评估黏膜纤毛的运输单粒子体内显示变速和偏爱腹侧气管在新生儿的猪
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2013年12月27日,由迈克尔·j·威尔士(发送审查2013年11月20日)
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意义
黏膜纤毛的运输(MCT)维护肺去除颗粒,和有缺陷的MCT假设导致肺部疾病如哮喘的发作,慢性支气管炎,囊性纤维化。然而,测试这些假设已经被当前的MCT化验和有限的人类疾病的小鼠模型。我们开发了一个在新生儿体内特定试验猪、分享与人类生理和解剖特点。的X-ray-computed tomographic-based方法提供高空间和时间分辨率。我们发现颗粒优先旅行腹气道表面。我们还发现异质性的单个粒子运动,表明其特定不可能涉及均匀粘液毯。数据可能援助的粒度对MCT和疾病发病机制的理解。
文摘
黏膜纤毛的运输(MCT)是一个天生的防御机制,可去除微粒,有害物质,从肺和微生物。一些呼吸道疾病表现出异常的MCT,包括哮喘、慢性支气管炎和囊性纤维化。然而,它仍不确定是否特定异常导致疾病的起源或是否二次表现燃料疾病进展。当前MCT化验的局限性和当前的人类疾病动物模型在解决这些问题阻碍了进步。因此,我们开发了其特定的体内试验,在这里,我们描述用于新生儿野生猪。我们研究了猪因为他们分享许多生理、生化和解剖特性与人类和一些人类疾病模型。我们用x射线multidetector-row-computed断层追踪单个粒子的运动新生猪的大型航空公司。Multidetector-row-computed断层成像提供了高时空分辨率和粒子位置登记气道解剖。我们发现纤毛取向指导粒子腹侧气管表面。我们还观察到明显异质性个体粒子的速度运动,我们推测,粘液性质的变化可能是负责任的。 The increased granularity of MCT data provided by this assay may provide an opportunity to better understand host defense mechanisms and the pathogenesis of airway disease.
黏膜纤毛的运输(MCT)取决于协调殴打纤毛推动粘液肺(1⇓⇓- - - - - -4)。在大型哺乳动物肺、多种细胞类型参与特定轴;杯状细胞和粘膜下腺体分泌粘液,气道上皮细胞和粘膜下腺体控制气道表面液体的数量和组成,并通过纤毛推动粘液纤毛上皮细胞跳动。MCT作为防御机制的重要性在人原发性纤毛运动障碍;他们的纤毛不协调或缺乏一个有效的中风(5⇓- - - - - -7)。因此,特定中断,进步的呼吸道感染和支气管扩张接踵而来。有缺陷的MCT也被认为有助于其他呼吸道疾病,包括囊性纤维化(8⇓⇓- - - - - -11),哮喘(1,12)和慢性支气管炎(1,13)。虽然MCT可以在这些疾病有缺陷,但仍不确定特定轴是否从一开始就异常和导致疾病起始后是否MCT变得异常疾病的发作,然后加速损伤。理解异常MCT的贡献的呼吸道疾病的起源受到当前MCT化验的局限性和目前疾病的动物模型。
体内特定的化验检查运输的优势生理的气道细胞类型包括与自然气道黏膜下腺体和加湿。目前,最常用的体内特定试验包括吸入气溶胶含有放射性标记的粒子,然后保留的放射性肺记录随时间(14)。这个过程帮助呼吸道疾病的理解和被用来评估治疗干预人类(15,16)。虽然有试图改善分析,当前的方法有局限性。例如,空间分辨率是限于中央与周边肺部区域的描述详细的解剖信息,时间分辨率是有限的,只有一小部分的radioaerosol从肺部清除在研究过程中,和cough-induced间隙可以混淆化验。因此,检测异常的疾病是很困难的。MCT也被评估通过将聚四氟乙烯气管表面和视觉上的磁盘分析他们的运动通过支气管镜(17⇓⇓- - - - - -20.)或通过胸部x光片(21)。这些体内试验的局限性阻碍了能力调查肺病发作。
体外和体外化验MCT提供优势的能力控制基底外侧的解决方案和执行药理操纵(22⇓- - - - - -24)。在培养的气道上皮细胞,缺乏黏膜下腺体,液体和粘液的约束不能进入或离开文化,半月板结构培养的上皮细胞,造成的影响人工控制湿度,要求调查人员必须添加液体文化评估纤毛运动材料的限制(22)。体外制剂,顶端表面的清洗和人工加湿可以构成挑战。
在这项研究中,我们调查了MCT在猪身上,提供优势评估MCT在健康和疾病的老鼠。例如,猪的细胞类型和解剖学航空公司比小鼠更接近人类的航空公司(25⇓⇓⇓⇓- - - - - -30.)。纤毛细胞人类航空公司占主导地位,而克拉拉细胞组成∼60%的小鼠气道上皮细胞(25,31日)。新生鼠的气道纤毛细胞和没有可辨别的不多MCT (32)。鼠标intralobular航空公司缺乏粘液和浆液性细胞中发现的人类(31日)。黏膜下腺体的成熟和发展的模式在猪与人类相媲美(25,27,28,33)。猪在气管和支气管黏膜下腺体,而老鼠只有一些附近的黏膜下腺体喉和气管上(34,35)。此外,猪的大小比老鼠更接近人类,猪呼吸道的解剖分布概括人类(25),猪和人类的粘膜下腺体似乎使用相同的途径来控制和调节分泌36,37)。猪也可以提供模型的呼吸道疾病,如囊性纤维化(38⇓⇓⇓⇓- - - - - -43)。
我们的目标是开发一个体内试验的MCT符合几个标准:研究适应新生的猪,有空间分辨率测量单个粒子,获得的数据在三维空间中,达到很好的时间分辨率,寄存器MCT气道解剖,并使用自然气道加湿。
结果
高分辨率的胸部多层螺旋ct追踪个人钽粒子体内。
测量MCT我们开发了一个multidetector-row-computed层析(MDCT)的测定。在镇静新生的猪,我们仅放置导管通过声带,吹进不透射线的磁盘到空气一阵的航空公司,并立即删除导管(无花果S1。一个)。我们使用350×25-μm钽磁盘,因为他们是radiodense和惰性。小猪是仰卧位和通过鼻子呼吸自然。三个16个粒子存在于开放下的航空公司在一个位置正确的脑叶,我们作为解剖标志。我们收购了体积的多层螺旋ct扫描apical-basal肺的程度每15年代为共有40扫描(10分钟无花果S1。B)。然后我们确定单个粒子在三维空间(图1一个- - - - - -C)。
![图1所示。](https://www.pnas.org/content/pnas/111/6/2355/F1.medium.gif)
新生猪的多层螺旋ct扫描跟踪粒子在航空公司。磁盘比周围组织radiodense钽和出现明亮的白色点(红色箭头)在横向(一个)、冠状(B)和saggital (C多层螺旋ct扫描的)部分。磁盘比他们显得更大,因为溢出效应。
我们重建了气道解剖和粒子位置;图2一个和电影S1显示ventral-dorsal图像从一个动物。符号和线条的一个单一的颜色代表单个粒子的路径。符号表示每隔15秒一个粒子的位置,和线连接的点。粒子朝着喉部或固定;他们从不搬远侧地。相同的侧面视图气道重建表明,粒子优先前往气管的腹侧表面(图2B和电影S2)。
![图2所示。](https://www.pnas.org/content/pnas/111/6/2355/F2.medium.gif)
单个粒子的航空旅行刚出生的猪。图像重建ventral-dorsal (一个)和横向(B)航空公司的观点。单个粒子被表示为不同颜色的球体;球体的领域是∼实际粒子的25倍。线连接球体粒子显示路径旅行气道。
单个粒子运动速度显示大量的异构性。
单个粒子平均旅行速度6.9±0.7毫米/分钟(±SEM, 57粒子7猪)。这个速度类似于先前发表在切除猪气管(2.3毫米/分钟通过粒子传输(24)和5.4毫米/分钟的光学相干断层扫描(44)]。然而,平均速度掩盖了大量的异构性。图3一个显示了单个粒子的平均速度。在一个动物(红圈)的平均速度最快的移动粒子∼4倍的平均速度取决于最慢的粒子。单个粒子的最大速度显示相同的变化(图3B),所有动物的数据显示最大和平均粒子速度的变化。
粒子运动速度是异构的。数据在新生儿猪钽粒子的速度。每个符号表示一个不同的动物,和多个点相同的符号代表单个粒子从相同的动物。n= 7猪。每个点代表一个单独的粒子的平均速度(一个)和最大速度(B)。栏显示的意思。均值和最大磁盘速度没有纠正动物运动。我们测量了解剖标志的运动的速度范围,他们的灰色框所示一个和B。
所有粒子运动组件指向喉,但有时,一些粒子是不动的。在六个七动物的所有粒子表现出一些运动。然而,在一个猪,一半的粒子先进向喉,一半都没有展现运动。大多数粒子仍在运动在整个跟踪期间,但一些粒子固定的一部分追踪期间(图4一个)。对于那些粒子固定至少1分钟,静止期发生的跟踪期在52%的情况下。图4B显示了一个示例六粒子在一个动物。的两个粒子(# 4和# 6)被静止时间超过3分钟,然后开始行动。此外,单个磁盘的速度改变了在扫描期间。经常运动的速度运行过程中增加(图4B)。例如,跟踪的速度在第一分钟慢于在第三分钟33%的粒子(n= 43粒子)。然而,我们也观察到颗粒偶尔放慢和/或暂时停止运行过程中(图4B)。
单个粒子的速度随时间。(一个)直方图显示的时间百分比,粒子移动扫描期间或者直到他们高于肺的顶点。例如,两个粒子在10分钟扫描期间没有动。(B)的例子显示六个粒子的位置(编号1 - 6,黑色)与rostral-caudal轴。解剖标志是肺的顶端(TL),对颅叶支气管(RC)和船底座(CA)。距离远的船底座有负值。
颗粒优先去腹侧气管。
评估粒子位置圆周的航空公司,我们建立了极坐标系统的气道腔从横剖面当作是一个圆,最腹点是0度,最圆的背点是180度(图5一个和电影S3)。我们绘制的位置在气道周长的粒子在第一扫描和过去扫描之前退出该领域向喉或最后10分钟扫描周期(图5B)。在第一次扫描,颗粒均匀分布在整个气道周长。然而,通过过去的扫描,他们分组向腹侧导气管的一部分。角位置对粒子的速度几乎没有影响(图6)。
粒子被运送到了腹侧气管表面独立于动物的位置。(一个)气道示意图显示位置度。程度给出坐标作为绝对的值没有指定向左或向右。(B)径向位置10分钟扫描周期的开始和结束。粒子转移到一个更腹位置扫描期间(n= 7猪,55粒子,P≤0.0001,成对的学生t测试)。(C)径向位置10分钟扫描周期的开始和结束两个小猪研究倾向然后仰卧的姿势。单个粒子没有跟踪,和一些已经离开了在最后扫描扫描区域。
![图6所示。](https://www.pnas.org/content/pnas/111/6/2355/F6.medium.gif)
角位置对粒子的速度几乎没有影响。数据是极坐标位置x轴和粒子速度的y轴。n7 = 55粒子的动物。
这些研究,动物是懒散的,因此ventral-directed运动相反的方向的重力。进一步测试重力的影响,我们研究了两个动物的卧姿。腹侧偏好保存在那个位置(图5C)。因此,粒子表现出强烈gravity-independent腹侧偏好的运动。
取向腹气道纤毛击败指导粒子的表面。
我们假设纤毛的方向打腹侧粒子运输负责。为了验证这一点,我们删除段气管,打开它们与纵向削减罕见或背,平在克雷布斯HCO安装它们−3/公司2缓冲盐,用反射光视频显微镜来确定方向的纤毛跳动。我们策划rostral-caudal轴之间的角度和方向矢量的纤毛打败图7一个)。在腹侧气管表面,纤毛是面向rostral-caudal平行轴(图7B)。然而,当我们测量位置远离腹侧表面纤毛取向,打方向的一个组成部分,是直接向腹侧气管。我们观察到类似的方向性而不管气管打开罕见或背。
纤毛取向决定了腹侧定向粒子运动。纤毛取向和拍频测定体外使用反射光视频显微镜平支架气管。(一个)示意图显示了纤毛的取向。(B)数据纤毛取向(ω)表示在气管周长的立场。数据从一个动物。n每个数据点= 7 - 16细胞;平均数±标准差。类似的结果在其他三个动物。(C)数据在表明立场气管纤毛拍频周长。数据从一个动物。n每个数据点= 15 - 30细胞;平均数±标准差。类似的结果在其他三个动物。
我们还发现纤毛拍频相对类似的气管周围围(图7C),与观测一致,粒子运动的速度几乎没有影响气管周长。因此,纤毛击败指导粒子的取向向腹侧表面和喉。
讨论
在这项研究中,我们开发了一个MDCT-based分析方法来衡量MCT在新生儿体内的猪。的能力来跟踪单个粒子在三维空间和时间分辨率高让我们发现异质性在MCT,与动物之间的粒子运动速度的变化,单个粒子之间的一种动物,在单个粒子的运动在不同的时间。方法还透露,粒子旅游优先气管的腹侧表面。
单个粒子的运动是高度可变的。
能够跟踪离散粒子在肺显示单个粒子之间的异质性在特定轴速度和在运输过程中单粒子。有几个因素可能导致异质性。首先,纤毛拍频的变化可能会影响其特定的速度。然而,这看起来不太可能,因为我们发现拍频相对相似的多个地区的气管。第二,变量的深度periciliary液体可能是负责任的。在早期的研究中,我们显示大幅变化的深度periciliary液体在新生儿猪(45)。因为我们观察到单个粒子在同一面积气管速度不同,要么periciliary液体深度不是一个重要的因素在未经中华人民共和国交通部负责异质性,或periciliary液体深度变化在一个高度动态和识别的方式。第三,粘液的属性或数量的变化或协会的光盘与粘液可能导致异质性在其特定的速度。例如,有报道称,利率大幅变化的个体黏膜下腺体分泌物(46粘膜下腺体分泌物),粘度(47),气管粘膜厚度(45,48)。我们还推测,当地粘液性质或丰度的变化可以解释观察到颗粒有时慢,因为他们通往喉。也许磁盘达成区域从黏膜下腺体分泌粘液尚未脱离它的起源,从而减慢进步的粒子。这种变化表明,气管,至少在新生儿,不可能由一个连续,均匀的粘液(49)。如果是这样的话,我们会期望一个更统一的运动速度。相反,粘液可能作为群岛或离散单元功能,运动的速度可能会有所不同甚至在类似气道地区。
纤毛取向优先移动粒子的腹侧气管表面去除新生儿肺的猪。
我们发现粒子前往腹侧气管表面进展向喉。这ventral-directed流模式让人想起流从一个入站在州际高速公路上的汽车。,腹侧气管墙类似于高速公路,和背侧墙是类似于入口点。然而,在高速公路系统相比,粒子速度是独立的位置。
纤毛跳动的方向一定是建立在胎儿出生后立即因为它是礼物。因此,它不能归咎于重力在开发过程中,在测试期间不gravity-dependent。虽然一组核心的已知平面细胞极性蛋白建立气道纤毛的取向,全球方向线索仍然不确定50)。也许纤毛的模式取向的猪可以促进发现负责信号。
腹侧偏好MCT在猪与狗早期的研究;支气管镜的观察表明,当从上空俯瞰,粒子移动的顺时针或逆时针方向在几个狗)取向在气管和背表面的一些积累,他们向头部地(18,19,51)。猪,黏膜下腺体中最丰富的背墙,其次是腹侧和侧墙(52)。这个分布和频率相对独特的实验室动物中,优惠背侧和腹侧分布类似于人类(53)。我们推测,背分泌粘液环绕着气管最大限度地捕获微粒,然后集中在一个较小的区域罕见。以这种方式收集粘液而不是让它在气管周长均匀可能使它更容易受到空气所产生的剪切力咳嗽,因此促进肺部遭到驱逐。狗,罕见分泌粘液可能相反的模式。
这种方法用于测量特定有优点和局限性。
我们的方法有几个优点。在这体内方法中,小猪呼吸自发通过鼻子正常气道保持湿润。通过使用体积多层螺旋ct扫描和记录每隔15秒离散粒子的位置,我们能够获得高空间和时间分辨率。使用多层螺旋ct扫描也允许我们注册气道解剖位置的粒子。与其它成像方法,增加的粒度数据显示有趣的特定模式。
这种方法也有很多局限性。(我)的辐射与放射性标记的气溶胶在这项研究中大于使用,因此不能接受的供人类使用。(二世动物是镇静。我们使用氯胺酮和乙酰丙嗪首次异丙酚镇静,然后保持镇静。先前的研究表明,这些药物不可能改变其特定,纤毛拍频或粘液分泌(54⇓- - - - - -56)。(三世)钽粒子的大小(350×25μm)大于细菌和一些微粒,进入肺部。然而,研究使用其他方法和更大、更小的微粒表明MCT不显著改变粒子大小,虽然小粒子可能被巨噬细胞摄取(51,57,58)。此外,早期的研究范围的中华人民共和国交通部负责运输率报告,包括我们测量(59,60)。(四世)方法不评估小航空公司;我们目前只有沉积粒子从气管第三代航空公司。然而,学习更多远航空公司可能是有价值的。尽管大多数呼吸道疾病涉及这两个小型和大型航空公司建立了疾病之后,所知更少的分布异常疾病的发作。(v)粒子沉积在呼吸道的数量很小,可能因此错过了额外的复杂性。然而,我们使用少量充分区分单个粒子,因为他们先进的气道。
结论意见。
我们预计,这种方法可以用于多个应用程序。因为它的灵敏度,它可能是价值的揭示野生动物和那些疾病之间的差异,包括囊胞性纤维症,哮喘和慢性支气管炎。这些方法可能特别有用在病程早期,和评估的能力异质性可以提供洞察病理生理机制。它也可以用于评估干预措施的响应可能改变其特定过程的各个组件的功能,包括纤毛,食用的杯状细胞和粘膜下腺体,transepithelial电解质运输气道上皮细胞。最后,探索MCT在猪更大的分辨率可以帮助指导人类努力改善MCT化验。
材料和方法
动物。
新生儿野生型国内猪被用于这些研究。猪与IV euthasol安乐死(Virbac)注入双边胸廓切开术紧随其后。所有动物协议是由爱荷华大学的批准机构动物保健和使用委员会。
体内黏膜纤毛的交通分析。
钽磁盘(350×25-μm)穿孔的钽箔(σ)。平均粒子质量为55µg。新生儿头猪被麻醉与20毫克/公斤氯胺酮和2毫克/公斤乙酰丙嗪静脉,然后镇静与静脉注射异丙酚维持。猪通过鼻子呼吸自然。提供钽粒子,动物上呼吸道的简要,15 - 30钽磁盘被吹进到肺的吹气(无花果S1。一个)。粒子后立即交付,导管移除。评估粒子运输、胸部的连环三维图像获得高分辨率多行的探测器计算机断层扫描仪(西门子Somatom Flash双重定义源128 -片计算机断层扫描(CT)扫描;无花果S1。B)。MDCT-generated医学数字成像和通信(DICOM)图像是用一片深度0.6毫米和一片间隔为0.3,以确保钽粒子的可视化。除非指定,扫描与猪进行仰卧位。在10分钟收购期间,共有40扫描拍摄15秒间隔扫描。钽粒子,典型Hounsfield单位500年,很容易分辨从气道周围组织,Hounsfield单位约200−(图1一个- - - - - -C)。单个粒子被分配手动跟踪三维笛卡尔坐标与时间价值取决于扫描(x,y,z、时间)使用ImageJ DICOM图像分析。为了避免改变气道表面由于输送导管的存在,颗粒没有跟踪一旦他们旅行肺尖的位置之上。只有交付超出了对颅叶颗粒都跟踪提供足够的距离适当分析运输。来确定粒子的速度,我们测量粒子移动的距离在一个已知的时期。自主呼吸的运动可能混淆的传输速率。为了避免这种情况,我们确定的平均位置三个解剖标志在每个猪:正确的颅叶开(RC),船底座(CA)和肺顶点(美联社)。我们丢弃任何扫描三个地标的位置倾斜超过1毫米的平均位置的地标。然后我们使用随后扫描计算速度。这个修正删除2.5%的扫描。
计算速度使用15秒间隔夸大任何动物运动速度的贡献。因此,在计算速度、减少噪音我们测量粒子位置每15年代和60年代间隔用来计算速度。这些方法生成的多个测量每个粒子的速度。我们使用下面的方程来计算粒子的速度。
在哪里n指的是扫描的数目,x,y,z代表笛卡尔坐标(x,左右;ydorsal-ventral;z、rostral-caudal)和t代表时间在几分钟内。
在一些例子中,我们显示速度的最大粒子速度,速度的最高价值生成的单个粒子。在其他情况下,我们显示平均速度,这是所有速度值的平均值由单个粒子生成的。多个粒子速度测量个体动物允许我们显示速度值比有总粒子;这是在速度和角位置的评估。只有粒子超过3毫米被包含在旅行速度和角位置的评估。
评估有多少粒子的送到一个气道不动,我们决定有多少粒子移动小于3毫米的扫描间隔10分钟。3毫米是一个保守的估计,否定一个工件的可能性从动物运动将导致一个不正确的固定粒子的得分。
量化一个粒子的位置相对于ventral-dorsal轴,我们开发了一个径向坐标系统。使用横向多层螺旋ct部分,呼吸道被当作一个圆,最腹部分气道被指定为径向坐标0度,和最背的方面被指定为180度。来确定粒子的径向坐标与气管,二维笛卡尔坐标是以下几点:气道腔的中心的位置(Xc,Yc),最腹气道的位置(X一个,Y一个),气道表面粒子的位置(Xp,Yp)。从这些点,我们决定粒子的径向位置使用以下方程来源于余弦定理:
径向坐标的绝对值表示没有指定的右边或左边气道。一组实验,我们研究了圆盘的径向坐标时间0和10分钟的猪和懒散的职位。在实验中,一些粒子可能离开跟踪区域,并不包括在10分钟的时间点。
体外纤毛取向和拍频分析。
驴纤毛定位体外、动物安乐死,并立即长1厘米的气管环近端向右颅叶支气管切除和放置在克雷布斯伪专家解决方案包含(115毫米)氯化钠,25 NaHCO310葡萄糖,2.4 K2HPO41.2 CaCl21.2 MgCl20.6 KH2阿宝4pH = 7.3, 5%(/卷卷)有限公司2在冰上为1 - 4 h。研究纵向切口跨越气管环的长度是最腹侧或背的环矩形薄板。气管上安装持平,寄到牙科蜡,冲洗,然后浸在37°C克雷布斯伪溶液pH = 7.3 / 5%股份有限公司2。我们使用反射光可视化纤毛运动(尼康A1R共振扫描共焦显微镜,25×客观(电荷耦合器件(CCD)相机,尼康成像系统软件(NIS)元素,200帧/ s)。我们分析了1 s视频剪辑(NIS元素)来确定纤毛取向和拍频。量化的方向纤毛我们确定轴的夹角纤毛击败和rostral-caudal平面(图7一个)。量化纤毛拍频,我们清点的数量反映了区域的照度变化周期纤毛细胞在一个已知的时期。
统计分析。
腹侧的评估是由成对的偏好t测试假设dorsal-ventral运动是独立于个人的小猪。
确认
我们感谢伊丽莎白Allard,卢卡斯Askland Suifang毛,特蕾莎梅休,詹姆斯•McMenimen安德鲁•Michalski Sean Mobberly Thomas O早间,琳达Ostedgaard, Leah Reznikov病毒Shah Jered Sieren,彼得·塔夫脱。这项工作是由美国国立卫生研究院(NIH) (HL051670, HL091842 DK054759),囊性纤维化基金会和囊性纤维化基金会黏膜纤毛的清除财团。支持D.A.S.基科学研究学者计划在囊性纤维化和美国国立卫生研究院(DP2 HL117744)。M.J.W.霍华德休斯医学研究所的研究员。
脚注
- ↵1人信件可能得到解决。电子邮件:michael-welsh在}{uiowa.edu或david-stoltz在}{uiowa.edu。
作者的贡献:M.J.H.,硕士,“,O.A.I., D.A.S., and M.J.W. designed research; M.J.H., M.A., E.N., O.A.I., A.J.F., A.J.T., and R.J.A. performed research; G.M. and E.A.H. contributed new reagents/analytic tools; M.J.H., M.A., A.J.F., A.J.T., D.A.S., and M.J.W. analyzed data; and M.J.H., D.A.S., and M.J.W. wrote the paper.
作者宣称没有利益冲突。
这篇文章包含支持信息在网上www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 pnas.1323633111 /——/ DCSupplemental。
引用
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- 父类风湿性关节炎
- Mariassy在
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- 西姆斯德,
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- 斯图尔特WC
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