表皮生长因子系统调节气道粘蛋白的产生
由加州大学旧金山分校John A. Clements传达(1998年10月21日审阅)
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摘要
高蛋白细胞增生是气道高分泌性疾病的重要病理特征。然而,其潜在的机制尚不清楚,也没有有效的治疗方法。本研究表明,表皮生长因子受体(EGF- r)被其配体EGF和转化生长因子促生长因子(TGF TGF)刺激引起表皮生长因子受体(EGF- r)的变化MUC5AC在气道上皮细胞中表达体外和在活的有机体内。我们发现,MUC5AC-inducing上皮细胞系,NCI-H292,组成型表达EGF-R;egf - r肿瘤坏死因子(TNF)进一步刺激基因表达。EGF-R配体增加表达MUC5AC在基因和蛋白水平上,TNF -小鼠可增强这一效应。选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂被阻断MUC5ACEGF-R配体诱导的表达。无病原体大鼠气道上皮细胞EGF-R表达较少;气管内灌注TNF -小鼠诱导的气道上皮细胞中EGF-R,以及随后的EGF-R配体增加了杯状细胞数量、阿利新蓝-周期性酸性-希夫染色(反映粘液糖结合物)和MUC5AC基因表达,而肿瘤坏死因子,EGF,或TGF的单独没有影响。在致敏大鼠中,三次气管内灌注卵白蛋白可导致气道上皮细胞EGF-R表达和goblet细胞产生。EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522在TNF - TNF - r配体刺激大鼠和哮喘模型中预处理均可防止谷氨酸细胞的产生。这些发现表明EGF-R级联抑制剂在气道高分泌性疾病中的潜在作用。
甲状腺细胞增生是许多慢性呼吸道疾病的重要特征,包括慢性支气管炎(1)、囊性纤维化(2),和支气管扩张(3)。增生性杯状细胞分泌过多,导致气道粘膜堵塞,尤其是外周气道,大而多的分泌杯状细胞更容易造成阻塞(4,五);据报道,这一现象是急性哮喘死亡的主要原因(6)。尽管在气道杯状细胞增生的重要性,杯状细胞产生机制的分析,因为这些分泌过多疾病的异质性是困难的。因此,引起杯状细胞增生在分泌过多的疾病的机制仍然未知。
生长因子可以参与在杯状细胞的生产,因为分泌过多疾病与异常上皮细胞的生长和增殖相关。在这些生长因子中,可能的候选是表皮生长因子(EGF)与其受体(EGF-R)。EGF-R,170-kDa的膜糖蛋白,表达各种细胞的表面上,并且可以在胃(可能与粘蛋白生产7),膀胱上皮(8),以及其它上皮(9)。在气道中,胎儿表达EGF-R,在细胞增殖、分支形态形成和上皮细胞分化中起重要作用(10)。在健康成人气道中,EGF-R表达稀少。然而,EGF-R及其配体在恶性肺肿瘤中表达(11),在博来霉素诱导的肺纤维化的气道上皮细胞(12),以及哮喘(13),提示不仅在肿瘤的发病机制中,而且在上皮炎性疾病中也有潜在的作用。此外,EGF-R已知可被促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF -) (14-16),其在分泌过多疾病肺(增加17)。因此,我们推测EGF-R系统在促甲状腺精细胞的产生中发挥作用,而促甲状腺精细胞的产生可能至少在一定程度上受到TNF -细胞的调控。
在这里,我们的上皮细胞培养和报告大鼠气道上皮细胞的刺激诱导TNFαEGF-R在活的有机体内。我们表明EGF-R的的刺激通过它的配体导致的粘蛋白产生杯状细胞和大鼠该卵白蛋白敏化导致EGF-R的诱导和杯状细胞生产的气道。最重要的是,EGF-R酪氨酸激酶抑制剂防止在这些系统的每粘蛋白的生产。我们建议,EGF-R的抑制剂可用于抑制杯状细胞产生和分泌过多的疾病是有用的。
方法
体外学习。
细胞培养。在含10%胎牛血清、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100单位/ml)和Hepes (25 mM)的RPMI 1640培养基中培养人肺粘表皮样癌细胞株NCI-H292,在37℃、5% CO湿化条件下培养2水套培养箱。当汇合时,将细胞用EGF(重组人EGF,25纳克/毫升,Genzyme公司),TGFα(重组人TGFα,25纳克/毫升,Genzyme公司),TNFα(重组人TNFα,20纳克/毫升,Genzyme公司),或培养EGF加上TNFα或TGFα加上TNFα12小时,24小时,或48小时。在抑制研究,将细胞与选择性酪氨酸预处理激酶抑制剂,BIBX1522(10微克/毫升,由勃林格殷格翰慷慨提供),酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478(10μM,Calbiochem公司)或化合物56(10μM,Calbiochem公司)30分钟,然后加入生长之前因素。还检测了的血小板衍生的生长因子的选择性酪氨酸激酶抑制剂的作用(酪氨酸磷酸化抑制剂AG1295,100μM,Calbiochem公司)和酪氨酸磷酸化抑制剂的阴性对照(酪氨酸磷酸化抑制剂A1,100μM,Calbiochem公司)。
免疫印迹egf - r。
用含1% Triton X-100、1%去氧胆酸钠和10 mg/ml苯甲基磺酰氟的PBS裂解并刮除T-75烧瓶中生长的细胞。采用BCA蛋白测定试剂(Pierce)测定总蛋白。用SDS/PAGE法在8%丙烯酰胺凝胶中分离蛋白。由此产生的凝胶是平衡传输缓冲区:25毫米三⋅HCl, 192毫米甘氨酸,20%(卷/期)甲醇(pH值8.3)。然后,这些蛋白质电泳转移到硝基纤维素膜上。将膜与含0.05%吐温20的PBS中孵育1 h,与单克隆小鼠抗egf - r抗体(1:100,Calbiochem)在4℃孵育过夜。结合抗体按照亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物法(ABC试剂盒,Vector Laboratories)的标准方案可视化。使用A431细胞裂解液作为EGF-R阳性对照(18)。
EGF-R和MUC5AC在NCI-H292细胞中的免疫细胞化学定位。
8室玻片上生长的细胞用4%多聚甲醛固定1 h, PBS含0.05%吐温20,2%正常山羊血清,左旋咪索(2mm)稀释抗体。细胞与小鼠单克隆抗体孵育至EGF-R(1:50 0)或MUC5AC(克隆45 M1,1:100,新的标志物,弗里蒙特,CA)在4℃下过夜,然后用PBS洗涤3次以除去过量的一抗。然后将细胞与生物素化的马抗小鼠IgG(Vector Laboratories公司),在1温育:200稀释1小时在室温下。结合的抗体根据用于抗生物素蛋白 - 生物素 - 碱性磷酸酶复合物法的标准协议可视化。
粘蛋白分析。
细胞固定类似于免疫细胞化学技术和染色阿利新蓝/周期酸性席夫(AB-PAS)。MUC5AC蛋白测定采用ELISA法。用多次稀释的PBS制备细胞裂解液,每个样品50°l与碳酸氢盐缓冲液(50°l)在40℃下在96孔板(Nunc)中孵育,直到干燥。PBS洗涤三次,在室温下用2% BSA,分数V (Sigma)封闭1 h。PBS洗涤三次,50华度耳鼠单克隆细胞孵育MUC5AC抗体(1:100),用含0.05%吐温20的PBS稀释,滴入各孔。1 h后用PBS洗涤3次,每孔取100°l的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠lgG偶联物(1:10 000)。1小时后,PBS洗涤3次。以3,3 ',5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶溶液(Kirkegaard & Perry Laboratories)进行显色反应,并于1 M H停止2所以4。吸光度在450 nm处读取。
北方的印迹。
使用Trizol (GIBCO)从T-75组织培养瓶中培养的NCI-H292细胞中提取总RNA。总RNA (10mol / l)在1%琼脂糖/甲醛凝胶上电泳,通过毛细管印迹转移到尼龙膜(Amersham Pharmacia)上。探针(pcr - egf - r人探针模板,Ambion, Austin, TX;和人类MUC5AC,由加州大学旧金山分校的卡罗尔·巴斯鲍姆慷慨提供32P使用随机引物DNA标记试剂盒(勃林格曼海姆)。杂交按所述进行(19)。
在活的有机体内学习。
旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会批准了实验动物方案。无特异性病原体雄性F344 Fisher大鼠,体重230-250 g (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA),被保存在一个温度受控(21℃)的房间里,有免费提供的标准实验室食物和水。
健康的老鼠。
大鼠用甲氧基妥钠(布里活钠,50 mg/kg, i.p;然后让自己自然呼吸。将肿瘤坏死因子(200 ng, 100 hll)注入气管,24小时后对动物实施安乐死。EGF (600ng, 100条)或TGF条(大鼠合成TGF条,250ng, 100条)分别单独或在TNF TNF细胞(200ng, 100°l)灌注24小时后将Sigma)注入气管,48小时后对动物实施安乐死。在每个研究中,无菌PBS(100磅)注入气管作为对照。在抑制研究中,用BIBX1522预处理大鼠(3、10、30 mg/kg, i.p。,dose estimated from studies using the inhibitor to prevent cancer growth), 1 h before and 24 h after instillation of TGFα. The trachea and lungs were removed for examination 48 h after the instillation of TGFα.
敏化的老鼠。
大鼠致敏第0天及10用卵清蛋白的腹膜内注射(腹膜内)(10毫克,等级V; Sigma)中,在0.5ml的无菌盐水的用100mg氢氧化铝的复合。天20,22,和24中,卵清蛋白(0.1%,100微升)通过气管内(I.T.)滴注递送。大鼠要么安乐死没有在i.t.滴注(20天)或48小时的第三次之后I.T.滴注(26天)。探讨致敏大鼠BIBX1522对杯状细胞产生的作用,BIBX1522给予腹腔(10毫克/千克)的I.T.之前1个小时卵清蛋白的灌输和灌输到气管(10-5在第20、22和24天。BIBX1522每24小时注射一次i.p. (10 mg/kg),直至大鼠安乐死前一天。在第三次静脉输注48小时后,这些动物被实施了安乐死,切除了气管和肺。
组织准备。
在麻醉过程中预先选择时间,在120 mmHg (1 mmHg = 133 Pa)的压力下,用depc处理的PBS向体循环灌注1%多聚甲醛。对于冷冻切片,取出组织,放入4%多聚甲醛中1小时,放入30%蔗糖中低温保护过夜。组织在最佳切割温度(OCT)下进行包埋。塑料切片时,将组织置于4%多聚甲醛中24小时,脱水后包埋于JB-4 +单体溶液a中。将包埋组织切成横断面(4°m厚),置于载玻片上。
细胞分析。
上皮细胞的总数量是由在2mm以上基底层的与油浸物镜(×1000放大倍数)计数上皮细胞核确定。上皮的各分析区域下的基底层的线性长度通过跟踪基底层的数字化图像的轮廓来确定。如所描述的鉴定的上皮细胞(20.,21)。简而言之,杯状细胞呈杯状至低柱状,大部分细胞质充满丰富的ab染色颗粒。前杯状细胞含有较小的黏液染色区域(从基底膜到管腔表面的上皮<1/3高度)或稀疏的AB-PAS染色颗粒。纤毛细胞可以通过纤毛镶边、浅染的细胞质和大而圆的核来识别。无颗粒的分泌细胞呈柱状,从管腔延伸至基底板。胞浆呈浅粉红色,胞浆内可见少量小的paso阳性和ab阴性颗粒。基底细胞是小而扁平的细胞,细胞核大,位于基底板上方,但未到达气道管腔。
量化谷粒细胞的产生。
goblet细胞的产生是由上皮粘膜表面的ab - pa染色的黏液糖苷偶联物的体积密度决定的,采用的是别处描述的半自动成像系统(22)。我们测量了ab - pa阳性染色面积和总上皮面积,并将数据表示为ab - pa染色面积占总面积的百分比。该分析由公共领域NIH进行图像程序(由美国国立卫生研究院开发,可通过匿名FTP从zippy.nimh.gov或从弗吉尼亚州斯普林菲尔德的国家技术信息服务中心提供的软盘,部件编号PB95-500195GEI)。
大鼠上皮细胞EGF-R的免疫组化定位。
使用免疫组织化学染色法检测大鼠气管冷冻切片中EGF-R的定位。免疫染色与对照组相似体外研究。
原位杂交。
老鼠的cDNAMUC5AC是由卡罗尔·巴斯鲍姆慷慨提供的320 bp大鼠cDNA片段MUC5AC亚克隆入Xba一世/欣转录载体pBluescript-SK(−)(Stratagene)的dIII位点。RNA探针的制备原位杂交按所述进行(20.)。
统计数据。
所有数据均以平均值±SEM表示。使用单因素方差分析来确定组间有统计学意义的差异。菸害的F检验用于校正多重比较时,统计显著性被识别在方差分析。如果原假设的概率<0.05,则表示差异有统计学意义。
结果
TNF TNF刺激NCI-H292细胞产生EGF-R。
首先,我们确定NCI-H292细胞是否组成性地表达EGF-R。细胞裂解物的免疫印迹分析鉴定了在融合培养的NCI-H292细胞中存在EGF-R蛋白(图)。1一个)。A431细胞的蛋白为EGF-R提供了阳性对照(图)。1一个);这些细胞组成性地表达EGF-R (18)。抗egf - r抗体的免疫细胞化学分析显示,大多数细胞呈阳性,尽管有些细胞的染色比其他细胞更强烈(图)。1乙)。在NCI-H292细胞Northern印迹法表明EGF-R mRNA的表达的小组成,但TNFα上调的EGF-R的mRNA在12小时,在24小时(图加重。1C)。
EGF-R在培养细胞中的表达。(一个免疫印迹A431和NCI-H292细胞的EGF-R。细胞汇合后检测。裂解液在8%丙烯酰胺凝胶中电泳,用抗egf - r抗体印迹。标记蛋白的分子质量在右侧报道。(乙用抗egf - r抗体对NCI-H292细胞进行免疫细胞化学分析。汇合处多数细胞染色呈阳性,部分细胞染色较强烈(右侧箭头)。未见一抗,未见染色(左侧)。(Bar = 25) (Bar = 25)CNCI-H292细胞中EGF-R的北方分析使用从融合培养物中提取的总RNA与TNF蛋白(20 ng/ml)孵育12或24小时。RNA(10盎司g)在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳,转移到尼龙膜上,并与The杂交32p标记的EGF-R cDNA探针。杂交后,对膜进行清洗和自动射线照相。
egf - r配体刺激MUC5AC蛋白和基因表达在NCI-H292细胞。
EGF-R在NCI-H292细胞中组成型表达;我们评估了EGF-R配体(EGF和TGFα)的诱导粘膜糖缀合物的生产(由AB-PAS染色评价的能力的图。2:部分对照细胞呈AB-PAS染色;与EGF或TGF条状细胞孵育增加了pasi阳性染色;单独孵育TNF细胞对染色没有影响(数据未显示)。然而,TNF -去氧剂增强了EGF-R配体对粘液糖缀合物产生的刺激作用(图)。2)。具有抗免疫细胞化学分析-MUC5AC少数对照细胞细胞质染色阳性,与AB-PAS染色相似。TNF细胞和TGF细胞孵育增加了细胞的染色MUC5AC蛋白与AB-PAS染色模式相似(图)。2,较低的)。为了量化MUC5AC单独使用EGF或单独使用TGF (TGF)导致的≈增加2倍MUC5AC生产。因此,EGF-R配体诱导产生的MUC5ACNCI-H292细胞中的蛋白。单独的TNF - TNF -对in的增加作用不大MUC5AC,但TNF -去氧剂增强了EGF-R配体的作用(图)。3)。检查MUC5AC进行基因表达、北方印迹。MUC5AC该基因在对照培养基处理的NCI-H292细胞中低表达。与EGF或TGF的孵育增加MUC5AC基因表达在12h开始,在24h达到最大值。TNF单独作用没有影响MUC5AC基因表达显著增强了EGF-R配体的刺激作用;TGF - inhibitor的作用大于EGF(图)。4)。
NCI-H292细胞的AB-PAS染色用于黏液糖缀合物的鉴定(上)和免疫细胞化学分析MUC5AC蛋白(较低的)。免疫细胞化学分析与抗MUC5AC在对照状态中,抗体仅在少数细胞中呈阳性染色,与AB-PAS染色模式相似。然而,TNF细胞(20 ng/ml)和TGF细胞(25 ng/ml)孵育后,pasi阳性染色和TGF细胞(25 ng/ml)均增加MUC5AC蛋白质显著。(Bar = 50)
ELISA法MUC5AC在NCI-H292细胞。MUC5AC蛋白质的测定方法见方法。TNFα导致的表达很少MUC5AC蛋白(8.7±3.8%,ñ= 3);TGF (TGF)单独导致≈100%升高MUC5AC与TNF -细胞共孵育可增强该效应(149.5±21.7%,ñ= 6)。TNFα加TGFα的刺激作用是由每三个选择性EGF-R酪氨酸的抑制激酶抑制剂(BIBX1522,-6.0±5.5%;酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478,2.1±6.7%;化合物56,1.0±14.5%;ñ= 3),而tyrphostins (tyrphostin A1)和血小板衍生生长因子选择性抑制剂(tyrphostin AG1295)的阴性对照没有效果。
北部分析MUC5AC在NCI-H292细胞中的基因表达。总RNA从细胞中提取,和RNA的10微克进行电泳上的甲醛 - 琼脂糖凝胶上,转移到尼龙膜上,并用杂交32P-labeledMUC5AC互补脱氧核糖核酸探针。杂交后,对膜进行清洗和自动射线照相。分别用单独培养基(C)、EGF或TGF细胞(25 ng/ml)、TNF细胞(20 ng/ml)或TNF细胞与EGF或TGF细胞联合培养12 h (上)或24小时(较低的)MUC5AC基因的表达。在使用EGF- r酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522;10μg / ml;较低的);抑制剂阻止MUC5AC基因的表达。三个不同的实验显示了相似的结果。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂预防MUC5AC基因和蛋白表达在NCI-H292细胞。
为了验证EGF-R的激活导致的假设MUC5AC基因和蛋白表达,细胞与各种酪氨酸激酶抑制剂孵育。用选择性激酶抑制剂(BIBX1522, AG1478,化合物56)对NCI-H292细胞进行EGF-R预处理,可以防止其染色增加MUC5AC通常与EGF-R配体发生的蛋白质(图)。3)。血小板衍生生长因子的选择性酪氨酸激酶抑制剂(AG1295)和tyrphostins的阴性对照(A1)无效(图。3)。北方分析,BIBX1522完全被抑制MUC5ACTNF - TNF -和EGF-R配体联合引起的基因表达(图)。4)。这些结果暗示EGF-R酪氨酸激酶的激活在诱导MUC5ACNCI-H292细胞中基因和蛋白的表达。
TNFα刺激EGF-R生产大鼠航空公司。
在该控制状态下,气管上皮数载EGF-R阳性细胞(图五一个,左)。然而,气管内灌注TNF - 3诱导的EGF-R蛋白在气管上皮中(图)。五一个,正确的)。
无病原体大鼠的EGF-R抗体免疫组化分析。(一个)肿瘤坏死因子α治疗老鼠。对照组EGF-R染色少(左);24h after intratracheal instillation of TNFα (200 ng, 100 μl), EGF-R-positive staining was present in goblet cells (G), pre-goblet cells (P-G), nongranulated secretory cells (S), and basal cells (Ba), but not in ciliated cells. (Bar = 50 μm.) (乙卵白蛋白致敏。经三次气管内灌注卵清蛋白(0.1%,100血清)后,在杯状细胞和前杯状细胞中强烈表达EGF-R免疫反应性(左),与AB-PAS阳性染色(正确的)。(Bar = 50)
EGF-R配体在粘液糖缀合物的产生和MUC5AC大鼠的基因表达。
对照组气管上皮中杯状细胞和前杯状细胞较少。气管内灌注EGF- r配体(EGF或TGF)对杯状细胞的产生没有影响(见表)1)。但先给予TNF -细胞,24小时后再给予TGF - TGF或EGF(数据未显示),杯状细胞和杯前细胞数量明显增加;非颗粒状分泌细胞和基底细胞的数量显著减少,而细胞总数和纤毛细胞的数量没有变化(见表)1)。原位杂化的MUC5AC该基因在对照动物中未见表达。当气管内注入TNF小鼠,随后EGF或TGF小鼠,表达MUC5AC在上皮中可见(数据未显示)。因此,单独诱导EGF-R或单独由EGF-R配体刺激不足以诱导goblet细胞的产生。然而,在TNF -小鼠诱导EGF-R后,注入EGF-R配体可明显刺激goblet细胞的产生。
大鼠卵清蛋白致敏可诱导EGF-R和goblet细胞的产生。
在第0天和第10天注入卵白蛋白,没有改变上皮细胞总数,也没有增加杯状细胞或前杯状细胞的数量(见表)1)。然而,当在第20、22和24天进行三次卵清蛋白i.t.灌注时,与对照组相比,上皮细胞总数显著增加。杯状细胞和前杯状细胞数量明显增加,纤毛细胞和基底细胞数量不变(表)1)。因此,卵清蛋白i.p.和卵清蛋白i.t.分别引起杯状细胞增生。抗egf - r抗体免疫组化研究显示对照组气管未染色(数据未显示)。对i.p.和i.t.均敏感的动物显示EGF-R染色(图)。五乙,左)在AB-PAS阳性染色的细胞中有选择性地表达(图五乙,正确的)。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522可以防止TNF - TNF和EGF-R配体的灌注以及大鼠卵白蛋白致敏引起的谷氨酸细胞的产生。
由于BIBX1522可以抑制培养细胞中粘蛋白的产生,因此我们在无致病大鼠中检测了该抑制剂的作用。经气管灌注肿瘤坏死因子(TNF)和EGF-R配体(TGF)后,Alcian blue-PAS染色呈上升趋势,而BIBX1522预处理后,Alcian blue-PAS染色呈剂量依赖性抑制(图)。6一个)。同样,卵清蛋白三次i.t.灌注可显著增加谷氨酸细胞的生成,而BIBX1522预处理可抑制谷氨酸细胞的生成(图)。6乙)。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522)对杯状细胞产生的影响(表达为ab - pasi阳性染色细胞占据气道上皮细胞的%染色面积)。(一个)刺激TNF - TNF - (200ng, 100horchl)。气管灌注肿瘤坏死因子(TNF -)和EGF-R配体及TGF (TGF)显著增加了goblet细胞的生成(ñ= 5;∗,P< 0.0001),该效应被BIBX1522预处理(3-30 mg/kg, i.p.)剂量依赖性抑制(ñ= 5;P与TNF组、TGF组比较:†,P= 0.003;组合,P< 0.0001)。(乙卵白蛋白致敏。动物在支气管上皮给予卵清蛋白腹膜内(i.p.)仅显示出很小的AB-PAS阳性染色。动物先用卵清蛋白(OVA)敏化的腹膜内,接着是三个气管内(I.T.)OVA的滴注,表明在AB-PAS阳性染色的显着增加(ñ= 5;∗,P< 0.0001)。BIBX1522预处理(10 mg/kg, i.p.)抑制了ova诱导的杯状细胞的产生(ñ= 5;组合,P< 0.0001)。
讨论
我们通过使用NCI-H292细胞研究EGF-R及其配体的作用,粘蛋白生产气道上皮细胞(23),并通过使用无病原体的老鼠的气管含有少量杯状细胞。TNFα诱导NCI-H292的细胞和大鼠呼吸道上皮细胞既EGF-R的表达。通过TNFαEGF-R的诱导后,通过其配体EGF-R的后续刺激导致MUC5AC在基因表达和蛋白水平上的生产。EGF-R酪氨酸激酶选择性抑制剂被阻断MUC5ACTNF - TNF + EGF-R配体引起的基因和蛋白表达,提示EGF-R信号通路参与其中MUC5AC生产。
由TNFα采取行动的机制MUC5AC基因和蛋白表达在NCI-H292细胞,需要讨论。在我们的研究中,TNFα单独对影响不大MUC5AC尽管有一项研究报道TNF -小鼠可诱导粘蛋白的产生MUC2基因表达(24)。我们的研究结果表明,TGF - inhibitor对TGF有较大的影响MUC5ACTGF与TNF细胞共孵育可显著增强TGF细胞的作用。肿瘤坏死因子(TNF) + TGF (TGF)对小鼠的影响大于加物。TNF -的增强作用可能是EGF-R的上调。事实上,TNF - TNF导致NCI-H292细胞中EGF-R基因表达;在A431细胞中也有类似的发现(15)、人类胰腺癌细胞(14)和表皮角质形成细胞(16)。EGF-R酪氨酸激酶的抑制作用被完全阻断MUC5ACTNF - TNF和EGF-R配体引起的基因和蛋白表达,在TNF -TGF -TGF的反应中暗示了EGFR途径。另外两种选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(AG1478和C56)也具有抑制作用MUC5AC蛋白质生产,类似于BIBX1522。然而,选择性血小板来源的生长因子酪氨酸激酶抑制剂(AG1295)和tyrphostins的阴性对照(A1)没有效果,暗示EGF-R酪氨酸磷酸化是诱导的信号通路MUC5AC表达。
本研究结果还表明了基于EGF-R的表达杯状细胞生产的演变可能的序列:刺激用TNFα诱导的强烈的EGF-R染色nongranulated分泌细胞;其由EGF-R配体随后的活化引起的渐进染色粘液糖缀合物,和所述细胞变成“预杯状”,然后“杯状”细胞。TNFα的滴注,随后诱导杯状细胞生产EGF-R配体而不改变上皮细胞的总数量,这表明EGF-R激活促进选择性细胞分化(未增殖)。这些结果表明,杯状细胞从表达EGF-R和由EGF-R配体刺激产生粘蛋白分泌nongranulated细胞衍生的。在我们的研究中,过敏引起的增加气道上皮细胞的总数量的相关杯状细胞产生,而TNF-α和TGF-α的滴注引起杯状细胞产生,但不上皮增生。这种差异的原因之一可能是刺激政策退出后的持续时间。为差异的第二个原因可能是因为另一介体的存在导致在致敏动物上皮细胞增生,如白三烯,其在哮喘气道中增加的(25)。我们发现EGF-R在正常气道上皮细胞中不表达,但在致敏气道中表达。染色的细胞为前杯状细胞和杯状细胞,提示EGF-R参与了杯状细胞的产生。BIBX1522预处理可抑制气道杯状细胞的产生,证实了EGF-R活化在实验性哮喘中对杯状细胞产生的作用。然而,还有两个问题。(一世) EGF-R的表达机制:TNF - TNF TNF是可能的候选者;它由肥大细胞(26)、中性粒细胞(27),和巨噬细胞(28)和在有症状的哮喘患者获得的支气管肺泡灌洗液中升高(29);和(2EGF- r配体的来源:在哮喘患者中,有报道称上皮细胞表达EGF (13);另一种可能的来源是白细胞,嗜酸性粒细胞,因为(30.)、中性粒细胞和单核细胞(31产生EGF-R配体。在我们的研究中,卵白蛋白致敏的i.p.并不会引起goblet细胞增生,但是在致敏大鼠气道中注入卵白蛋白会导致白细胞招募(32),引起杯状细胞的生产。这一结果表明在白细胞中的可能作用为EGF-R配体的来源。
先前的研究表明,各种刺激,如臭氧(33), 二氧化硫 (34),病毒(34),脂多糖(33,35)及血小板活化因子(20.)上调粘蛋白的表达和分泌。近年来,黏液蛋白下游信号通路引起黏液2表达的诱导铜绿假单胞菌证实通过c-Src-Ras-MEK1/2-MAPK-pp90rsk途径(36);我们建议EGF-R可为那些响应的上游信号。另外的研究将需要评估各种炎性刺激的对EGF-R系统的关系。
分泌过多是许多慢性炎症性呼吸道疾病的主要表现。目前,还没有有效的疗法来缓解症状和阻止这些疾病的进展。我们的发现提供了一种机制和治疗策略:通过抑制EGF-R的激活,可以阻止goblet细胞的产生。抑制EGF-R的激活被认为是高分泌性气道疾病的治疗方法。这一概念在人类身上的验证将需要在高分泌性疾病患者身上进行测试。
致谢
这项工作部分得到了国家心肺血液研究所计划项目HL-24136的资助。
缩写
- 表皮生长因子,
- 表皮生长因子;
- egf - r,
- 表皮生长因子受体(s);
- 过渡政府α,
- 转变增长模式;
- TNFα,
- 肿瘤坏死因子α;
- AB,
- 阿尔新蓝;
- 不是,
- 周期性acid-Schiff
- 收到了1998年10月21日。
- 公认1998年12月31日。
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