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CD209L (L-SIGN)是严重急性呼吸综合征冠状病毒的受体gydF4y2Ba
编辑:Peter Palese,西奈山医学院,纽约,纽约州(2004年5月28日接收审查)gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
血管紧张素转换酶2 (ACE2)是引起严重急性呼吸综合征的新型冠状病毒SARS-CoV的受体[Li, W. Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. a ., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C.,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2003)gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba426年,450 - 454]。我们已经确定了一种不同的人类细胞糖蛋白,可以作为SARS-CoV的替代受体。将人肺囊性口炎病毒G型伪逆转录病毒cDNA文库转入中国仓鼠卵巢细胞,并对细胞进行筛选,使其与可溶性SARS-CoV spike (S)糖蛋白、S结合gydF4y2Ba590gydF4y2Ba和SgydF4y2Ba1180gydF4y2Ba.将结合SARS-CoV S糖蛋白的转译细胞克隆接种SARS-CoV,通过多重RT-PCR在4个克隆细胞系中检测到亚基因组病毒RNA在1-16 h或更长时间内的增加。对人肺cDNA插入物的测序显示,每个克隆细胞系都含有编码人CD209L的cDNA,这是一种c型凝集素(也称为L-SIGN)。克隆2.27中编码CD209L的cDNA克隆转染中国仓鼠卵巢细胞后,细胞表达人CD209L糖蛋白,且对SARS-CoV易感。免疫组化结果显示,CD209L在人肺II型肺泡细胞和内皮细胞中表达,这两种细胞都是SARS-CoV的潜在靶点。包括埃博拉病毒和辛德比斯病毒在内的其他几种包膜病毒也使用CD209L作为入口,艾滋病毒和丙型肝炎病毒可以在细胞膜上结合CD209L,但不使用它来介导病毒进入。我们的数据表明,SARS-CoV的大S糖蛋白可能同时使用ACE2和CD209L参与病毒感染和发病机制。gydF4y2Ba
严重急性呼吸系统综合症(SARS)是由一种名为SARS- cov的新型冠状病毒(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).该病毒引起弥漫性肺泡损伤的非典型肺炎,总死亡率约为10%,儿童为0%,65岁以上人群为50% (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).冠状病毒通过病毒包膜上约200 kda的尖刺糖蛋白S与它们的糖蛋白受体结合。病毒受体的鉴定可以深入了解病毒进入、组织趋向性、发病机制和宿主范围的机制。gydF4y2Ba
此前已鉴定出几种类型的冠状病毒S糖蛋白受体。小鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒的受体是小鼠癌胚抗原细胞粘附分子1 (CEACAM1)和Ig超家族中癌胚抗原家族中的相关小鼠糖蛋白(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).人冠状病毒229E (HCoV-229E)、猪传染性胃肠炎病毒和猫冠状病毒遗传组1的受体是氨基肽酶N (APN)糖蛋白(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
血管紧张素转换酶2 (ACE2)是SARS-CoV S糖蛋白的有效受体(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).由于恒河猴肾细胞的Vero系对SARS-CoV感染高度敏感,李gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)使用密码子优化的可溶性SARS-CoV突穗糖蛋白(氨基酸12-672)融合到人IgG1的Fc结构域,从Vero细胞膜免疫沉淀出一个假定的受体糖蛋白,并通过质谱鉴定了猿猴ACE2蛋白。他们发现,重组人ACE2的表达极大地增强了人293T细胞对SARS-CoV感染的易感性。王gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba通过使用Vero E6细胞的逆转录病毒cdna文库转导HeLa细胞,并使用流式细胞术选择与纯化的具有6-组氨酸标记的可溶性SARS-CoV S糖蛋白(氨基酸14-502)结合的转导细胞,独立证明人ACE2是SARS-CoV的受体。他们发现,这些细胞中编码三磷酸异构酶的类人猿cDNA通过插入到ACE2 ORF上游的HeLa细胞基因组中,增强了人类ACE2的表达。表达重组人ACE2的小鼠NIH 3T3细胞易被表达SARS-CoV S蛋白的HIV假病毒感染。gydF4y2Ba
在本报告中,我们描述了对SARS-CoV的另一种受体CD209L(也称为L-SIGN, DC-SIGNR和DC-SIGN2)的发现(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba).我们鉴定SARS-CoV受体的策略是将逆转录病毒载体携带的人肺cDNA文库转导到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,并使用流式细胞术选择转导的CHO细胞,这些CHO细胞结合了可溶性、密码子优化、c-myc标记的SARS-CoV SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba糖蛋白(氨基酸1-590)在293T细胞中表达。sars冠状病毒gydF4y2Ba590gydF4y2Ba然后用传染性SARS-CoV攻击-结合细胞,通过检测亚基因组病毒RNA合成和抗病毒抗体免疫荧光来证明感染。CD209L在人II型肺泡细胞和肺内皮细胞中表达,这些细胞可能是SARS-CoV的靶点(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba表明ACE2和CD209L可能都参与了SARS-CoV的进入。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
病毒。gydF4y2Ba由W. Bellini和T. Ksiazek(亚特兰大疾病控制和预防中心)(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),并在生物安全3级实验室中在Vero E6细胞(来自美国类型培养收藏)中繁殖。用于这些实验的接种剂是我们实验室中病毒第二次传代的24- 28小时上清液培养基,在贝克曼库尔特Allegra 64R冷藏离心机中以1000转/分的速度离心,贝克曼库尔特GH3.8转子,置于Aerosolve抗气溶胶罐中,搅拌,快速冷冻,并在-80°C保存。病毒以0.01的感染倍数(moi)接种细胞。在无血清DMEM中,37℃吸附病毒1 h,去除接种体,代之以DMEM、10%胎牛血清、2%青霉素、链霉素和真菌素(PSF) (Invitrogen)。gydF4y2Ba
抗体。gydF4y2Ba兔多克隆抗N Ig用于检测SARS-CoV N蛋白,购自美国Imgenex公司(San Diego)。DC-SIGN (MAB161)、CD209L (MAB162)或DC-SIGN + CD209L (MAB1621)、ACE2 (MAB933)的单克隆IgG,以及抗ACE2的山羊IgG (AF933)均购自R & D Systems公司。霍乱毒素特异性对照单克隆IgG由R. K. Holmes(科罗拉多大学健康科学中心)提供。CD209L N端和C端特异性多克隆山羊IgG (N-17或C-17)购自Santa Cruz Biotechnology公司。FITC-和藻红菊酯结合的山羊抗小鼠、山羊抗兔子和驴抗山羊igg购自Jackson免疫研究公司。小鼠单克隆igg和兔多克隆抗c-myc igg购自Santa Cruz Biotechnology公司。兔抗6-his多克隆IgG购自Abcam (Cambridge, MA)公司。正常山羊血清IgG购自R & D Systems,正常兔子血清IgG购自Bethyl Laboratories (Montgomery, TX)。生物素化兔抗山羊IgG购自Vector实验室。gydF4y2Ba
SARS-CoV S糖蛋白的表达与纯化。gydF4y2Ba全长刺突蛋白含有1255个aa。可溶密码子优化c-myc标记SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba在293T细胞中表达的SARS-CoV糖蛋白(氨基酸1-590,包含受体结合域)在文献中描述。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.cDNA编码可溶性HisgydF4y2Ba6gydF4y2Ba标记的年代gydF4y2Ba1180gydF4y2BaSARS-CoV的糖蛋白(氨基酸1-1180,包含1191 -aa外结构域的大部分)是从SARS-CoV Urbani株的cDNA中亚克隆的(由W. Bellini提供)(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),在科罗拉多大学健康科学中心组织培养/单克隆抗体核心中的杆状病毒的TN5细胞(Invitrogen)中表达,并通过镍亲和层析纯化。gydF4y2Ba
含人肺cDNA文库假型的制备。gydF4y2Ba假型在ΦNX细胞中产生,这是一种带有集成Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)的第二代逆转录病毒包装细胞系。gydF4y2Bagag polgydF4y2Ba表达逆转录病毒衣壳,但不表达病毒包膜糖蛋白(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).根据制造商的说明,通过与Viraport (Stratagene)人肺cDNA文库质粒和表达水泡性口炎病毒G糖蛋白的质粒共转染,这些细胞被用于制造伪型病毒。培养上清伪型在1000 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,清除细胞碎片,立即用于转导CHO细胞或BHK细胞,moi为10。假型用聚(gydF4y2BaN, N, NgydF4y2Ba”,gydF4y2BaNgydF4y2Ba四甲基-gydF4y2BaNgydF4y2Ba-三甲基乙基亚甲基二溴化铵)(聚brene) (Sigma),并在37°C下吸附到细胞上4小时。培养基改为DMEM + 10% FBS/2% PSF。gydF4y2Ba
流式细胞术。gydF4y2Ba采用美国科罗拉多大学流式细胞术和免疫学核心实验室的Beckman Coulter XL细胞荧光仪进行流式细胞术。细胞在100 μl荧光激活细胞分选(FACS)缓冲液(PBS中含有2%同种正常血清和相应的二抗)和0.4 mg/ml纯化SARS-CoV c-myc标记S中孵育1 hgydF4y2Ba590gydF4y2Ba或者他gydF4y2Ba6gydF4y2Ba标记的年代gydF4y2Ba1180gydF4y2Ba,然后用FACS缓冲液清洗三次。利用糖蛋白上标记的一抗检测S蛋白结合。一抗被吸附到10个gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在4°C的FACS缓冲液中悬浮1小时。细胞在4°C的FACS缓冲液中洗涤三次,并用藻红菊酯偶联的针对一抗的二抗吸附。细胞用1.5%甲醛固定,进行流式细胞试验。对照组均为阴性,包括不含一抗的细胞,不含S蛋白的细胞,用对照单抗标记的不相关抗原的细胞,以及正常山羊IgG。gydF4y2Ba
免疫荧光标记和免疫印迹。gydF4y2Ba为检测病毒N蛋白,细胞用75%甲醇25%乙酸-20℃固定,PBS复水化,用兔抗sars N抗体(Imgenex)标记,用含0.1%正常山羊血清的PBS洗涤三次。加入fitc偶联的山羊抗兔IgG抗体1 h,清洗细胞,Olympus BS-2荧光显微镜下观察。为了检测表达DC-SIGN、CD209L或ACE2的细胞,按照上述方法固定和处理细胞。免疫印迹法用裂解缓冲液(50 mM Tris·HCl, pH 8.0/5 mM EDTA/150 mM NaCl/1% Triton X-100)在室温下处理细胞5min, 16100 ×离心去除细胞碎片gydF4y2BaggydF4y2Ba在Eppendorf 5415D离心机中分离10分钟。将Laemmli缓冲液中的上清液在饱和氯化钠溶液中煮沸10分钟,蛋白质在10% SDS/PAGE上分离,然后用Bio-Rad minitransblot cell在50 V下吸附到聚偏氟乙烯膜上50分钟。gydF4y2Ba
免疫组织化学。gydF4y2Ba用辣根过氧化物酶或荧光素标记抗体进行免疫组化,如文献所述。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.这些都是标准方法,除了组织在4%多聚甲醛中固定过夜,切片在室温下用6 M盐酸胍处理30分钟,然后在37°C下用0.2 mg/ml胰蛋白酶处理30分钟,然后应用抗体。山羊抗cd209l IgG N-17或对照山羊IgG在4℃孵育过夜。冲洗切片,然后用生物素化的兔抗山羊IgG、链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺孵育,或者用fitc标记的驴抗山羊IgG孵育。gydF4y2Ba
多重rt - pcr。gydF4y2Ba为了检测SARS-CoV的复制,使用引物进行多重RT-PCR,引物分别扩增GAPDH的核苷酸279-1069、SARS-CoV基因组RNA的S基因1b - 21593基因的核苷酸21263和亚基因组病毒RNA的病毒前导RNA的核苷酸1 - 21593,如文献所述。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
DNA测序。gydF4y2Ba从克隆细胞系中分离的DNA在1%琼脂糖凝胶中1× TAE缓冲液(40 mM Tris-acetate/1 mM EDTA)中分析,用溴化乙锭观察条带并从凝胶中切除。DNA在科罗拉多大学癌症中心DNA测序和分析核心设备上的Prism 3100 DNA荧光毛细管自动测序仪(应用生物系统公司)上进行测序,使用LTR和由ViraPort系统供应商(Stratagene公司)提供的内部引物。gydF4y2Ba
CD209L糖蛋白质粒及其表达。gydF4y2Ba从克隆2.27中获得1100 bp cDNA编码CD209L,通过PCR将其克隆到pENTR D/TOPO载体(Invitrogen)上,引物为MoMuLV 5 '和3 ' lts特异性引物。使用制造商提供的LR克隆酶将克隆体梭入pDEST40载体(Invitrogen)。插入物被完全测序,发现编码CD209L同型,与GenBank条目NM_014257相同99%。新引物(正向,CACCATGAGTGACTCCAAGGAACC;克隆出CD209L cDNA特异性的CTATTCGTCTCTGAAGCAGGC), PCR克隆出不含MoMuLV 5 '和3 ' lts的cDNA。PCR产物克隆到pENTR D/TOPO中,穿梭于pDEST40中。3 '引物包含一个末端停止密码子,以防止V5/HisgydF4y2Ba6gydF4y2Ba被纳入CD209L基因产物。测序结果证实该克隆的完整性(pDEST40 CD209L)。克隆的CD209L cDNA按照厂家说明书使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)试剂转染CHO细胞。瞬时转染的细胞在转染后48小时使用。在500 μg/ml G418中培养10 d,选择稳定转染的细胞,流式细胞术筛选CD209L的表达。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
利用Viraport人肺cDNA文库(Stratagene)鉴定SARS-CoV受体。这个库包含2.4 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba从年龄15-40岁的5名男性和女性白人捐赠者的正常肺中分离的mRNA cDNA拷贝,在来自MoMuLV的逆转录病毒载体中。该文库允许通过含有水泡性口炎病毒G蛋白的逆转录病毒假型将人类cDNA快速有效地转导到细胞中,以介导进入。CHO细胞在moi为10的情况下被假型转导,以确保所有细胞都被至少一种病毒颗粒转导。培养细胞2天,流式细胞仪检测可溶性密码子优化SARS-CoV S的结合gydF4y2Ba590gydF4y2Ba糖蛋白(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)到表达假定受体的细胞(数据未显示)。未被逆转录病毒假型转导的对照CHO细胞为S阴性gydF4y2Ba590gydF4y2Ba绑定(数据未显示)。S的排序gydF4y2Ba590gydF4y2Ba又绑了两次。在第三种方法中,单个阳性细胞被分散到96孔板中。40个扩展无性系保存在液氮中。gydF4y2Ba
在生物安全3级条件下,用传染性SARS-CoV攻击8个由5个人肺cdna转导的CHO细胞克隆,moi为每个细胞0.01个空斑形成单位,并在病毒接种后1和16小时分离RNA(数据未显示)。利用S糖蛋白编码ORF的前导序列和主体引物检测SARS-CoV亚基因组RNA。这些引物区分输入病毒只包含基因组RNA和感染细胞包含基因组和亚基因组RNA。由受感染的Vero E6细胞24小时上清制备的SARS-CoV接种物含有少量来自裂解细胞的亚基因组RNA。5个表达人肺cDNA的CHO克隆细胞库以每个细胞0.01斑块形成单位的moi攻击SARS-CoV,并在接种后1小时(PI)和16小时(数据未显示)用多重RT-PCR检测感染。病毒亚基因组RNA在接种病毒后1至16小时内显著增加,在五个池中的两个(数据未显示),表明病毒已经复制。然后分别用SARS-CoV攻击来自两个RNA阳性库的每个克隆。gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba表明,在Vero E6细胞和人肺cdna转导的CHO克隆2.15、2.22、2.27和2.37中,病毒RNA的合成在1到16小时内显著增加,但在其他s结合克隆中没有。因此,四个克隆表达了促进病毒进入和随后亚基因组病毒RNA合成的人类肺蛋白。gydF4y2Ba
用TRIzol (Invitrogen)从与SARS-CoV S蛋白结合的人肺含cDNA CHO克隆中提取DNA,用Viraport cDNA文库中MoMuLV lts的寡核苷酸引物PCR扩增前病毒中整合的人cDNA。扩增子部分测序gydF4y2Ba爆炸gydF4y2Ba进行搜索,以确定由伪分型逆转录病毒文库转导到每个SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba-绑定CHO克隆(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba).几种人蛋白的表达促进了SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba但只有4个克隆(克隆2.15、2.22、2.27和2.37;gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)显示SARS-CoV亚基因组RNA增加,表明病毒已经进入细胞并开始亚基因组RNA合成。所有四个SARS s结合克隆都含有不同大小的cdna,编码人类CD209L,这是一种c型凝集素,也称为L-SIGN、DC-SIGNR和DC-SIGN2 (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).用人肺cDNA文库转导BHK细胞也产生结合SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba蛋白和表达的人CD209L蛋白(数据未显示)。gydF4y2Ba
使用纯化His进行流式细胞分析gydF4y2Ba6gydF4y2Ba标记sars冠状病毒SgydF4y2Ba1180gydF4y2Ba在TN5细胞中表达的蛋白(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)来自杆状病毒载体。含有人CD209L cDNA的克隆2.27细胞90%以上结合了SgydF4y2Ba1180gydF4y2Ba糖蛋白(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaBgydF4y2Ba较低的gydF4y2Ba),而对照CHO细胞(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaBgydF4y2Ba上gydF4y2Ba)没有绑定SgydF4y2Ba1180gydF4y2Ba.使用三种针对DC-SIGN或CD209L或CD209L和DC-SIGN的单克隆抗体进行FACS分析(R & D Systems)。只有抗cd209l和抗cd209l + DC-SIGN与克隆2.27反应(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),显示这些细胞表达CD209L,而不表达DC-SIGN。此外,免疫印迹法(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和免疫荧光(数据未显示)显示CD209L在克隆2.27细胞中表达,而在Vero E6细胞和CHO细胞中不表达。免疫印迹(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和免疫荧光(数据未显示)表明,ACE2仅在Vero E6细胞上表达,克隆2.27细胞或CHO细胞上不表达。这些观察结果表明SARS-CoV SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba在Wang的实验中,糖蛋白克隆2.27细胞并不是由于人类ACE2表达的增加gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
确定CD209L是否是克隆2.27细胞中唯一需要结合SgydF4y2Ba590gydF4y2Ba和SgydF4y2Ba1180gydF4y2Ba对于SARS-CoV感染,我们在CHO细胞中瞬时表达人CD209L cDNA,并通过免疫荧光(数据未显示)和免疫印迹(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaBgydF4y2Ba).瞬时转染CHO通道中的CD209L双条带可能代表了瞬时转染细胞中由于高表达而导致的蛋白糖基化差异。将瞬时转染人CD209L cDNA的Vero E6细胞、对照CHO细胞、克隆2.27细胞和CHO细胞以0.1的moi向SARS-CoV进行攻击,并在病毒接种后1、24、48和72 h对样本进行多重RT-PCR (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).本实验表明,与Vero E6和克隆2.27细胞一样,瞬时表达人CD209L的CHO细胞易受病毒感染,而未转染的CHO细胞不易受病毒感染。gydF4y2Ba
采用免疫荧光法检测接种病毒24 h后CHO或克隆2.27细胞中SARS-CoV N蛋白的表达。gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba克隆2.27细胞中病毒N蛋白的细胞质表达<1%,而对照CHO细胞中无病毒N蛋白表达。这些数据表明,部分但不是全部表达cd209l的细胞对SARS-CoV感染敏感。在瞬时表达ACE2 cDNA的细胞系中,>50%可被SARS-CoV感染(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).因此,CD209L是一种比ACE2更有效的SARS-CoV受体。gydF4y2Ba
鉴定了肺中表达CD209L的细胞。抗CD209L抗体N-17免疫组化结果显示,CD209L在人肺II型肺泡细胞和内皮细胞中表达(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这篇论文中,我们发现人CD209L (L-SIGN)可以结合在人293T细胞和昆虫细胞中表达的纯化的可溶性SARS-CoV S糖蛋白,并且CD209L可以作为感染性SARS-CoV的入口。我们的策略是基于逆转录病毒文库中的CHO细胞中人肺cdna的表达,选择结合SARS-CoV S糖蛋白的细胞,并鉴定这些细胞中表达的人肺cdna。克隆的s -结合细胞受到传染性SARS-CoV的攻击,通过多重RT-PCR和抗病毒抗体免疫荧光检测亚基因组病毒RNA表达的增加证明了病毒感染。gydF4y2Ba
CD209L是c型凝集素家族中的II型跨膜糖蛋白(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba).本文鉴定的SARS-CoV受体CD209L亚型含有376个aa,由一条短的细胞质尾、一个跨膜结构域、一个由7个23-aa序列重复组成的胞外柄(KAAVGELxEKSKxQEIYQELTxL)和一个大的c端碳水化合物识别结构域(CRD)组成。CD209L亚型的crd与糖蛋白上的高甘露糖聚糖特异性结合(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba).我们还不知道SARS-CoV S蛋白是通过其碳水化合物部分与CD209L的CRD结合,还是识别CD209L上的氨基酸残基。gydF4y2Ba
CD209L的6种膜结合亚型和3种可溶性亚型分别在肝脏的窦状内皮细胞、淋巴结的内皮细胞和巨噬细胞样细胞以及胎盘的毛细血管内皮细胞上表达(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),以及人类的Peyer斑和回肠末端绒毛固有层的毛细血管(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).CD209L在KG1髓系树突状细胞系和子宫内膜上低水平表达(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba).我们从人肺cDNA文库中分离到CD209L的cDNA,免疫组化结果显示CD209L在人II型肺泡细胞和内皮细胞中表达(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba).人类SARS-CoV感染的主要靶点是肺部和胃肠道(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba).在肺、肝、肾、汗腺、甲状旁腺、脑、胰腺和肾上腺的II型肺泡细胞中检测到SARS-CoV或病毒抗原(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba).我们推测CD209L在淋巴结、Peyer's patch和肺中的表达可能与ACE2联合参与了病毒的传播gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
人类CD209L与人类DC-SIGN(也称为CD209) 77%相同(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),在树突状细胞(dc)、单核细胞、肺泡巨噬细胞、胎盘和直肠粘膜(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).CD209L和DC-SIGN都以钙依赖的方式与ICAM-3和HIV gp120结合(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).虽然细胞膜上的这些c型凝集素可以结合HIV病毒粒子,但它们不能介导dc的HIV感染。表达DC-SIGN的dc携带传染性HIV病毒粒子到淋巴结,在淋巴结中介导表达CD4和趋化因子受体CXCR4的T淋巴细胞反式感染(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).在内皮细胞和直肠Peyer's斑块上表达的CD209L可能介导反式hiv病毒向树突细胞或T细胞的转移(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
DC-SIGN和CD209L均与埃博拉病毒糖蛋白相互作用,并介导顺式和反式易感内皮细胞感染。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba).CD209L和DC-SIGN都通过它们的crd介导Sindbis糖蛋白的附着,并介导Sindbis病毒的产生性感染,特别是与哺乳动物细胞中产生的病毒相比,昆虫细胞中产生的病毒在包膜糖蛋白上具有高水平的甘露糖聚糖(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba).DC-SIGN还可介导登革病毒对人类树突细胞的生产性感染(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba).DC-SIGN和CD209L糖蛋白结合丙型肝炎病毒糖蛋白E1和E2 (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba).最近发现DC-SIGN可以结合SARS-CoV S糖蛋白,但不会引发SARS-CoV感染。然而,DC-SIGN在表达ACE2的细胞反式中介导SARS-CoV感染(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
人ACE2是SARS-CoV的有效受体。它是一种含锌羧基肽酶,可将肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素I转化为血管紧张素II,并调节心脏功能,主要是通过维持血压和液体和电解质的稳态(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba).Northern印迹显示ace2mrna在心脏、肾脏和睾丸内皮细胞中大量表达(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba).RT-PCR和免疫细胞化学结果显示,ACE2 mRNA和蛋白表达于口腔、鼻腔和肠黏膜,肺、胃、皮肤、淋巴结、胸腺、骨髓、脾、肝、肾、脑的肺泡上皮细胞,以及许多器官的动脉和静脉内皮细胞和动脉平滑肌细胞(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba).这些ACE2表达位点包括尸检标本中SARS-CoV复制的大部分位点(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba).我们的数据表明,人类CD209L也可以介导SARS-CoV的感染,尽管它是一种比人类ACE2低得多的受体。gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba显示CD209L在人肺II型肺泡细胞上表达,而II型肺泡细胞是SARS-CoV感染的重要靶点(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),以及内皮细胞。gydF4y2Ba
许多不同的策略可用于识别病毒受体、共受体和/或配体。李使用的策略gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)和王gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)鉴定ACE2为SARS-CoV的受体是基于病毒或刺突糖蛋白与Vero猴肾细胞的相互作用。这两种方法都没有发现CD209L或DC-SIGN,因为Vero E6细胞不表达这些糖蛋白。我们的战略重点是SARS-CoV感染人类肺部。在人肺cDNA文库中,我们发现了许多结合SARS-CoV S糖蛋白的蛋白质,但所有易受病毒入侵的转导CHO细胞的S结合克隆都含有该文库中的人CD209L cDNA。从人类肺文库中,我们反复鉴定出编码CD209L的几种大小的转导cdna,但我们没有鉴定出编码ACE2或DC-SIGN的任何人类cdna。此外,我们使用的人肺文库的RT-PCR既没有检测到ACE2也没有检测到DC-SIGN cDNA(数据未显示),可能是因为肺文库中cDNA的复杂性有限。gydF4y2Ba
许多病毒,包括艾滋病毒、单纯疱疹病毒和麻疹病毒,使用多种替代受体和/或共受体进入宿主细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba45gydF4y2Ba).病毒包膜糖蛋白与不同受体的多重相互作用可促进不同组织或不同宿主的感染(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba).不同的突刺/受体相互作用可以在单一细胞类型上连续发生,也可以在不同细胞类型上独立发生(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba).由于冠状病毒的S糖蛋白是一些最大的病毒突刺糖蛋白,单个S蛋白中的不同结构域可能识别多个替代受体。ACE2和CD209L的相互作用是否在SARS-CoV感染和发病机制中发挥重要作用,还需要进一步的实验来确定。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢M. K. Smith, Brian C. Turner和Megan W. Howard的科学讨论。Christian Pontillo提供了出色的技术援助。部分工作在科罗拉多大学癌症中心DNA测序和分析核心设施、组织培养/单克隆抗体核心以及流式细胞术和免疫学核心实验室完成,这些实验室得到了美国国立卫生研究院(NIH)/美国国家癌症研究所癌症核心支持基金P30 CA046934的支持。这项工作得到了NIH拨款RO1 AI-25231的补充,NIH拨款RO1 HL-67671和PO1 AI59576, NIH合同N01-AI25489和N01-AI25490,卫生与公众服务部和疾病控制与预防中心(CDC)拨款U901 CCU216988,以及国家过敏和传染病研究所(NIAID)合同N01-AI65315的支持。L.G.-R。得到了CDC新发传染病研究项目的支持。S.A.J.由NIAID培训基金T32 AI 07537-04资助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba‡‡gydF4y2Ba寄信地址:科罗拉多大学健康科学中心微生物系,东第九大道4200号,校园箱B-175,丹佛市,CO 80262。电子邮件:gydF4y2Bakathryn.holmes在}{uchsc.edugydF4y2Ba.gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba__gydF4y2BaS.A.J.和S.M.T.对这项工作同样有贡献。gydF4y2Ba
这篇论文直接提交给PNAS办公室(Track II)。gydF4y2Ba
缩写:CHO,中国仓鼠卵巢;浸,冠状病毒;FACS,荧光激活细胞分选;Moi,多重感染;Moloney小鼠白血病病毒;π,postinoculation;非典,严重急性呼吸系统综合症。gydF4y2Ba
- 版权所有©2004,美国国家科学院gydF4y2Ba
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