文摘
结节病是一种复杂的肉芽肿性炎症紊乱,一些临床和致病特征与炎症性肠病(IBD)。提出常见的炎性疾病的遗传基础,我们测试了106个单核苷酸多态性(snp)已知或已经提出一个潜在的协会与炎症性肠病有关与结节病及其急性和慢性subphenotypes。
我们1996例德国结节病,包括648敏锐和1161长期影响个人,2622对照组,342年德国三人小组影响后代使用SNPlex™技术。
产生的SNP rs11209026 (Arg381Gln)白介素(IL) -23受体(IL23R)与慢性结节病相关基因(或0.63;p = 5.58×10−5),它是由传播的不平衡测试的结果分析独立家庭样本(或0.50;p = 0.031)。标记rs12035082位于染色体1 q24.3被发现与急性subphenotype(或1.36;p = 6.80×10−7)和rs916977 (HERC2轨迹;或1.30;p = 4.49×10−5)与结节病有关。
我们的研究结果强调的潜在重要性IL-23信号通路的发展慢性结节病。发现链接其他炎性结节病发病机理新假设条件和可能导致疾病的机制。
一些免疫相关易感基因已被证明是共享的慢性炎性疾病的危险因素。这些包括PTPN22和CTLA4(各种自身免疫性疾病1,2),NOD2(克罗恩病(CD)3,4和过敏性疾病5,6),IL23R(CD7,8、牛皮癣9和强直性脊柱炎10- - - - - -12)。特别是,CD和溃疡性结肠炎(UC)的两个主要表型的炎症性肠病(IBD),共享一个易感性位点的数量(例如NKX2-3,CCNY,STAT3和PTPN2)13,14。据推测,这种重叠的遗传风险位点,以及家族聚类不同的自身免疫性疾病15,表明共享生物学途径可能参与临床明显的免疫介导的疾病的病因学(综述16- - - - - -18)。
结节病(在线孟德尔遗传在人(人类)# 181000)是一种炎症性疾病,可以进一步分为急性或慢性结节病病程。股票几个临床与其他慢性炎性疾病和免疫功能,如一般炎症特征,或者更具体地说,在CD noncaseating肉芽肿的形成。此外,结节病是一种复杂的多基因疾病,在许多基因变种和未知环境因素可能造成19。结节病的遗传基础是由两个易感基因的发现,即BTNL220.,21和ANXA1122。除了这些疾病位点,许多病例对照关联研究的潜在候选人地区为结节病已经出版,但许多相互矛盾的结果(审查,请参阅23)。这包括趋化因子受体基因CCR2和CCR53 . 3号染色体上IL18,TNFA和几个HLA位点。大多数这些基因似乎其他免疫疾病的发病机制中起重要作用,如IL18或TNFA在CD(评论,看到24)。此外,我们最近还发现了一个新共享易感性位点(杆)10号染色体上p12.2结节病和CD通过结合两种疾病的全基因组关联数据集25。这突显了上述假设存在的许多基因区域可以作为炎症反应的一般修饰符。
这里,我们旨在识别基因变异的假定的影响在74年IBD风险位点对结节病的易感性,以及急性和慢性subphenotypes。通过这种方法,我们能够识别HERC2作为小说结节病易感性基因,chr12q24.3和IL23R作为急性和慢性subphenotype subphenotype-specific风险位点。
材料和方法
患者和对照组
总共1996个无关的德国结节病病人和2622个德国控制被包含在研究无关。所有患者通过专门的医院和医生,德国结节病病人的组织(德意志Sarkoidose-Vereinigung汽车集团。www.sarkoidose.de),通过医疗保险机构。在后一种情况下,组织学确认包含个人的诊断是必要的。所有的病人在病程完成一份调查问卷。病人的医生联系提供临床放射学和实验室数据需要确认结节病的诊断。根据疾病的临床表现,患者分为有慢性或急性结节病,如果可能的话。急性结节病组患者由突然投诉和复苏在2年,包括洛夫格伦综合征患者。个人与结节病的慢性表型表现出微妙的早期症状加剧,紧随其后的是持久的疾病活动≥2年。为了减少表型异质性,结节病病人分为648人急性结节病,包括105洛夫格伦综合征患者和1161人慢性的疾病,734人患有长期疾病尽管可的松治疗和427人经历复苏有或没有治疗。剩余的187病人不能分类明确疾病的过程中,这些人被排除在subphenotype-specific分析。德国控制个人招募PopGen生物库26。从所有参与者获得书面知情同意。所有收集协议批准机构伦理审查委员会和数据保护部门参与的机构。
家庭样本由342年德国三人小组与后代受到结节病的影响。其中,121年三人小组组成的后代与急性的疾病和255三人小组的后代受到慢性结节病。招聘和诊断病例对照样本完成如上所述。
单核苷酸多态性的选择、基因分型和质量控制
所有106个单核苷酸多态性(snp)包含在本研究选择从之前的出版物的确认或提出与CD和/或加州大学。大多数的这些标记(58 SNPs)最初威康信托基金会发表的病例对照财团27通过分析由巴雷特或被确定et al。14(见表S1在线补充材料的详细信息)。Ligation-based SNPlex™基因分型28如前所述执行29日。基因型与作业手动经目视检查Genemapper 4.0(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)软件。所有过程数据被写入,由内部前面描述的数据库驱动的实验室信息管理系统30.。所有样品和单核苷酸多态性分析中遇到以下质量标准:所有样品有一个叫率≥0.9;标记有一个轻微的等位基因频率≥0.02,呼叫率≥0.95和显示控制样本中没有偏离哈迪温伯格平衡(p > 0.01的测试中实现叮铃声v1.0631日)。为进一步的质量评估,共有129840个基因型来自55个随机选择的snp技术复制显示两个批次之间的一致率为99.8%。
统计分析
统计数据分析使用叮铃声v1.0632。等位基因频率差异评估使用卡方测试(一个自由度(df))。名义假定值的多个测试使用Bonferroni调整修正因子的318人,占所有106个标记在研究和三个调查表型。功率计算传输不平衡测试(TDT)进行了分析使用遗传力量计算器33使用PS和病例对照分析权力和样本容量计划34。
分析的具体表达式IL23R通过rt - pcr
调查的组织和细胞特定类型的表达模式IL23R,我们使用标准rt - pcr程序在商用人体组织和免疫面板从Clontech(美国帕洛阿尔托,CA)。支气管肺泡灌洗(BAL)细胞样本取自五结节病的患者和没有类固醇治疗落下帷幕的时候,五个人的影响。结节病的诊断成立回顾性按照之前定义的标准35,包括noncaseating肉芽肿由transbronchial活检。所有患者和影响个人把他们的知情同意参加研究。如前所述执行落下帷幕36。球细胞悬浮液用于这项研究包含肺泡巨噬细胞> 95%。简单地说,使用PCR程序应用如下:变性5分钟在95°C;33周期的20年代在95°C, 20年代在53°C和60年代在72°C;和最后一个扩展为5分钟72°C。以下引物被用于放大:hIL23R-F1 (GACACATGGAATTCTGGGCT)和hIL23R-R1 (CAAAAGCATGGTGGTTTCCT)。确认使用等量的RNA在每个实验中,所有样本检查并行甘油醛3 -磷酸脱氢酶(GAPDH使用以下引物)表达:GAPDH-F (CCAGCCGAGCCACATCGC)和GAPDH-R (ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT)。所有放大DNA片段分析1%琼脂糖凝胶,然后记录和量化使用ChemiDoc XRS系统(BioRad,慕尼黑,德国)。
结果
病例对照关联分析
共有来自74个不同的106个snp位点通过质量控制标准(见方法部分)。在协会分析,24 21种不同位点单核苷酸多态性与名义假定值达到标称的意义(p笔名)< 0.05的等位基因卡方测试(df)的总体样本1996例结节病病例和2622例对照。subphenotype-specific分析八这些snp也是名义上的相关(p笔名< 0.05)急性结节病(648例)和16个慢性的疾病(1161例)。三个不同的单核苷酸多态性是名义上重要的专为急性结节病并进一步四个snp慢性结节病。详细的结果下的所有单核苷酸多态性研究,包括基因型,S2在线补充表所示。
由于每个SNP在整体测试,急性和慢性样本,名义上的假定值Bonferroni-corrected 3×106 = 318独立测试。三个协会信号,即从rs916977 rs11209026 rs12035082,校正后仍明显为多个测试(表1)。SNP rs916977,位于基因内区12 HECT域的世界2 (HERC2chr15q13.1)基因,产生了一个纠正假定值(p相关系数在整个结节病样本)的0.014(或1.30,95%可信区间1.15 - -1.48),与subphenotypes导致信号(或类似的程度急性1.34,95%可信区间1.12 - -1.61;或慢性1.29,95% CI 1.11 - -1.50)。这些奇怪的比率是相同的范围乳糜泻(或1.26,95%可信区间1.07 - -1.47),但相比减少了加州大学(或1.46,95%可信区间1.23 - -1.75),作为德国此前报告的样本37。此外,两个subphenotype-specific协会观察:产生的SNP rs11209026白介素(IL) -23受体(IL23R)基因,这是一种被广泛接受的CD的危险因素7,14,37,38是仅仅与慢性结节病(或有关慢性0.63,95%可信区间0.50 - -0.79;p,慢性= 0.018)。这个SNP稍微不同的效果持久的疾病尽管可的松治疗患者与患者之间,经历复苏(或0.66 (95% CI 0.50 - -0.68)和0.57 (95% CI 0.40 - -0.82),分别)。IL-23受体(IL-23R)直接与Janus激酶2 (JAK2)在分子水平上39有趣的是,两个snp, rs10758669 rs10974944,位于JAK2基因,与慢性结节病(或名义上的意义慢性1.14 (95% CI 1.03 - -1.26;p慢性= 0.013),或慢性1.16 (95% CI 1.04 - -1.30;p慢性分别为= 0.0061))。然而,未发现上位性效应IL23R和JAK2单核苷酸多态性(数据没有显示)。最后,独家协会急性SNP rs12035082(或观察结节病急性1.36,95%可信区间1.21 - -1.54;p相关系数、急性= 2.34×10−4),它位于下游的肿瘤坏死因子(配体)总科成员18基因(TNFSF18或GITRLchr1q24.3),据报道,适度增加的风险CD(或1.20,95%可信区间1.05 - -1.37)37。洛夫格伦的疾病子样品,这可能SNP没有显著相关,由于小数量的患者(n = 105;功率= 0.34)。
额外的评估在一个家庭设计
为了证实这些小说协会,我们测试了三个标记在一个独立的家庭样本包括342名德国三人小组与后代的影响,包括121年的“急性”三人赛和255年“慢性”三人小组,使用TDT (表2)。SNP rs916977位于HERC2与结节病相关基因,它被发现在以人群为基础的设计(或1.30)的风险,产生了一个边界,但不重要,结果(或0.73,95%可信区间0.52 - -1.03;p = 0.069;29%的权力)。标记rs11209026,位于IL23R基因,显示名义与慢性subphenotype重大协会(或0.50,95%可信区间0.26 - -0.95;p慢性= 0.031)和类似的效应大小的病例对照分析(或0.63)的风险。最后,SNP rs12035082被发现了略高比值比(-2.35或1.50,95% CI 0.96)在急性三人小组以人群为基础的设计(或1.36)的风险,但也只有边缘,无意义的假定值(p急性= 0.074;27%的权力)。
表达式的分析IL23R
获得第一的见解可能的影响IL23R在结节病变异,成绩单的水平IL23R评估通过rt - pcr在小组不同的健康人体组织和休息和激活免疫细胞(图1)。这个面板显示高的表达分析IL23R表达在睾丸和CD4 + t细胞激活和温和的表达在健康的肺部组织。接下来,我们分析的表达水平IL23R在细胞来源于BAL使用定量实时PCR和互补结节病病人和控制每组(n = 5)的影响。统计分析显示之间的相对表达水平无显著差异的病人和控制(数据没有显示)。
讨论
的假设下常见的炎性疾病的遗传基础,我们选定的单核苷酸多态性与CD或有关加州大学被称为可能的候选人在结节病病因学也起到了一定的作用。我们确定了三个重要的关联与结节病,有两个被特定的急性和慢性subphenotypes。
整体rs916977结节病表型与标志,这是一个产生的SNPHERC2基因。因此,我们的研究样本来自德国和我们并不指望一个重要的人口结构对于此示例40。然而,等位基因频率的标记位于HERC2轨迹最近欧洲展览南北梯度41,甚至在德国。HERC2以前曾有报道称与CD和加州大学在德国和比利时的产品陈列室吗37,38。然而,无论是CD的协会和加州大学还是well-powered与结节病调查,基于家庭的研究,到目前为止,还没有报道的功能HERC2在炎症过程中的作用。因此,协会的信号HERC2必须小心考虑,需要进一步调查。
协会IL23R变异与炎症性肠病和一些慢性炎性疾病7,9- - - - - -13,42- - - - - -46。我们的研究是第一个报道的一个协会IL23R变异与慢性结节病(rs11209026;或0.63,95% CI 0.50 - -0.79),并提供进一步支持这个信号由名义重大协会在一个独立的家庭样本(或0.50,95%可信区间0.26 - -0.95)。相关的SNP rs11209026 (Arg381Gln)导致胞内域的氨基酸交换IL-23R,因此可能影响下游信号的受体。初步研究显示高表达IL23R表达在活化的CD4 + t细胞和单核细胞低表达,这与先前的发现是一致的39。此外,我们发现中度表达健康的肺组织。微分IL23R表情已经报道了从加州大学和CD患者CD4 + t细胞47。然而,缺乏的微分表达式IL23RBAL细胞结节病病人与健康个体(数据未显示)并不矛盾我们基因的发现,主要是因为致病SNP (s)可能会影响IL-23R函数而不是mRNA的表达。
信号转导通过IL-23R IL-23通路的下游元素特征。IL-23感应的信号是非常重要的辅助细胞(Th) 1748,有越来越多的证据表明,这是发展的一个关键途径慢性炎症过程中各种皮肤、肠道和肺部炎性疾病了49- - - - - -52)。然而,到目前为止,Th17细胞的特定角色结节病的发病机理尚未研究53。酪氨酸激酶JAK2是直接参与信号转导功能受体IL-23R组成的复杂和白介素受体β1。名义上的重要遗传协会慢性与rs10974944结节病,它位于JAK2基因(或1.17,95% CI 1.05 - -1.30),因此,提供一个额外的提示潜在的重要性IL-23信号发展的这种表型,虽然没有正式的遗传SNP-SNP交互检测。未来的实验将澄清相关的SNP rs11209026和的角色,可能其他慢性结节病的发展,诱发变异和遗传变异如何影响IL-23R函数关于结节病的发病机理。
SNP rs12035082位于染色体1 q24.3急性结节病显著相关的以人群为基础的设计。复制德国家庭独立样本中最有可能失败由于低功率(27%),而TDT的优势比分析指出,一个真正的发现。协会信号不容易归因于特定基因与潜在功能相关性,自苏格兰民族党位于大约112 Mb的下一个基因。没有结论可以从内部全基因组关联数据22,无论是信号进一步延伸TNFSF18(GITRL)或进一步TNFSF4(OX40L)基因(数据未显示)。都有调节t细胞的反应54,55(综述56,57);他们都是似是而非的候选基因功能相关性在结节病病因学。为了评估本地区的一个协会建议候选基因,验证在一个独立的人口和精细定位实验中是必要的。
一般来说,只有有限的结论可以从消极的结果在这个variant-centered,候选基因的方法,我们测试了之前报道IBD风险变异。无视权力问题,消极的发现主要有两个原因不排除特定的轨迹结节病的风险基因。首先,不同的疾病,“私人”诱发变异可能存在一个共同的风险位点,从而导致观察到的重叠病理学(如。肉芽肿的形成)。其次,它必须假定大多数标记研究并不代表诱发snp,但仅仅是在等位基因与他们联系。因此,研究种群之间不同的连锁不平衡结构会导致假阴性结果。例如,风险位点SNP rs2066844位于CDNOD2据报道,最近很严重的结节病58。两个CD变体(rs10521209和rs2076756)的风险NOD2基因区域都包含在我们的研究中,但没有与结节病或临床subphenotypes在这项研究中。
总之,本研究确定了协会IL23R变体Arg381Gln慢性结节病并提供支持这部小说发现通过dt分析在一个独立的家庭样本。我们进一步报告rs916977协会(HERC2)与整体rs12035082结节病和急性subphenotype (chr1q24.3轨迹)。这种基因的结果指出可能的病原学的相似性结节病和其他慢性炎症性疾病,如炎症性肠病、银屑病和强直性脊柱炎7,10,18,43。我们的研究增加了进一步的证据提出常见的炎症性疾病的遗传基础。这一发现可能会导致新的疾病发病机制假说,并鼓励进一步功能调查潜在的病因IL23R变异及其影响IL23信号通路在结节病。
确认
作者要感谢所有的病人,家属和医生参与这项研究的合作。德国结节病的患者协会的支持(德意志Sarkoidose-Vereinigung汽车集团),PopGen生物库和贡献位肺脏。最后,我们要感谢m·戴维斯,埃勒斯,s . c . Furstenau t·亨特Urbach, t . Wesse r . Vogler临床分子生物学研究所和迈克尔·维蒂希(Christian-Albrechts大学、基尔、德国)技术专家的帮助。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
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感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年3月28日。
- 接受2010年6月28日。
- ©2011人队