCA1,和那些hCLCA1信使rna阳性信号分别表示为一个百分比的上皮细胞。IL高9检测CD3所致,elastase-immunoreactive细胞黏膜下层被表达为阳性细胞的数量·毫米2黏膜下层。每个幻灯片数由两名有经验的观察者。重复措施的within-observer变异系数< 5%。
统计分析
细胞的数量的差异表达hCLCA1 IL高9和IL 9 r以及染色粘蛋白(PAS),与非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。随后分析了统计上的显著差异组与Mann-Whitney紫外线测试。从皮尔森相关系数计算力矩系数,修正为多个比较使用Bonferroni校正因子。结果表示为±sem和p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
中性粒细胞和t细胞在支气管粘膜的病人和控制
CF患者表现出更高的中性粒细胞数量支气管粘膜(140.4±29.0毫米2)相比,对照组(32.0±10.1毫米2;p < 0.05)。CF患者的淋巴细胞)的数量(263.0±42.9毫米2)相比没有明显高于对照组(153.0±20.4毫米2;p > 0.05)。
表达IL高9 IL高9 r和hCLCA1和周期性acid-Schiff染色
免疫染色显示的数量(p < 0.05)明显高于IL量9检测阳性细胞黏膜下层的CF患者(46.5±6.8毫米2)相比,对照组(7.0±2.5毫米2)。更多的上皮细胞表达IL CF患者(p < 0.05) 9 r(71.3±7.5%)和hCLCA1 (82.5±7.5%;无花果1 b⇓和2⇓)相比控制个人(IL必经9 r: 17.5±3.1%;hCLCA1: 22.9±9.4%;无花果1⇓和2⇓)。hCLCA1 mRNA的表达在上皮细胞类似于hCLCA1蛋白表达在CF患者和对照组(图2所示⇓)。
有一个明显更多的CF患者PAS-positive染色上皮细胞(71.3±6.9%),而对照组(25.0±12.9%;p < 0.05;图2⇓)。PAS-positive上皮黏膜下腺体的CF患者中发现。
相关的IL 9和IL 9 r与上皮hCLCA1 mRNA和蛋白的表达
CF患者和对照组之间的正相关关系被发现IL量9 r和IL应承担9检测阳性细胞(r = 0.63;p < 0.05;图3⇓)。之间的正相关IL 9 r表达在上皮和hCLCA1 mRNA (r = 0.72;p < 0.05)和hCLCA1蛋白表达(r = 0.82;p < 0.05;图3 b⇓)被观察到。的百分比mucus-containing PAS-positive上皮细胞的百分比与hCLCA1 mRNA-positive细胞(r = 0.76;p < 0.05), hCLCA1蛋白阳性细胞(r = 0.76;p < 0.05;图3 c⇓)和IL 9 r应承担的比例还是积极的上皮细胞(r = 0.63;p < 0.05;图3 d⇓)。
讨论
目前的研究表明,第一次,一个增加表达IL 9,其受体IL 9 r和hCLCA1 CF支气管粘膜。它进一步报告一个密切联系IL 9 r阳性细胞与IL量9阳性细胞和hCLCA1-positive细胞,以及地理PAS-positive细胞IL 9 r之间的积极和hCLCA1-positive细胞。伊什和histochemistry-immunocytochemistry显示colocalisation hCLCA1 IL必经9 r和PAS-positive细胞。
先前的报道展示了IL必经9之间的密切相关,IL 9 r和hCLCA1人类哮喘患者和动物模型8,12。此外,IL 9必经诱导upregulation hCLCA1应承担与增加生产gel-forming黏蛋白在体外11,12。因此,当前研究的结果同意之前的数据显示增加IL高9的表达IL 9 r和hCLCA1出现在CF支气管粘膜。当前研究的结果支持了这样的观点,即在CF粘液生产过剩,至少部分,由于IL 9必经诱导upregulation hCLCA113。
替代氯通道,如几种氯通道、CIC-2,被推荐为可能的候选人取代雌性生殖道功能和恢复氯电流16。从本研究的结果似乎hCLCA1可能导致calcium-activated氯电流测量在CF上皮细胞17,18。然而,upregulation这个通道与粘液过度,和hCLCA1可能,因此,不是理想的候选人取代CF跨膜电导调节器的功能。
总之,增加表达白介素检测9高诱导calcium-activated氯通道在hCLCA1,与粘液生产过剩。因此,它已经表明,细胞因子诱导的粘液生产确实是出现在囊性纤维化航空公司。然而,它必须考虑到本研究的样本量小(10例)。因此,本文所提出的数据必须被小心一概而论。进一步的研究是必要的,以检查是否抑制这个通道可能提供一个新的治疗选择减少粘液分泌过多在囊性纤维化。
代表人类的例子calcium-activated氯通道(hCLCA1)疣状控制主体(a)和囊性纤维化患者(b) (CF)。上皮细胞表达hCLCA1污点红色。Colocalisation 9 hCLCA1 mRNA和白介素受体(IL量9 r)表达(c)或定期acid-Schiff (PAS)阳性染色上皮细胞(d)在一个CF患者。箭头表明上皮细胞表达IL 9 r(红色)和hCLCA1(白色)(c),箭头表示上皮细胞染色阳性粘液糖蛋白(不是;红色)和hCLCA1(白色)(d)。
![图2. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/23/6/846/F2.medium.gif)
表达人类calcium-activated氯通道(hCLCA1;▪:信使rna;□:蛋白质)、白介素9应承担的受体(IL量9 r;┘)和周期性acid-Schiff(不是;▓)阳性细胞在囊性纤维化(CF)患者的支气管上皮细胞(n = 10)相比,在健康对照组(n = 6)。结果表达阳性细胞的平均±sem /总上皮细胞。*:p < 0.05与控制对象。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/23/6/846/F3.medium.gif)
地理地理相关性白介素9受体(IL 9 r)阳性细胞和一个)IL量9 (r = 0.63)或c)人类calcium-activated氯通道(hCLCA1)阳性细胞(r = 0.72)囊性纤维化患者和健康对照组。周期性acid-Schiff之间的相关性(PAS)阳性细胞和b) hCLCA1 - (r = 0.76)或者d) IL 9 r检测阳性细胞(r = 0.63)也显示。
脚注
↵社论评论见797页。
- 收到了2003年8月22日。
- 接受2003年12月17日。
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