文摘
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(冠)在2002年出现严重的下呼吸道感染的一个重要原因人类,和体外模型的肺需要阐明细胞目标和病毒感染的后果。冠受体,人类血管紧张素1-converting酶2 (hACE2)中检测出气道纤毛上皮细胞的人体气道组织来源于鼻或气管支气管的区域,这表明冠可能感染的近端航空公司。评估感染的体外模型气道纤毛上皮细胞(已经)来源于鼻腔和气管支气管的气道地区,我们通过删除开放阅读框生成重组冠7 a / 7 b (ORF7a / 7 b)和插入的绿色荧光蛋白(GFP),从而导致冠GFP。冠GFP复制到野生型病毒的滴度类似细胞系。冠专门感染已经通过顶端表面和复制到10滴度7空斑形成单位/毫升48 h postinfection。多克隆抗血清针对hACE2阻止病毒感染和复制,这表明hACE2有冠状病毒感染的主要受体。冠状纤毛上皮细胞结构蛋白和病毒粒子本地化。高溶细胞的感染,感染纤毛细胞坏死和脱落到支架表面的上皮细胞。冠GFP在纤毛细胞培养也复制到一定程度上来源于仓鼠或者猕猴航空公司。非典冠状纤毛细胞感染的有效率已经提供了一个有用的体外模型冠复制人类肺起源研究的特点和发病机制。
由经典的人类冠状病毒感染人类呼吸道的航空公司(HCoV)(例如,HCoV - 229 e和HCoV-OC43)通常会产生轻微的感冒症状,虽然更严重的疾病已经报道发生在婴儿和个人潜在的并发症(42)。然而,感染最近出现HCoV特征会导致致命的肺炎是严重急性呼吸系统综合症(SARS),和新发现的HCoV指定SARS冠状病毒(冠)(11,25)。冠引起了全世界约8000例和∼800死亡,∼10%总体死亡率前成功遏制疫情。冠已经分离出人类,麝香猫,浣熊狗,蝙蝠,和猪,这表明一些动物物种可能函数作为未来爆发(天然水库17,28)。在某些情况下,人类可能显示轻微的疾病,提高的可能性无症状的病毒在人类的运输和维护(22,52)。冠发现还鉴定了两个新的HCoV HCoV-NL63 HCoV-HKU1,两者都是人类严重下呼吸道感染相关(62年,67年)。鉴于日益增长的重要性HCoV病原体产生严重的人类呼吸道疾病、相关模型系统需要阐明潜在的分子机制管理冠状病毒发病机理和毒性在人的肺部。冠HCoV感染,感染是一个有吸引力的模型,因为它会产生严重的疾病在人类肺癌,它有效的体外复制,分子克隆可以识别管理发病机理和毒性,遗传因素和各种动物模型正在开发(16,34,41,44,45,70年)。
冠状病毒粒子包含一个单链,正极,29700 -核苷酸RNA基因组受核衣壳蛋白(N)。衣壳是由脂质双分子层包装包含至少三个结构蛋白,包括180 kda飙升糖蛋白(S)与人类血管紧张素1-converting酶2 (hACE2)调解病毒进入细胞(30.)。除了23-kDa膜糖蛋白(M),信封(E)的蛋白质可能是必不可少的有效的病毒粒子的成熟和释放。最近,3开放阅读框(ORF3a)第四个病毒粒子编码蛋白质,虽然其功能在成熟和释放是未知的(72年)。冠基因组包含九羊痘疮,第一个编码subgenomic所需的病毒复制酶蛋白和基因组RNA合成和病毒复制(见图。2)(32,46,48)。基于研究与其他冠状病毒,很可能冠使用转录衰减模型合成完整的和subgenomic-length段包含antileader rna的rna,然后函数作为模板合成相似大小的mrna (2,49,50)。ORF2 ORF8位于八subgenomic信使RNA合成为一个嵌套组3′共终端的RNA物种的领袖RNA序列在基因组5′末端连接体序列在不同的转录调控序列含有高度保守的共识序列(53,59,70年)。冠的共识序列是ACGAAC (32,46,53,59,70年)。病毒结构基因产品的年代,ORF3a蛋白质,M, E, N在mRNA转录本编码2,3,4,5日和9,分别在类属特异性的orf位于mRNA 3、6、7、8和9。冠之间的空隙结构基因群特异性基因(ORF3b、ORF6 ORF7a / 7 b, ORF8a / 8 b,和ORF9b),不保存在其他冠状病毒在复制和发病机制的功能通常是未知的(32,46,53)。与其他冠状病毒的羊痘疮,如鼠肝炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和传染性胃肠炎病毒,通常编码豪华功能复制体外(9,10,66年)。在这些病毒的情况下,类属特异性的基因可以被删除,通常体内衰减发病机理(9,10,18)。冠状分子克隆的发展提供了一个有用的工具来研究复制和病毒基因组的发病机制,允许直接操作(70年)。
冠状病毒感染的主要病理特征的人类肺弥漫性肺泡损伤,包括非典型性肺炎干咳,持续发热、进行性呼吸困难,在某些情况下急性肺功能恶化。主要病理病变包括肺泡炎性渗出物和间质组织,纤维组织增生和纤维化(5,25,27)。在冠状组织分离出死亡病例,病毒被荧光原位杂交在肺泡pneumocytes本地化(主要是II型)和肺泡内空间。病理组织学评估气道的样本地区以外的肺泡就不那么严格了,随着肺泡地区一直展示最重要的疾病晚期死亡病例(7,60)。然而,现在有一些报告,检查早期疾病冠感染指出明显的细支气管疾病,呼吸道上皮细胞坏死、纤毛、鳞状细胞化生,intrabronchiolar纤维蛋白沉积。事实上,它已经表明,早期弥漫性肺泡损害由于冠感染可能会发起的呼吸细支气管(13,39)。
我们以前描述的使用人工气道上皮细胞的体外模型概括人类气道上皮的形态和生理特征体内(43,74年)。利用这个模型,它已经表明,普通人类的呼吸道病毒,例如,人类呼吸道合胞病毒(RSV)和人类副流感病毒3型病毒(PIV3),专门管腔内的接种后感染纤毛细胞,提高的可能性,这些细胞在呼吸道病毒感染的发病机制中发挥重要作用。这里,我们测试的能力冠感染人类气道纤毛上皮细胞(已经)在体外是否感染和传播的冠状纤毛进行气道上皮细胞可能会提供一个有效的模型来理解冠肺部疾病的发病机理。帮助评估冠已经感染,我们生成一个重组克隆的冠Urbani应变表达绿色荧光蛋白(GFP),冠GFP,允许感染和传播到被监控。我们证明冠感染呼吸道纤毛上皮细胞通过一个互动hACE2顶端表面的纤毛细胞。尽管子代病毒最初是上皮细胞的腔室,在以后的时间postinfection,病毒还基底脱落到隔间。由于气道纤毛上皮细胞具有独特的生理和天生防御功能在人类肺癌(例如,黏膜纤毛的清除),重要的是要确定冠状纤毛细胞的趋向性和感染细胞的病理后果。
材料和方法
建设冠GFP重组病毒。代替ORF7a / 7 b与GFP,引物组(i)。47 (5′-GTGCTTGCTGTTGTCTACAG-3′)和非典Mu6 (5′-ATCGATCACCTGCCATGTTCGTTTTATGGATAATCTAACTCCATAGGTTC-3′)和(2)SARS Mu7 (5′-ATCGATTTAATTAAGAGCTCACTTTAATTGACTTCTATTTGTG-3′)和3′天然气凝析液(−)(5′-CTTTGCTCTCAAGCTGGTTC-3′)被用来生成扩增子侧翼冠基因组核苷酸27304年到27671年。消化了扩增子ClaI创建一个盒式ORF7a / 7 b的移除,使可用AarI ClaI,奶嘴限制网站。AvrII削减扩增子是纯化和结扎回冠F cDNA克隆(70年),系统删除核苷酸27276年至27643年,插入一个AarI ClaI,奶嘴多个克隆站点在冠基因组中。sequence-confirmed F片段被用作GFP基地质粒插入。GFP扩增子是生成使用引物5′GFP (+) (5′-CACCTGCTAAACGAACAAATTAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′)和3′GFP (−) (5′-TTAATTAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′)。GFP扩增子当时subcloned到F片段缺失ORF7a / 7 b序列利用AarI限制性位点奶嘴和测序,这变异F片段被用来构建冠GFP。
组装完整的冠GFP cDNA、非典通过F插入被限制在0.8%琼脂糖凝胶分离,用一个黑读者灯箱(Claire化学),切除,使用Qiaex II和纯化DNA净化设备。通过F片段被结扎一夜之间,phenol-chloroform提取,用异丙醇沉淀。完整的成绩单体外生成所述由制造商(mMessage 1;Ambion)与某些修改。产生全身覆盖冠N基因mRNA转录本,1μg质粒DNA编码的N基因正向引物(5′-NNGGCCTCGATGGCCATTTAGGTGACACTATAGATGTCTGATAATGGACCCCAATC-3′)和反向引物(5′-NNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGCCTGAGTTGAATCAGCAG-3′)被SP6转录RNA聚合酶以2:1的比例上限模拟三磷酸鸟苷。
完整的RNA转录被转染到800μl州立E6细胞(8.0×106)在一个电穿孔试管,四个450 V的电脉冲50μF有基因脉冲发生器II electroporator (Bio-Rad),类似于方法之前被我们实验室(70年,71年)。维罗E6转染细胞被播种在75厘米2瓶,孵化出了37°C, GFP荧光和监控。克隆病毒空斑实验和监控后代被孤立的GFP表达与奥林巴斯IX51研究荧光倒置显微镜。
在细胞系生长曲线分析。确定病毒滴度,采集标本,2、8、12、16、20岁和32 h postinfection通过空斑实验和评估。简而言之,从感染板块维罗E6的上层清液,MA104,和Caco-2细胞连续稀释,接种到州立E6细胞单层60毫米盘子,和完整的媒体覆盖+ 0.8%琼脂糖,斑块可视化在48小时通过中性红染色。
北部污点分析。文化维罗E6细胞的接种与野生型Urbani infectious-clone冠(icSARS-CoV)和冠GFP的感染复数1对1 h在37°C。在12 h postinfection,细胞内RNA分离使用RiboPure试剂由制造商(Ambion、奥斯汀、TX)。信使rna分离使用试剂盒′年代Oligotex mRNA旋转列试剂按照制造商的指示(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。信使rna治疗与乙二醛和琼脂糖凝胶上分离利用NorthernMax-Gly根据制造商的指示(Ambion、奥斯汀、TX)。RNA被转移到一家BrightStar-Plus膜(Ambion) 4 - 5 h,和RNA被紫外光交联膜的。污点是prehybridized和探测N-gene-specific oligodeoxynucleotide探针(5′-CTTGACTGCCGCCTCTGCTbTbCCCTbCTbGCb3′),生物素化的核苷酸是指定的上标b。印迹杂交过夜,清洗与低收入和high-stringency缓冲区推荐的制造商。过滤器与streptavidin-AP孵化,水洗,然后用化学发光底物CDP-STAR孵化(新英格兰生物学实验室)。过滤器覆盖与电影和发达。
细胞培养。州立E6和MA104细胞维持在鹰的基本介质含10%胎牛血清,卡那霉素(0.25μg /毫升)和庆大霉素(0.05μg /毫升)。Caco-2细胞保持在杜尔贝科high-glucose基本中含20%胎牛血清,0.1不必要的氨基酸,卡那霉素(0.25μg /毫升)和庆大霉素(0.05μg /毫升)。Urbani和icSARS-CoV非典冠状GFP的野生型病毒和传播和斑块孤立在州立E6细胞。所有病毒工作了在生物安全柜在生物安全三级实验室包含冗余的排气风扇;人员穿着特卫强西装,完整的容器,动力与高效微粒空气过滤呼吸器(HEPA)和有机蒸汽过滤器。
人类鼻腔和气管支气管的上皮细胞是来自下呼吸道标本从病人择期手术切除UNC UNC囊性纤维化中心机构审查委员会批准了协议的组织文化的核心。简单,主要细胞扩大塑料镀产生通道1细胞和250000个细胞的密度每在透水Transwell-Col (12-mm-diameter)支持(14,43)。提供有文化生成的气液界面形成分化良好型的4到6周,极化文化类似体内pseudostratified黏膜纤毛的上皮细胞(43)。气道上皮细胞的文化源于人类肺的肺泡区域获得的镀层主要人类肺泡细胞(ScienCell研究实验室,CA)或A549细胞Transwell-Col支持和维护前5天病毒接种制造商提供的介质或杜尔贝科high-glucose最小的基本程式码中,分别。
基底顶端或病毒接种病毒与200年进行μl股票应用于顶端或基底表面有分别。在顶端接种之前,顶端表面已经被冲洗三次30分钟的磷酸盐(PBS) 37°C。基底外侧接种是由反相Transwell-Col插入前的病毒。2 h后病毒接种在37°C,接种物被移除,已经保持了一个气液界面的剩余部分实验。生成病毒接种后增长曲线在特定时期,120年μl组织培养基是应用于顶端表面有收集10分钟孵化后37°C。基底外侧基底去除120μl收集的样本中在每个时间点。所有样本存储在−80°C到化验血小板形成州立E6细胞如上所述。
鼠标,仓鼠,恒河猴气道上皮细胞培养。短暂,老鼠和仓鼠气管切除喉和支气管分支之间使用无菌技术。上皮细胞分离后隔夜孵化与链霉蛋白酶和随后的孵化与胰腺DNase即短孵化后允许纤维母细胞粘附,鼠标上皮细胞在TEC +镀(TEC基础培养基+ 10μg /毫升胰岛素,转铁蛋白5μg /毫升、0.1μg /毫升霍乱毒素,25 ng / ml表皮生长因子,正欲贝德福德,马,牛脑垂体提取物30μg /毫升、5%胎牛血清,和刚添加0.01μM视黄酸)在rat-tail-collagen-coated Transwell-Clear膜在不同细胞密度从100000到250000个细胞。纤维母细胞后坚持一步,仓鼠细胞被镀上Transwell-Col膜为100000到200000个细胞。一旦汇合的单层成立,顶端中摘除和细胞维持在气液界面。从这个观点来看,细胞生长在TEC / NS (NuSerum;正欲)(47)。管基底介质是每2天更新,文化与PBS顶端表面清洗一次/周。恒河猴气管支气管的标本的礼物丽贝卡·格兰特(非人灵长类动物研究计划,宾夕法尼亚大学),和气道纤毛文化建立人工气道是如上所述的文化。
显微镜。检测病毒抗原结构,抗血清对冠状结构所产生的年代和N蛋白接种的老鼠与委内瑞拉马脑炎病毒(三角)复制子粒子(vrp)表达个人共识的年代序列和N, S和N被克隆到pVR21 v字形的复制子向量与冠,VEE-specific overlapping-extension PCR引物对PCR条件之前描述的插入诺瓦克病毒衣壳基因(3)。vrp进行冠状和N orf如前所述生产(20.,21)。还是老鼠的vrp被接种到脚垫和提高postinfection 30天,收获前抗血清(20.,21)。鼠标anti-S和- n浓度超过1:10,000。
冠抗原的检测研究,文化与Urbani接种,icSARS-CoV和冠GFP (5×106空斑形成单位/毫升)固定在4%多聚甲醛(PFA) 24 h,转移到70%的乙醇,准备石蜡包埋组织UNC囊性纤维化中心部分的形态和地貌形态示量核心。deparaffinization后,组织学部分被孵化1 h PBS中含3%牛血清白蛋白(BSA)。主要抗体应用在PBS 1:10 0稀释1% BSA在一夜之间和检测anti-mouse抗体结合德州红(杰克逊ImmunoResearch)。检测hACE2人类呼吸道样本和已经冻结的部分新鲜鼻腔和气管支气管的航空公司或有固定在冰冷的甲醇,3% BSA-PBS阻塞,然后一夜之间探索山羊多克隆anti-hACE2 (AB933;研发系统)或一个无关紧要的抗体控制(山羊anti-biotin) 1:10 0稀释,紧随其后的是一头驴抗体免疫球蛋白G共轭德克萨斯红。免疫荧光法是用一个徕卡Leitz则DMIRB倒置荧光显微镜配有冷却颜色相素数码相机(MicroPublisher;打印大师)。德州一套三色滤光片立方体(GFP /红/ DAPI [4′, 6′-diamidino-2-phenylindole])是用来显示组织切片的形态学(通过结合低级自体荧光水平在三个过滤器),从而帮助确定荧光抗体定位到特定区域的细胞。可视化的病毒传播使用标准技术与扫描电子显微镜是由有接种Urbani, icSARS-CoV或冠GFP固定在48 h postinfection pfa 2% - 2%戊二醛。代表感染Urbani显示图像。
抗体的封锁。确定冠状病毒感染可能是anti-hACE2挡着,顶端表面已经被冲洗,300μl 1:10稀释的单克隆anti-hACE2 (MAB933;研发系统)、多克隆anti-hACE2 (AB933;研发系统),或控制抗体(anti-MUC1克隆b27.29,礼物Fujirebio诊断,Inc .) (8)已经应用于顶端表面;2 h后,从顶端表面抗血清被移除。冠GFP(200μl;5×106空斑形成单位/毫升)或PIV3表达GFP (107空斑形成单位/毫升)被接种到顶端表面和孵化为一个额外的2 h在37°C。病毒接种物被移除,和最初的抗血清稀释30μl回到顶端有表面。如上所述冠GFP,顶端洗收集2,6日,12日,22日和36 h postinfection评估病毒滴度增长通过空斑实验州立E6细胞。在36 h postinfection,已经是固定的(4% PFA)之前GFP的表达进行定量评估与Photoshop图像处理工具插件(ISBN 1 - 928808 - 00 - x;约翰·拉斯)。
结果
hACE2定位在人类呼吸道上皮细胞体外和体外。来确定上游(鼻)和低(气管支气管的)地区的人类进行气道上皮细胞表达了冠受体hACE2,组织学部分新鲜切除人工气道组织隔绝鼻腔和气管支气管的地区与多克隆抗血清对特定hACE2和免疫反应性评估荧光二次抗体。在组织的部分鼻(图。1 a和B)和支气管(图。1 c和D)地区,hACE2免疫反应性检测支架表面的气道上皮细胞,特别是局部气道纤毛上皮细胞顶膜。尽管hACE2出席的顶端表面纤毛细胞,它不是检测与cilial轴本身,而是被局部区域对应于这些细胞的顶端膜(无花果。1 a和C)。确定人工气道纤毛上皮文化显示hACE2体外分布相似,我们也对组织的部分已经与hACE2抗体。hACE2支架表面的检测有专门和本地化的顶端表面纤毛细胞(图。1 e和F),从而概括hACE2本地化的发现来自体内的组织。鉴于之前报道的数据冠hACE2作为受体(30.),本地化的hACE2腔的纤毛细胞的膜表明冠进入人类气道腔可能利用纤毛细胞作为主要细胞感染的目标。自从hACE2本地化纤毛细胞体外和体外我们以前报道,纤毛已经被人类几种常见呼吸道病毒感染,我们预测,模型将成为一个优秀的系统研究冠感染的特点,复制、传播,发病机理(73年,74年)。
建设和冠GFP病毒的特征结构。直接观察的程度和冠感染动力学实时,我们构建的重组,GFP-expressing冠冠GFP)监测感染。冠GFP的原理图设计和冠状克隆策略图所示。2 a和B,分别。生成重组冠GFP, F质粒突变来取代ORF7a / 7 b的GFP cDNA、使用IIS限制性内切酶的方法前面描述的类型(71年)。突变F片段序列分析证实了和放大大肠杆菌与野生型片段通过大肠片段被孤立的通过与合适的限制性内切酶消化,净化,和结扎genomic-length cDNA。全长cDNA转录,genomic-length RNA与冠coelectroporated N成绩单到州立E6细胞。GFP-positive细胞检测转染后24小时内,并澄清了上层清液从转染细胞传递给维罗E6新鲜单层膜导致病毒细胞病变效应和绿色荧光细胞。删除ORF7a / 7 b没有明显影响有效冠复制在组织文化中,这类似于观察和传染性胃肠炎病毒鼠肝炎病毒当GFP插入附件这些病毒的orf (1,9,12,54)。进一步评估之前,五个人斑块冠GFP是孤立的,放大,监控GFP荧光除了序列突变的确认。所有斑块含有GFP和适当的序列突变。
确定水平的复制subgenomic冠GFP构造的RNA物种与野生型相似的冠,总RNA Urbani——隔绝,icSARS-CoV和冠GFP-infected细胞。Oligotex mRNA列用来丰富了保利(A)包含mRNA的运行在琼脂糖凝胶和化验leader-containing N-gene-specific探针(无花果。2摄氏度)。RNA物种的总数和相对的转录水平Urbani的结果相似,icSARS-CoV,冠GFP,表明没有转录缺陷与删除ORF7a / 7 b。虽然subgenomic RNA的相对水平对所有三种病毒相似,更换ORF7a / 7 b的预期大小的变化引起subgenomic RNA 2到7,证明移除ORF7a / 7 b不是有害的病毒复制体外,GFP插入是稳定的。RNA隔绝mock-infected样品没有检测到leader-containing mRNA的物种。
评估冠GFP的生长动力学,生长曲线生成的三个不同的哺乳动物上皮细胞系。维罗E6细胞、Urbani和冠GFP∼2×10滴度的增长7空斑形成单位/毫升,而icSARS-CoV达到峰值1.0×10∼7空斑形成单位/毫升(数据未显示)。MA104细胞,所有三个病毒滴度的3×1075×107空斑形成单位/毫升32 h postinfection,而对于Caco-2细胞,这三种病毒的滴度相比减少约1日志与MA104细胞的病毒滴度。有效的复制冠GFP和野生型病毒感染指出在高和低的多样性(数据没有显示)。总的来说,更换ORF7a / 7 b与GFP冠GFP不是有害的病毒复制的三个细胞株进行评估,从而提供一个荧光标记的病毒感染在野生型病毒复制水平。
冠状病毒感染人类的气道上皮细胞。确定冠GFP可以感染人类呼吸道上皮细胞来自不同地区的肺癌,我们准备好的文化鼻腔和气管支气管的纤毛上皮作为模型的近端气道上皮细胞和肺泡上皮的文化模型的远端肺区域。作为模型的病毒进入气道腔,我们接种的顶端表面这些文化与冠GFP (5×106空斑形成单位/毫升)和GFP荧光48 h后评估。如无花果所示。3,有来自鼻腔和气管支气管的地区被冠GFP有效地感染,大部分的细胞表达标记转基因(无花果。3 a和B)。相比之下,主要来自肺泡上皮细胞区域的人类肺感染,很差,如果由冠GFP,很少证据GFP表达(无花果。3 c)。使用抗血清对非典冠状GFP的年代也未能发现或icSARS-CoV感染这些细胞(数据没有显示)。确定这些细胞容易感染其他常见呼吸道病毒同时,我们还与重组PIV3接种肺泡文化或RSV表达GFP (106空斑形成单位)。PIV3(无花果。3 d)和RSV(没有显示)有效地感染肺泡细胞的主要文化。类似的数据得到冠GFP, PIV3, RSV接种的肺泡细胞系A549(没有显示)。这些数据表明,人类的肺的气道上皮细胞,行进行航空公司被冠GFP,容易被感染,在我们的手中,从远端肺泡细胞区域被冠GFP感染很差。
确定冠在细胞有可能蔓延,基底冠GFP接种到顶端或表面的文化在37°C (2 h 5×106空斑形成单位/毫升)和水平的GFP荧光从19 - 140 h postinfection被监控。接种的冠GFP在顶端表面已经导致检测水平的GFP早在19 h postinfection(无花果。4),病毒复制峰值出现在68年(无花果。4 e)和90年(无花果。4 g140 h) h postinfection和GFP仍然发现postinfection(无花果。4我)。相比之下,接种的基底膜有冠GFP导致只有一个低荧光细胞的数量在68 h postinfection,表明这不是冠状病毒感染的最有效的路线(图。4 b、D、F和H)。这些数据显示,已经有效地感染通过顶端冠基底表面,而表面接种相对抵抗感染。有趣的是,140 h重大损失的GFP荧光观察,最有可能影响相关的损失SARS-CoV-infected细胞(见下文)。
是否脱落的后代冠已经被极化,顶端洗基底和媒体采样,9日,21日,31日和48 h postinfection Urbani或icSARS-CoV和病毒滴度评估通过空斑实验州立E6细胞(图。4 k)。Urbani的峰值浓度和icSARS-CoV摆脱从顶端表面近似107空斑形成单位/毫升,展示高水平的复制类似观察维罗E6细胞层(图。4 k)。相反,病毒滴度在基底外侧隔间Urbani和icSARS-CoV低、峰值浓度的104空斑形成单位/毫升(无花果。4 k)。顶端接种后,没有发现感染病毒后才20 h postinfection基底在媒体。自顶舱的病毒滴度有2到3日志高于发现基底从隔间病毒和GFP-positive细胞的数量与冠GFP顶端基底和接种后也与不同的病毒滴度的大小两个隔间,这些数据表明,在第一个48 h的感染冠主要从顶端表面有了。顶端的感染、脱落和与子代病毒再感染与顶端的本地化hACE2气道组织(无花果。1 a, C和E)。自冠复制在宽容细胞系浓度相似,这些数据表明,在有冠复制好,提供了一个新的模型研究人类的肺上皮冠复制和发病机理。
SARS-CoV-infected细胞已经的识别。表明,冠能有效感染有顶端接种后,我们下决定是否冠目标特定的气道上皮细胞类型。hACE2以来发现专门的顶端表面纤毛细胞体外人工气道组织和体外,我们预测冠状纤毛细胞会感染。组织学部分有感染Urbani icSARS-CoV,或冠状GFP 48 h与老鼠探测非典冠状结构蛋白的多克隆抗血清针对S或N,评估标准的免疫荧光技术和本地化。对所有病毒,S(图。5 a和B)和N(无花果。5度)免疫反应性在纤毛细胞,发现关联的本地化hACE2纤毛细胞类型(图。1 e)。在实验中表现有来自四个不同的患者,发现年代免疫反应性的证据只在细胞形态与纤毛细胞。在所有情况下,没有S或N nonciliated细胞中检测到免疫反应性。有趣的是,免疫反应性对年代最丰富的顶端表面的纤毛细胞微绒毛结构对应地区但低水平的年代免疫反应性也发现纤毛细胞的细胞质内(图。5 b)。相比之下,免疫反应性N蛋白检测在SARS-CoV-infected纤毛细胞的细胞质中,本地化显示x N与协会网站的复制和组装(图。5度)。主要的有文化融合性的和极化而不是分化(即。,cultures maintained at air-liquid interface for <5 days) were not infected by SARS-CoV as determined by GFP or S immunolocalization (data not shown).
确认可能感染了冠状纤毛细胞,我们进行透射电子显微镜上固定有48 h与Urbani postinfection icSARS-CoV或冠GFP。已经接种冠(Urbani感染的代表图片)显示纤毛细胞包含经典的冠状病毒胞质囊泡充满了病毒颗粒(图。6 b、G和H)。此外,大量的病毒颗粒之间的空间内被微绒毛/纤毛轴以及气道表面微环境周围的顶端表面纤毛细胞,建议机制释放大量的冠状的内腔进行气道在病毒复制(无花果。6 c, D, E, F)。Immuno-electron显微镜(EM)检测证实粒子探测到在气道表面微环境确实是冠状病毒粒子(图6 f)。因此,冠条目、复制和释放发生在hACE2-positive有纤毛细胞。
冠状纤毛上皮细胞的感染是hACE2依赖。来确定冠状纤毛细胞感染与hACE2通过互动,我们利用抗体与抗血清针对hACE2封锁的实验,这种方法曾被证明块冠之间的相互作用与hACE2州立E6细胞(30.)。已经与多克隆和单克隆抗血清preincubated针对hACE2(研发系统)或控制抗体结合的顶端表面有(anti-tethered粘蛋白MUC1,克隆b27.29) 2 h与冠之前接种GFP (5×106空斑形成单位/毫升)。定量分析GFP-positive细胞的数量36 h postinfection透露,有单独用多克隆抗体hACE2预处理去除GFP-positive细胞的水平相比,控制(图。7一个)。但是,没有抑制冠与单克隆hACE2观察GFP感染,表明识别的抗原决定基单克隆hACE2不sterically抑制与冠这个分子之间的相互作用。没有观察到抑制感染的控制抗体绑定到一个高度丰富的抗原决定基的顶表面上有(MUC1) (55)。这些抗体显著影响感染的纤毛细胞重组PIV3表达GFP,表明hACE2的位阻是特定于冠感染。确认添加多克隆hACE2抗血清不仅GFP-positive细胞的数量也减少病毒的复制后代,我们评估了增长动力学冠GFP顶端表面产生的感染已经在没有和上述抗体的存在。Apical-surface抽样进行从2到36 h postinfection和滴度的病毒空斑实验测定维罗E6细胞。在缺乏抗血清或抗血清的存在控制,冠GFP复制到10滴度7空斑形成单位/毫升(无花果。7 b),类似于滴度检测与野生型Urbani icSARS-CoV菌株(无花果。4 k)。相比之下,在hACE2多克隆抗血清,病毒滴度下降了至少2日志。单克隆抗血清对hACE2再次未能影响病毒式增长,确认这个抗体是不足以阻止冠进入纤毛细胞。因此,两个评估冠感染分析GFP-positive细胞和病毒生长动力学表明hACE2冠所使用的主要受体有纤毛细胞的感染。
纤毛上皮细胞形态学冠感染的后果。确定冠状纤毛细胞感染的后果的随着时间的推移,组织学部分来源于已经感染了冠GFP 20 - 140 h是探测anti-S抗血清。GFP是用来评估感染的时间已经被固定,切片。免疫反应性对年代纤毛细胞可以发现早在24小时postinfection(数据没有显示)和由48 h postinfection强劲位于顶端表面纤毛细胞(图。8)。72 h(无花果。8 b),免疫反应性保持在纤毛细胞的顶端表面但也出现在感染细胞的基底外侧表面。在感染后期(96和120 h), S-positive纤毛细胞似乎挤出的上皮细胞在支架表面(图。8 c和D)。挤压纤毛细胞通常显示的整个周边地区的免疫反应性细胞(图。8 d)。这些数据表明,冠状纤毛细胞的感染已经导致脱落的纤毛细胞进入气道腔感染。此外,冠的存在免疫反应性在之后的时间点在基底外侧表面postinfection表明冠也将进入基底外侧有隔间,正如图所示。4 k。
冠感染的易感动物气道上皮细胞。冠是一个新兴的病原体,其自然宿主范围尚未明确。然而,体内研究表明,冠可以在鼠标复制,仓鼠,猫,灵猫,雪貂,和非人灵长类动物的肺,小鼠和仓鼠模型冠发病机理研究和疫苗生产开发(34,41,44,45)。灵猫可能代表向人类传播的重要储层(17)。气道上皮细胞培养模型类似人类这里描述但来自敏感物种可能会提供一个重要的比较模型确定发病机理和复制机制的效率替代主机。朝着这个目标,我们已经成功地生成气道纤毛上皮细胞模型来源于C57BL / 6小鼠气管支气管的气道上皮细胞(图9),金色的叙利亚仓鼠(HmAE)(无花果。9 b)和恒河猴(无花果。9 c)。接种的顶端表面与冠GFP表明冠GFP复制这些文化在某种程度上气道上皮细胞纤毛细胞的恒河猴(无花果。9 f),在较小程度上HmAE(无花果。9 e),在一个小得多的程度上在C57BL / 6小鼠气道上皮细胞(图9 d)。少,虽然比已经被感染细胞,纤毛上皮细胞是主要的细胞感染非典冠状GFP的目标(数据没有显示)。病毒和感染细胞的百分比的增长相比大大降低了感染率和病毒滴度与已经实现,就是明证∼10滴度6空斑形成单位/毫升HmAE(如冠GFP只达到1.4×106空斑形成单位/毫升72 h后postinfection);然而,大致平行指出了感染的纤毛细胞来源于人类>非人灵长类动物>仓鼠>鼠标,大致相关疾病的严重性指出每个物种(34,37,45,56,65年)。很明显,已经是最健壮的气道模型为研究冠复制和肺癌发病机制。
讨论
人类进行鼻气道上皮细胞和气管支气管的地区包括pseudostratified黏膜纤毛的与主要纤毛上皮细胞分泌粘液的点缀着杯状细胞覆盖一个基底细胞层。人类的主要的立方上皮细胞远端也细支气管气道纤毛细胞。气道上皮细胞通常是第一个组织遇到的管腔内的病原体,和纤毛细胞常见呼吸道病毒的主要目标,如RSV, PIV3和流感(36,73年,74年)。在这项研究中,人工气道上皮细胞的体外模型来源于鼻腔和气管支气管的地区是容易感染冠腔的接种病毒后,和细胞类型有针对性的优先通过冠状纤毛上皮细胞。在我们的手中,无极性或极化而不是分化人类呼吸道上皮细胞来源于鼻或气管支气管的气道感染标本没有冠(数据没有显示)。以前,我们表明,RSV PIV3也有针对性的纤毛细胞和纤毛细胞分化有需要为感染,由于极化而不是分化已经没有感染这些病毒(73年,74年)。此外,我们表明,细胞的数量被RSV感染和ciliogenesis PIV3直接相关,表明感染纤毛细胞分化是必要的(73年,74年)。虽然我们显示冠状纤毛细胞有目标,我们也不能排除冠的可能性感染nonciliated气道上皮细胞体内。各种nonciliated细胞类型已经存在,一些细胞具有形态和标记表明mucin-containing细胞和其他形态,类似于纤毛细胞的前体。因为我们不完全理解的范围nonciliated细胞有,这些细胞可能不代表nonciliated细胞在气道上皮细胞体内。相反,它是我们的目的本文描述的冠状纤毛细胞取向有模型。最近的一份报告显示,Calu-3细胞容易感染冠(61年),尽管这些细胞是来源于人类的肺上皮细胞和分化生长在半透支持时,这些细胞不概括气道上皮细胞的分化状态体内已经在当前的研究中报道。这一事实Calu-3细胞不具备人类气道上皮的分化标记(例如,纤毛)和只中度感染冠表明有模型可能更冠感染人类的航空公司的代表。
冠的受体,重要的是,hACE2是本地化的纤毛细胞人类鼻腔和气管支气管的气道上皮细胞和纤毛细胞有反映冠状的纤毛细胞定位能力。重要的是,抗体针对hACE2有效抑制感染、复制和传播的冠状(图。7维罗E6),类似于结果报告和293个细胞表达hACE2 (30.,57),这表明hACE2函数作为受体冠感染的原则进行气道上皮细胞(图。1和7)。这些数据是由汉明形成鲜明对比结果等。19),hACE2表达式中检测出肺泡地区和nonkeratinized鳞状上皮的基底层上呼吸道(18)。hACE2表达我们的发现和生产冠状纤毛细胞感染来源于鼻腔和气管支气管的气道争端这一主张和支持的假设冠发起一个富有成效的感染人类气道纤毛上皮。有趣的是考虑hACE2表达式的生物学意义的支架表面纤毛细胞。最近,据报道,ACE2在肾素-血管紧张素及其作用通路服务对急性肺损伤的保护作用(24)。此外,冠和与ACE2的交互干扰这个途径,导致增强急性肺损伤在啮齿动物模型(26)。hACE2专门纤毛细胞类型的意义还有待探索。
有趣的是,我们发现冠不感染模型的气道上皮细胞来源于人类肺肺泡的地区,这一发现也被报道(15)。维洛细胞相比,A549细胞表达中检测不到hACE2和可能占冠感染这些实验的缺乏。这些观察结果可能反映了新孤立的人类肺泡细胞迅速失去分化状态(I型和II型细胞)在文化,导致细胞类型,并不代表细胞体内发现。这与有,分化气道细胞的纤毛形态需要6到8周的文化。增长的主要肺泡细胞体外的时间长度不会导致文化明显不同的分化或形态从3到5天的培养(r . j .泡菜,未发表的观察)。因此,此类研究肺的肺泡区域需要发展技术,隔离和保护上皮细胞的分化状态从这些地区。另外,这些研究可能更适合使用相关的动物模型体内实验。
hcov - 229 e,另一个人类冠状病毒,主要引起轻微的上呼吸道感染人类,已被证明与其他模型的主要目标纤毛上皮细胞,导致细胞形态改变、运动障碍、纤毛功能障碍(63年)。然而,受感染的纤毛细胞的脱落,注意在冠感染,没有遵循hcov报道- 229 e感染。相比其他HCoV冠成人严重感染与非典型性肺炎。主要在尸检病理结果显示冠状的参与II型pneumocytes位于肺泡,就是明证检测病毒rna病毒样颗粒和EM检测(4,5,75年)。重要的是,病人死亡后早期冠暴露显示显著的细支气管疾病,呼吸道上皮细胞坏死,纤毛,鳞状上皮化生,intrabronchiolar纤维蛋白沉积。事实上,它已经表明,早期弥漫性肺泡损害由于冠状呼吸细支气管感染可能启动(13,39)。冠有着广泛的宿主范围,有效地复制人类,灵长类动物,棕榈果子狸,浣熊狗,仓鼠,雪貂,猫,老鼠,虽然疾病最为明显注意到发生在人类和轻度持续性感染已经记录了棕榈猫身上(11,17,25,34,41,44,45)。显著降低病理和临床疾病发生在雪貂所指出的,猫、仓鼠、小鼠(34,41,44,45,56)。在冠状病毒感染的小鼠模型,复制的病毒没有疾病已经指出(56)。冠原则目标感染呼吸道上皮细胞的老鼠,仓鼠,雪貂模型(34,44,45,56);然而,纤毛细胞的特定感染并不是描述为这些物种。冠的跨物种传播机制介导出现在hACE2 orthologues的一部分,作为冠源自麝香猫优先识别灵猫ACE2相比,老鼠和人类ACE2 (31日,69年)。在小鼠,小鼠ACE2 orthologue函数作为冠进入小鼠细胞的受体,但低效的使用限制了病毒复制和传播(29日)。作为病毒在人类(负载与增加发病机理64年),很可能减毒复制为纤毛细胞表型指出文化来自不同物种与减少临床密切相关的疾病和病理指出这些替代物种。虽然同源ACE2可能部分解释这些物种的减少复制表型,分子流行病学分析认为,冠主机切换与积极的选择在S糖蛋白基因,ORF1a复制酶,和ORF3a (6)。这些数据表明,ORF1a复制酶蛋白和类属特异性的开放可能会影响复制这些替代物种的效率。需要更多的研究来确定遗传基础限制有效冠在鼠标复制,仓鼠,非人灵长类动物体外和体内模型。
呼吸道病毒感染后诱发显著不同程度的细胞病理学的体外。流感病毒感染已经导致快速和广泛的细胞病理学影响纤毛和其他上皮细胞类型,符合呼吸道上皮细胞广泛损伤与感染人类体内指出(33,74年)。合胞体形成与特征表示与不极化上皮细胞系RSV和PIV3专门目标纤毛细胞有但没有形成合胞体(73年,74年)。此外,没有后代RSV的脱落或PIV3从基底外侧表面指出,观察支持的罕见的病毒血症发病率患者感染这些病毒。考试有冠状病毒感染后的形态展示了中断和信息之间的连接纤毛细胞和周围细胞的72人感染h postinfection (S本地化细胞基底外侧区域),120 h postinfection,纤毛细胞阳性年代被剥离到腔的表面(图。8 b, C, D)。此外,冠状流尽管在低水平从基底外侧表面有可能暗示一种机制,通过这种机制与这种病毒会发生病毒血症,解释随后的病毒扩散到肠道和其他器官(无花果。4 k)(51,60)。基底的病毒传播机制隔间未知,但最有可能涉及紧密连接的破坏和扩散而不是扩散到基底细胞层。新兴市场,大量的病毒颗粒存在于纤毛细胞,在初露头角的囊泡运输支架表面,在靠近顶端表面纤毛细胞(图。6 b H)。丰富的数量的病毒粒子也被困在腔室的细胞碎片,表明细胞相关病毒可能导致冠主机之间传播。机制,指定主要非典冠状病毒粒子的极化释放尚不清楚,但将病毒颗粒释放到流明的航空公司提供了一个传播的手段通过互动传播与潜在的病毒受体也极化纤毛细胞的支架表面,例如,hACE2。类似的结果也被报道与hcov - 229 e (63年)。最近的报告表明,HCoV-NL63还使用hACE2作为进入受体细胞,这些数据表明许多目标这个途径冠状病毒复制在肺上皮细胞(23)。我们的数据也表明,冠状组装和内部发生通过出芽释放到囊泡运输到细胞表面。最终,感染导致纤毛细胞的脱落,通常包含大量的病毒(无花果。6 d、G和H)。
他们还演示了广泛的细胞病理学和感染细胞液泡化,这表明大量细胞相关病毒可能是摆脱从受感染的病人(无花果。6 d、G和H)。未来的研究将确定感染的机制调节挤压纤毛细胞有以及基因突变体的冠是否产生相似的结果。纤毛细胞含有病毒的免疫后果流到气管腔仍有待探讨。
我们已经成功删除ORF7冠基因组。非典ORF7分为两个子,指定ORF7a和7 b。尽管没有ORF7b产品被描述到目前为止,ORF7a编码122 -氨基酸1型跨膜蛋白和结构研究揭示出一个紧凑seven-strandedβ三明治相似褶皱和拓扑免疫球蛋白超家族的成员(38)。ORF7a交通量进入内质网/高尔基网络,冠状病毒出芽和组装的,暗示可能的成熟和释放作用(38)。此外,ORF7a冠已被证明编码proapoptotic活动细胞文化(58)。利用反向遗传系统冠,ORF7a和ORF7b GFP取代,展示一个豪华函数这些羊痘疮冠GFP复制州立E6, MA104, Caco-2细胞以及有。尽可能冠GFP复制有效重组野生型icSARS-CoV和Urbani冠和subgenomic mRNA表达等量,ORF7不编码的关键函数体外复制,尽管它可能会提高体内发病机制,与其他冠状病毒附件orf(被描述9,10,40)。
几个范例来解释冠的机制传播在人类肺癌。一个模型表明,冠状病毒感染肺部树突状细胞运输肺泡区域,允许II型pneumocytes的感染。这个模型是基于研究树突状细胞在感染通过与过表达的交互水平的DC-SIGN冠(35,68年)。另一种模型预测冠感染和传播通过呼吸道上皮细胞的一些组件可能发生。的确,考虑冠的早期病理观察细支气管地区和示范冠复制有效地从鼻腔和气管支气管的气道纤毛细胞隔离区域显示这里有支持这一假说。此外,均匀梯度hACE2表达整个人类肺进行航空为重复周期的病毒提供了一个合适的衬底放大和传播在整个航空公司,最终蔓延到一些细胞组成部分肺泡地区。由于后代冠是主要的支架表面上已经公布,我们建议由冠状纤毛细胞的感染传播的协调运动纤毛,为我们展示了RSV的ciliated-cell-to-ciliated-cell传播和PIV3有(73年,74年)。从特定的气道上皮细胞类型,尤其是纤毛上皮细胞,具有独特的生理和肺部先天防御功能,重要的是要确定气道细胞趋向性冠在人类肺癌为了理解的病理后果感染的细胞类型。
确认
我们感谢导演和团队UNC囊性纤维化中心的组织文化的核心,核心分子,形态和形态测量学核心提供试剂和技术专长。此外,我们感激地承认卡疫苗的技术援助中心准备的手稿和北卡罗来纳大学的公共卫生学院的重塑三级生物安全水平的实验室设施支持这些研究。特别感谢安德西扩展,玛莎科利尔生产的vrp和非典冠状结构蛋白的抗血清针对亚历山德拉Livraghi技术支持。
这项工作通过研究得到了美国国立卫生研究院的资助AI059136, AI059443-01, AI059443 R.S.B.和北卡罗莱纳大学医学R.J.P.校友捐赠基金助学金,A.C.S.是由传染性疾病发病机理研究培训资助5 t32ai07151-27通过NIH / NIAID。
脚注
- 收到了2005年7月11日。
- 接受2005年9月26日。
- 版权©2005美国微生物学会
引用
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