新研究gydF4y2Ba
物理科学gydF4y2Ba
以门户网站gydF4y2Ba
按主题分类的文章gydF4y2Ba
社会科学gydF4y2Ba
以门户网站gydF4y2Ba
按主题分类的文章gydF4y2Ba
生物科学gydF4y2Ba
以门户网站gydF4y2Ba
按主题分类的文章gydF4y2Ba
- 农业科学gydF4y2Ba
- 人类学gydF4y2Ba
- 应用生物科学gydF4y2Ba
- 生物化学gydF4y2Ba
- 生物物理学和计算生物学gydF4y2Ba
- 细胞生物学gydF4y2Ba
- 发育生物学gydF4y2Ba
- 生态gydF4y2Ba
- 环境科学gydF4y2Ba
- 进化gydF4y2Ba
- 遗传学gydF4y2Ba
- 免疫学与炎症gydF4y2Ba
- 医学科学gydF4y2Ba
- 微生物学gydF4y2Ba
- 神经科学gydF4y2Ba
- 药理学gydF4y2Ba
- 生理学gydF4y2Ba
- 植物生物学gydF4y2Ba
- 种群生物学gydF4y2Ba
- 心理与认知科学gydF4y2Ba
- 可持续性科学gydF4y2Ba
- 系统生物学gydF4y2Ba
有丝分裂刺激通过增加肺泡II型细胞对感染的易感性来加速流感诱导的死亡率gydF4y2Ba
由Peter Palese编辑,纽约州纽约州西奈山伊坎医学院,2017年6月29日批准(2016年12月23日接收审查)gydF4y2Ba
意义gydF4y2Ba
流感是一种反复出现的全球健康威胁,优先针对幼儿、孕妇、老年人和体弱者等弱势群体。甲型流感病毒(IAV)从导气管上皮到肺泡上皮的传播是原发性病毒性肺炎发病机制中的关键事件。宿主对IAV肺炎的易感性通常归因于免疫改变,而肺泡上皮的细胞自主易感状态,如增殖张力,很少被考虑。在这里,我们证明了肺泡上皮II型细胞的有丝分裂刺激使它们以mtor依赖的方式易受IAV感染。gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
肺炎的发展是流感最致命的后果,与无并发症的感染相比,死亡率增加50多倍。因此,病毒感染从传导气道到肺泡上皮的传播是流感发病机制中的一个关键事件。我们发现角化细胞生长因子(KGF)的有丝分裂刺激显著加速了甲型流感病毒(IAV)感染后的死亡率。根据肺组织切片和分离肺细胞的病毒核蛋白染色的时空分析,与单独使用IAV相比,KGF与IAV联合使用明显加速了病毒感染从气道向肺泡的传播。为了更好地确定KGF给药与体内IAV感染易感性之间的时间关系,我们在肺内IAV攻毒前120、48、24和0小时给药KGF,并评估分散肺细胞群中增殖和IAV感染的肺泡型II (AECII)细胞的百分比。AECII传染性峰值与KGF给药时间一致,KGF也诱导了AECII增殖高峰。在分离前给予肺内KGF,然后体外感染IAV的小鼠的AECII表现出相同的增殖和感染易感性的时间模式。在有丝分裂刺激前,用mTOR抑制剂雷帕霉素对动物进行预处理,可逆转kgf诱导的死亡率增加、AECII增殖和IAV敏感性增强。综上所述,这些数据表明mTOR信号依赖的AECII有丝分裂调节是宿主对IAV感染易感性的决定因素。gydF4y2Ba
流感病毒以季节性流行病的形式在全球传播,每年造成300万至500万例严重疾病,并夺去多达50万人的生命(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).大多数患者的流感症状持续7-10天,限于发热、鼻炎、咽炎、肌痛、头痛和病毒性支气管炎引起的咳嗽(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).虽然个人死亡风险很低,但有相当一部分感染患者会发展为肺炎,这是流感最致命的后果(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).感染及并发症风险最高的人群包括孕妇(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)、长者(>65岁)(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)、幼儿(<5岁,尤其是2岁以下)、吸烟者(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)、吸入有毒物质(例如氧气)的人士(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)及空气污染物(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),以及患有糖尿病和肺气肿等慢性疾病的病人(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba).增加的风险通常归因于免疫系统的损伤,而在易导致IAV感染和不良结果的宿主因素的机制研究中,很少考虑气道上皮细胞的差异易感性。了解促进流感从传导气道传播到肺泡腔室,导致从支气管炎发展到肺炎的上皮因素,将大大促进制定减轻流感感染影响的策略。gydF4y2Ba
流感病毒被吸入呼吸道后,会影响鼻腔、口咽和上气道上皮。从病毒包膜伸出的丰富的三聚体血凝素(HA)蛋白顶端的受体与宿主细胞糖蛋白和糖脂上的末端唾液酸残基结合,通过内吞作用促进病毒粒子的内化(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba).可溶性酶和膜结合酶对HA的蛋白水解裂解促进了介导病毒和内体包膜融合的关键构象变化(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba).这一过程由病毒孔蛋白(M2)协助,M2蛋白促进内体酸化,并驱动核心蛋白和病毒RNA释放到细胞质中,然后运输到细胞核(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).在那里,宿主复制机制被用来产生病毒RNA和蛋白质,这些病毒RNA和蛋白质被包装成新的病毒颗粒并运输到细胞表面(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).神经氨酸酶切断病毒HA和细胞表面聚糖之间的唾液酸连接,将病毒与宿主细胞相连,释放病毒子代以延续感染周期(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
肺凝集素,表面活性剂蛋白A (SP-A)和D (SP-D),是肺上皮来源的宿主防御蛋白,先前已报道与HA结合并调理和凝集IAV (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).角质细胞生长因子(KGF)是一种有效的上皮细胞有丝分裂原和分化因子,已被证明可以增加肺集素的表达,促进上皮细胞修复,并保护肺免受各种感染性和非感染性损伤(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).在本研究中,我们最初的假设是KGF政府将增加了气道中的肺收集水平,并提高了IAV挑战小鼠的存活率。相反,我们发现KGF通过细胞自主增强AECII对病毒感染的易感性,加速了病毒从传导气道向肺泡间隙的传播,增加了病毒负担和死亡率。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
肺内注射KGF增加肺内IAV挑战后的死亡率和病毒负担。gydF4y2Ba
实验验证了KGF政府将增强WSNHAnc-Asp225Gly(一种sp - d敏感的杂交IAV菌株,WSNHAnc-Asp225Gly,以下简称IAV)刺激小鼠存活的假设,结果见gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba.通过气管内(i.t)途径,用含有1500个IAV颗粒的PBS溶液(含或不含5mg /kg KGF)接种动物,并在11天内观察生命状态。尽管所有动物最终都死于IAV感染,但KGF联合给药平均缩短了3天的生存期(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01)。IAV与KGF在4个log(0.1、1、10和100µg/只小鼠)浓度下的共给药导致了剂量依赖性的死亡率加速(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaBgydF4y2Ba).接种IAV前120小时KGF预处理与接种PBS/IAV的小鼠相比,没有提高死亡率(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaCgydF4y2Ba).根据全肺匀浆中IAV RNA的实时荧光定量PCR (gydF4y2Ba图1gydF4y2BaDgydF4y2Ba;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。接种后24 h, PBS/IAV组和KGF/IAV组病毒载量无差异。gydF4y2Ba
KGF和IAV对BALF、血清和全肺匀浆炎症谱的影响。gydF4y2Ba
为了探索炎症在IAV感染小鼠KGF增加死亡率中的作用,我们在PBS中加入或不加入5 mg/kg KGF(在PBS中加入1500个IAV病毒颗粒后24和72小时收集的血清和脱细胞支气管肺泡灌洗液(BALF)中进行了炎症介质的多重分析。gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba).攻毒后72小时所选细胞因子的变化显示为PBS对照的倍数变化。与PBS/IAV对照组相比,KGF与IAV联合给药可适度增强BAL IP10、MCP-5、TNFα、MIG、IL-6、MCP-1、G-CSF、M-CSF和IFNγ反应。KGF还增强了血清中一些细胞因子对IAV挑战的炎症反应,特别是IP10、TNFα、MCP-1和IFNγ。为了确认肺前炎症细胞因子的变化,在IAV攻毒后24、48和72小时,在有或没有KGF的情况下,用ELISA法测定了全肺匀浆中IL-6、TNFα、KC和MCP-1的水平(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaCgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaFgydF4y2Ba).单独IAV可在48和72小时使IL-6、TNFα、KC和MCP-1水平增加3 - 8倍,而KGF联合给药可适度增强(约10-50%)。同时还进行了对照实验,以确定单独处理KGF的效果。除了在攻毒后48和72小时TNFα增加2 - 3倍外,KGF单独治疗对细胞因子反应在任何时间点上都没有影响(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
KGF促进病毒感染从气道扩散到肺实质。gydF4y2Ba
通过实验研究KGF对肺IAV感染时空格局的影响。对膨胀固定全肺切片进行流感核蛋白(ivv - np)染色gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba分别接种1500个IAV病毒颗粒后48 h和120 h,与KGF共给和不共给。病毒攻毒48小时后,IAV- np染色微弱,集中在仅接受PBS的IAV小鼠的大气道。同时,在给予i.t KGF的iav挑战小鼠中,染色明显更强烈,广泛的细支气管周围扩散到周围的肺实质,在低倍(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和大功率(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaBgydF4y2Ba)的观点。到120 h时,两组的ivv - np染色均增加,但KGF组的ivv - np染色明显更强烈和弥散。高倍肺切片中ivv - np染色的盲法半定量分析与kgf诱导的病毒负荷增加和从传导气道向肺实质的扩散加速一致(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaCgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaEgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
在体内,kgf增强的AECII传染性与其增殖状态相关。gydF4y2Ba
通过实验确定KGF的有丝分裂作用是否增强AECII体内对IAV感染的易感性。在感染前24、48或120小时用i.t KGF预处理的小鼠,在高剂量(50,000个病毒颗粒)i.t IAV挑战24小时后,用全肺匀浆制备单细胞悬液(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).然后对分散的细胞进行清洗、固定和染色,用抗IAV- np检测IAV感染,用抗pro SP-C检测AECII,用抗ki67(细胞增殖标志)染色。根据Ki67染色,AECII的增殖百分比呈时间依赖性地增加,在PBS攻击前48小时给药KGF的小鼠分离出的细胞中达到峰值,在PBS攻击前120小时给药KGF的小鼠中保持与PBS对照水平相似(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaBgydF4y2Ba).感染AECII的百分比(基于IAV-NP染色)也在感染前48小时用KGF预处理的小鼠的分散肺细胞中达到峰值,在接种前120小时给KGF的小鼠中保持在PBS对照水平附近(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaCgydF4y2Ba).平均通道荧光(MCF),反映每个细胞的病毒载量,遵循类似的模式,在KGF后48小时收获的细胞中达到峰值,在KGF后120小时收获的细胞中保持接近PBS对照水平(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaDgydF4y2Ba).AECII增殖峰值和AECII传染性峰值之间的相关性表明,有丝分裂刺激的细胞更容易受到感染。gydF4y2Ba
KGF在AECII的体外IAV感染中产生时间依赖性的增加,与它们的增殖Tone相关。gydF4y2Ba
我们进行了体外实验,研究了KGF在AECII对IAV感染的细胞自主易感性中的有丝分裂作用。分别从分别于24、48或120小时前用i.t KGF处理的小鼠中分离出AECII,并与IAV在培养基或单独培养基(RPMI加5% FBS)中以10的感染倍数体外培养18小时(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).然后对细胞进行清洗、固定,并用anti- ivv - np、anti-pro SP-C和anti-Ki67染色。在KGF给药后不同时间点分离的AECII中,根据Ki67染色,增殖的AECII百分比在24小时上升,在48小时达到峰值,并在KGF后120小时恢复到接近基线(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaBgydF4y2Ba).体外IAV培养后AECII感染的百分比在体内KGF处理后48小时收获的细胞中也最高,在KGF处理后120小时收获的细胞中保持接近基线水平(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaCgydF4y2Ba).ivv - np的每个细胞MCF遵循类似的模式,在KGF后48小时收获的细胞中达到峰值,在KGF后120小时收获的细胞中恢复到基线(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaDgydF4y2Ba).虽然这些分析显示感染AECII的百分比增加和每个AECII的病毒负担增加(基于平均通道荧光)与AECII增殖的峰值有关,但这些数据是相关的,并且进行了额外的体外实验,以更好地建立增殖和感染易感性之间的因果关系。在体内注射KGF 48小时后收获并体外感染IAV的AECII中,Ki67高(增殖)群体的IAV- np染色平均荧光强度大于Ki67低(非增殖)群体,这与优先感染或病毒在循环细胞中的复制一致(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaEgydF4y2Ba).在体外感染IAV的分离AECII的裂解物中,病毒蛋白M1的表达峰值也出现在体内KGF挑战48小时后分离的AECII中,与静止细胞相比,循环AECII对IAV感染的易感性更大(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaFgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
雷帕霉素在体内抑制kgf诱导的死亡率、增殖和病毒易感性的增加。gydF4y2Ba
已知KGF通过MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路发出信号。在体内进行实验,以确定mTOR抑制剂雷帕霉素是否可以抑制kgf诱导的AECII增殖张力的变化。在i.t.接种PBS、含KGF的PBS (5 mg/kg)或含KGF的PBS(含或不含IAV)前,小鼠每日一次i.p.雷帕霉素(1 mg/kg)或对照治疗4 d。在i.t挑战后24小时用福尔马林充气固定肺,切片并用针对核糖体S6蛋白Ser-235/236位点磷酸化的抗体染色。盲法半定量免疫组化分析显示,与单独IAV组相比,IAV+KGF组肺实质磷酸化s6染色中雷帕霉素抑制性增加,(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).用KGF接种后48 h的全肺匀浆制备单细胞悬液,加或不加雷帕霉素预处理动物。然后将分散的细胞清洗、固定,并用anti-pro SP-C、anti-phospho-S6和anti-Ki67染色。在接种KGF的小鼠中,基于Ki67染色的AECII增殖百分比比仅给予PBS的小鼠增加了7倍以上,从2%增加到14%。在KGF挑战前4 d的雷帕霉素预处理阻断了对KGF的增殖反应(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaBgydF4y2Ba).接下来,我们进行了实验,以确定kgf诱导的AECII传染性增强是否可以在体内被雷帕霉素抑制。小鼠注射雷帕霉素(1 mg/kg) 4 d后再接种IAV±KGF。感染后72 h,用全肺匀浆制备单细胞悬液。将分散的细胞清洗、固定,用anti- ivv - np和anti-pro - SP-C染色,流式细胞仪分析。kgf接种小鼠AECII感染比例明显高于PBS对照组小鼠,且雷帕霉素在体内预处理可抑制AECII感染(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaCgydF4y2Ba).接下来,我们进行了实验,以确定观察到的雷帕霉素介导的AECII增殖和传染性的降低是否减弱了体内IAV感染的严重程度。我们发现雷帕霉素预处理可显著降低kgf加速死亡率(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaDgydF4y2Ba;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05), kgf诱导肺组织促炎细胞因子IL-6水平升高(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaEgydF4y2Ba).Western blot分析体内感染后24小时采集的全肺匀浆IAV- np水平,表明雷帕霉素可减少体内IAV的产生(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaFgydF4y2Ba).为了证实kgf诱导的病毒易感是受体介导的,并排除脱靶效应,我们接下来检查了泛fgfr抑制剂BGJ398 (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)对kgf增强病毒易感性的影响。开发了大鼠AECII原代培养体系,该体系对本研究中使用的IAV菌株的感染既具有kgf反应性又具有允许性。我们发现BGJ398抑制FGF受体和西罗莫司抑制mTOR都能阻断kgf诱导的IAV易感性(gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2BaCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba).这些数据表明,已知通过多种途径(包括Jak/Stat、MAPK和PI3K)发出信号的KGF对IAV感染和/或复制的增强作用,至少可以通过靶向阻断FGFR/Akt/PI3K/mTOR通路中的两个点来部分抑制。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
这项研究最初旨在检查KGF的治疗潜力,KGF是一种有效的肺上皮有丝分裂原,已知可促进具有抗iav作用的先天性免疫蛋白的表达,包括集血素SP-A和SP-D。我们惊奇地发现,小鼠肺内灌注KGF加重了IAV诱导的死亡率,增加了肺病毒载量和炎症张力,并加速了IAV从传导气道向肺泡腔室的扩散。KGF还直接增强了AECII对IAV感染的体内易感性,其方式与AECII的增殖状态相关。从kgf预处理的小鼠中分离出的AECII也更易于体外IAV感染,这一发现表明,细胞自主机制,而不是对宿主免疫的更全面影响,是AECII感染易感性的关键驱动因素。这些数据表明,肺中AECII的有丝分裂音是IAV预防和临床管理中需要考虑的潜在宿主危险因素,可能是IAV肺炎的潜在治疗靶点。gydF4y2Ba
流感病毒感染远端导气管上皮细胞和克拉拉细胞。在肺泡水平,肺泡巨噬细胞、AECI和AECII细胞都可以被IAV感染,但在这些细胞中,AECII是选择性靶向的,并且唯一能够维持产生性感染(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba).IAV感染肺实质导致SP-C表达缺失,与AECII细胞活力和分化功能降低一致(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba).IAV感染的这一后果严重影响肺泡内稳态,原因是AECII在调节先天免疫反应、通过表面活性剂合成和分泌降低表面压力以及破坏腔内液体和电解质平衡方面的作用丧失。致命性流感病例肺样本的病理评估一致显示弥漫性肺泡损伤的证据,与直接损伤肺泡上皮作为流感肺炎死亡机制一致(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
因此,IAV从导气管上皮向肺泡上皮的传播是致命流行性肺炎发病机制中的关键事件。多种宿主因素会阻碍这一转变,包括物理防御,如粘液纤毛清除,体液防御,包括抗体,细胞防御,如自然杀伤细胞,以及抑制病毒的蛋白水解激活(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba).为了探索KGF效应的机制,我们首先考虑了丝裂原通过诱导致命的高炎症反应来提高ivv感染小鼠的死亡率的可能性。我们发现KGF对ivv诱导的炎症的增强是相当温和的,并且与稍高的病毒负担相一致(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)由生长因子诱导。我们下一步认为KGF的强有丝分裂作用可能直接增强AECII的敏感性。KGF对ivv诱导的死亡率的影响是时间和剂量依赖的,在5 mg/kg KGF时最大。用IAV- np抗体染色的IAV感染小鼠肺切片的低倍和高倍显微镜分析显示,KGF的使用加速了感染从气道到肺实质的扩散,在48小时内产生了与次级小叶相对应的IAV- np阳性的细支气管周围玫瑰花结,在120小时内整体染色更加强烈和弥漫性。相对于i.t. IAV感染,i.t. KGF给药的时间对AECII感染有显著影响。IAV攻毒发生在i.t KGF后48 h时,AECII感染数量和IAV负担对应的平均荧光强度均最大,Ki67染色结果显示,这也是AECII增殖最大的时间点。KGF的增殖效应和IAV感染的易感性在120小时后恢复到基线水平,这与观察到的在IAV攻击前120小时给药KGF对小鼠的死亡率没有提高一致(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaCgydF4y2Ba).为了评估KGF对AECII对IAV感染易感性的影响,消除宿主免疫系统的任何影响,我们进行了实验,在体内传递KGF,但在体外对分离的AECII进行IAV感染。再次,我们发现AECII在给药后48小时感染时最脆弱,并且在KGF暴露后120小时易感性恢复到基线。在体内注射KGF 48小时后IAV感染的细胞中,增殖细胞(Ki67高)比非增殖细胞(Ki67低)具有更高的病毒负担。与这一发现相一致的是,根据Western blot分析,在KGF刺激后多个点收获的AECII细胞裂解液和体外感染后,iav感染的AECII中病毒蛋白M1的表达也在KGF刺激后48小时达到峰值。gydF4y2Ba
我们发现kgf增强AECII细胞死亡率和易感性的分子机制或机制涉及PI3K/Akt/mTOR通路的激活,已知该通路可促进内吞和病毒复制,其中AECII增殖反应(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba)及感染室内爱滋病病毒的负担(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFgydF4y2Ba)经雷帕霉素预处理后减少。此外,雷帕霉素阻断了kgf增强的IL-6产生和kgf增强的死亡率。值得注意的是,一项针对严重H1N1 IAV患者的皮质类固醇+雷帕霉素与单独皮质类固醇的小型随机临床试验显示,联合治疗可获益(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba).人们很容易推测雷帕霉素和其他PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂可能在宫内av中具有预防或治疗作用。gydF4y2Ba
全基因组RNA干扰筛选已经确定了KGF的同源受体FGFR2,作为病毒进入所需的23个蛋白质之一,PI3K/Akt/mTOR, MAPK和IP-3 PKC信号通路对早期IAV复制最重要(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba).也有证据表明,IAV使用分子拟态和其他机制来激活细胞信号通路,以增强其自身的内化和增殖。IAV结合和聚类表皮生长因子受体导致受体的自磷酸化。该信号事件通过PI3K/mTOR/AKT通路增强了病毒内化,可能是由特洛伊木马机制驱动的,其中IAV被牵引到细胞中,同时与表皮生长因子受体聚糖结合(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba).此外,已知IAV产生的NS1蛋白与PI3K的p85β亚基结合,诱导PI3K在感染细胞中的活性(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba).最后,PI3K抑制剂和雷帕霉素的药物干预在体外阻断了IAV的复制,这与PI3K/Akt/mTOR通路在IAV感染中的作用一致(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
我们的数据表明,流感感染易感性增加与AECII增殖增加之间存在相关性。在这些数据的基础上,我们意识到健康宿主中AECII的显著静止状态,在任何给定的时间内,只有不到1%的AECII在增殖,这可能是一种被动的宿主防御策略,以限制IAV感染的肺内传播。AECII感染是决定流感感染结局的关键事件,而增殖依赖的AECII易感性可能受肺损伤等临床状态的调节,这一观点提出了关于我们护理ivv感染患者的方法的有趣且潜在的临床相关问题。例如,Sawicki等人在大约50年前证明,小鼠暴露于50%的氧气显著加速IAV和B型流感病毒引起的死亡率(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba).我们推测,在ivv感染患者中随意使用过量的补充氧可能会增强AECII增殖(正如已知在啮齿动物中所做的那样),并促进病毒性肺炎的进展(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
与流感死亡率相关的其他宿主易感状态也值得关注。已知婴儿中AECII的增殖比例要高得多(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba),这可能解释了他们对IAV感染的易感性增加。同样,吸烟也会增加人类对IAV感染的易感性(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba),可能是通过增加肺上皮细胞增殖,正如在大鼠中所报道的(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba).在我们看来,怀孕期间流感死亡率的增加也可能与激素对AECII细胞有丝分裂张力的影响有关,尽管我们没有找到支持这一观点的人类或动物数据。最后,用KGF治疗口腔炎的血液癌患者(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)可能因暴露于IAV或其他病毒而导致致命后果的风险增加。与这一观点一致,KGF治疗已被报道会加重肛肠乳头瘤病毒(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
总之,我们发现肺上皮有丝分裂原KGF的有丝分裂刺激加速了流感病毒向肺泡上皮的传播,并随后在小鼠中发展为致命的流感肺炎。我们提出,肺有丝分裂张力升高可能是一个被忽视的宿主风险因素,可被IAV利用,应考虑与弱势群体中经常出现的不良结果的风险增强有关。这一研究方向的未来治疗意义可能包括对怀疑患有IAV的患者更明智地使用补充氧气,对可能需要KGF治疗粘膜炎的患者仔细关注IAV疫苗接种状况,以及对早期但快速进展的IAV肺炎患者使用靶向上皮mTOR激活的短期抗增殖治疗。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
IAV感染小鼠模型。gydF4y2Ba
动物研究采用10 - 16周龄的雌性DBA/2J小鼠(杰克逊实验室)。小鼠用异氟醚轻度麻醉,并经口咽途径接种sp - d敏感杂交IAV株WSNHAnc-Asp225Gly(以下简称IAV),该杂交IAV株生长于Madin-Darby犬肾细胞(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba),并以5 mg/kg KGF加入50 μL Dulbecco’s PBS中。每天监测动物的生命状况。在一些实验中,在病毒感染后24、48和72小时采集肺部,并在不含钙的杜尔贝科PBS中均质化组织gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba和毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba.离心3000倍后gydF4y2BaggydF4y2Ba在其他研究中,在静脉注射KGF (5 mg/kg)、KGF/IAV或PBS后0、24、48或120小时分离出AECII。所有动物都在一个特定的无病原体设施中饲养,并根据辛辛那提大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行处理。gydF4y2Ba
病毒颗粒的定量。gydF4y2Ba
使用QIAamp病毒RNA Mini Kit (Qiagen)从小鼠肺匀浆中分离总RNA。病毒RNA通过病毒RNA自旋方案(Qiagen)纯化,使用Bio-Rad一步RT-PCR酶组合(Bio-Rad)和流感病毒a- a检测试剂盒(AD502, iGentBio)。gydF4y2Ba
病毒感染的组织学评估。gydF4y2Ba
气管插管,肺用中性缓冲的10%福尔马林(Fisher Scientific)在25 cm H压力下进行充气固定gydF4y2Ba2gydF4y2BaO.采集肺,用10%福尔马林浸泡过夜,石蜡包埋,切成5 μm切片,安装在Trubond 380黏附显微镜载玻片上(truu Scientific)。用0.3%过氧化氢在甲醇中淬灭内源性过氧化物酶活性;切片用15%正常山羊血清阻断,用兔抗iav NP抗体(Virostat;1:15 00稀释)过夜,4°C。用生物素标记的山羊抗兔IgG二抗(1:7 0 5稀释)和亲和素过氧化物酶依赖的二氨基联苯胺氧化孵育玻片。通过对ivv - np免疫组化染色强度进行评分,采用半定量量表[即- 1(最少)到4(最多)],对气道和肺实质中的病毒感染负担进行盲法分析。gydF4y2Ba
细胞因子的决心。gydF4y2Ba
根据制造商说明书(研发系统),用酶联免疫吸附法检测全肺匀浆澄清上清中的炎症因子。根据制造商的方案,使用Milliplex Multiplex试剂盒(Millipore),通过ELISA对BAL液和血清进行多分析物研究。浓度由标准曲线计算,使用重组蛋白标准,并以每毫升皮克数表示。gydF4y2Ba
全肺分散细胞的制备。gydF4y2Ba
外植肺经i.t途径灌注5000个酪蛋白溶解单位(c.u)/mL的disase (BD Biosciences),然后将(Worthington Biochemicals)浸入3ml含50u /mL DNase的冰冻disase (5000 c.u)/mL中。然后按照制造商的说明(Miltenyi Biotec)在gentleMACS Dissociator中处理肺组织,细胞悬液通过40 μm过滤器,然后用Dulbecco 's PBS洗涤并进行后续分析。gydF4y2Ba
流式细胞术与上皮细胞亚型鉴定。gydF4y2Ba
分散的肺细胞固定可以通过连续步骤完成,使用氯化铵裂解液(Stemcell Technologies),然后使用多聚甲醛(1.6%,10分钟),或者使用eBioscience固定/裂解试剂一步完成。细胞在70%甲醇/FACS缓冲液中洗涤和重悬一夜,然后用抗体洗涤和孵育。AECII和肺上皮细胞通过抗SPC (Seven Hills Bioreagents)和抗cd326(克隆G8.8;分别eBioscience)。利用F4/80抗体鉴定肺泡巨噬细胞(克隆BM8;eBioscience)和CD11c(克隆N418;eBioscience)。使用IAV-NP抗体检测流感病毒(克隆D67J;赛默费雪皮尔斯)。使用Ki67抗体(克隆SOLA15; eBioscience). Compensation for fluorescence overlap and background fluorescence was accomplished using fluorescence minus one controls. Samples were run on a FACS LSRII, using four lasers (325, 405,488, and 633 nm) (Becton Dickenson). Data were analyzed using FCS Express flow cytometry software.
AECII的分离、富集及IAV感染。gydF4y2Ba
如前所述,用分离出的AECII进行体外IAV传染性测定(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)在静脉注射PBS或5 mg/kg KGF后0、24、48和120 h。简单地说,通过i.t途径向盐水灌注的肺中注入5000立方单位的白藜芦醇,然后加入0.5 mL熔化的琼脂糖。将肺浸泡在含有5000 c.u./mL disase的3ml溶液中,在37°C下孵育45分钟,并在含有DNase的RPMI培养基中轻轻分离。细胞悬浮液通过40 μm膜过滤,并在抗cd45和CD16/32涂层板上筛选,以去除免疫细胞和成纤维细胞(BD Biosciences)。红细胞裂解后,将细胞悬液旋转到载玻片上(thermoshan),用pro-SPC抗体和台番蓝染色,分别测定AECII的纯度和活力。经验证AECII纯度至少为85%的细胞悬液以2.5 × 10的密度被镀于24孔板中gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔,2.5 × 10培养gydF4y2Ba4gydF4y2BaIAV颗粒在介质(RPMI与5% FBS)或介质中单独在37°C在5% CO中放置18小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的气氛。如前所述,收集细胞,清洗,固定,渗透,抗体染色,然后用流式细胞仪进行分析。Western blot分析用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在RIPA裂解缓冲液中制备细胞裂解液。等量的澄清上清液在4-20% SDS/PAGE凝胶上进行分级,转移到硝化纤维膜上。用IAV-M1抗体(ABD-Serotec)检测印迹,然后用IRDye 800CW偶联的山羊抗兔或山羊抗小鼠(Li-Cor)二抗检测印迹。采用GAPDH作为加载对照。根据制造商的说明,使用Li-Cor奥德赛捕捉图像。gydF4y2Ba
SI材料与方法gydF4y2Ba
大鼠AECII的分离、原代培养及体外感染。gydF4y2Ba
体外感染实验对从无特异性病原体的Sprague-Dawley大鼠(150-200 g)分离的AECII大鼠(Charles River)进行。大鼠用Euthasol处死,经肺动脉灌注无菌肺灌注缓冲液(140 mM氯化钠,2.5 mM磷酸钠,10 mM Hepes, 5 mM氯化钾,6 mMgydF4y2BadgydF4y2Ba-葡萄糖,2毫米氯化钙,1.3毫米硫酸镁)直到焯水。肺经气管灌洗8 mL肺灌洗缓冲液(140 mM氯化钠,2.5 mM磷酸钠,10 mM Hepes, 5 mM氯化钾,6 mM)gydF4y2BadgydF4y2Ba-葡萄糖)五次去除炎症细胞。切除肺,在肺灌注缓冲液中灌注3 U/mL弹性蛋白酶(Worthington), 37℃孵育20 min。用剪刀将肺组织切碎,浸泡在含有4,000 U DNase-I的10 mL肺灌注缓冲液中。在37°C下轻轻旋转肺3分钟,使细胞从消化的组织中分离出来。细胞依次通过无菌纱布和100和20µm细胞过滤器(Fisher Scientific)过滤,并在400 ×下制粒5分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba.用红细胞裂解缓冲液重悬细胞球团1 min, 400 ×制粒5 mingydF4y2BaggydF4y2Ba.将细胞重悬于10 mL不含FBS的DMEM-Hepes中,并在37°C和5% CO的大鼠IgG涂层的组织培养板中培养1 hgydF4y2Ba2gydF4y2Ba.收集非粘附细胞,并将其悬浮在10 mL DMEM中,加入高糖和10%胎牛血清。用溶酶仪(Invitrogen)对层状体进行染色并在高倍镜下检查,以确定AECII细胞的纯度。AECII (4 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔)在24孔组织培养板上镀IV型胶原蛋白(Corning Biocoat), 0.5 mL DMEM加高葡萄糖和10%胎牛血清,37℃,5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba.AECII培养至观察到60 - 80%的汇合(约24小时),然后血清在DMEM中饥饿18小时。细胞与信号抑制剂2.5µM BGJ398 (Selleckchem)或40 nM雷帕霉素(LC Laboratories)孵育30分钟,然后与IAV孵育30分钟,在37°C下,存在或不存在KGF (50 ng/mL),孵育60分钟。在IAV和KGF加入15和60 min后,收集细胞并在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。在IAV感染18 h后用Western blot检测病毒蛋白载量。等量蛋白质在4-20% SDS/PAGE凝胶上运行,转移到硝化纤维膜上,并用兔抗流感A NP抗体检测,1:250(赛默飞雪公司);小鼠抗流感A基质蛋白1,1:25 0 (Bio-Rad);小鼠抗- β-肌动蛋白抗体1:20 000 (Sigma)。用IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG作为二抗(1:10 000)。印迹是使用LI-COR Odyssey成像系统开发的。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们非常感谢犹他州立大学的Donald Smee博士提供IAV的WSNHAnc-Asp225Gly菌株。我们非常感谢瑞典Orphan Biovitrum对KGF的盛情馈赠。这项工作得到了国家过敏和传染病研究所拨款P01AI083222(给F.X.M.),国家环境卫生科学研究所环境遗传学中心拨款P30-ES006096(给F.X.M.)和Carespring基金会(给F.X.M.)的支持。K.L.H.和M.R.W.得到了国家心肺和血液研究所拨款HL069031和国家过敏和传染病研究所拨款P01AI083222的支持。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba你可以给他写信。电子邮件:gydF4y2Banikolan在}{uc.edugydF4y2Ba或gydF4y2BaMCCORMFX在}{UCMAIL.UC.EDUgydF4y2Ba.gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba现居地:日本札幌医科大学医学院生物化学系;日本札幌医科大学医学院呼吸内科和变态反应科。gydF4y2Ba
作者的贡献:N.M.N。,J.G.N L.B.P, J.C.G,布什,K.E.L, M.R.W, K.L.H,和F.X.M.设计研究;N.M.N J.G.N。,L.B.P J.C.G, Y.U,布什,其子as, K.E.L,上半叶进行研究;N.M.N J.G.N。,J.C.G K.E.L,和F.X.M.分析数据;N.M.N.和F.X.M.撰写了这篇文章。gydF4y2Ba
作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba
这篇文章是PNAS直接提交。gydF4y2Ba
这篇文章包含支持信息在网上gydF4y2Bawww.pnas.org/lookup/suppl/doi: 10.1073 / pnas.1621172114 /——/ DCSupplementalgydF4y2Ba.gydF4y2Ba
通过PNAS开放存取选项免费在线获取。188滚球软件gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 克劳瑟gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 周gydF4y2BaHgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 罗素gydF4y2BaCAgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- MontogydF4y2Ba作为gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- GravensteingydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 艾略特gydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- ColopygydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- SchweinlegydF4y2BaJgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 短gydF4y2Ba基米-雷克南gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KroezegydF4y2BaEJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- FouchiergydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KuikengydF4y2BaTgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- KourtisgydF4y2Ba美联社gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 读gydF4y2BaJSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 杰米逊gydF4y2BaDJgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 美国疾病控制与预防中心gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 命gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- BilellogydF4y2BaKSgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 麦尔斯gydF4y2Ba公关gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba流感临床信息网络(FLU-CIN)gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 梁gydF4y2BaYgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 希勒曼gydF4y2Ba先生gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 惠特利gydF4y2BaRJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MontogydF4y2Ba作为gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 布维耶gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- Palese称gydF4y2BaPgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- SteinhauergydF4y2Ba达gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 横gydF4y2Ba摩根富林明gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- Palese称gydF4y2BaPgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 卡什gydF4y2BaJCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 家长gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KorthgydF4y2Ba乔丹gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 卡茨gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- NayakgydF4y2BaDPgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 回族gydF4y2Ba埃克gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 酒吧间招待员gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 瓦格纳gydF4y2BaRgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MatrosovichgydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- ·可兰克gydF4y2Ba高清gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 莱文gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 氨水溶液gydF4y2BaKgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 艾略特gydF4y2BaJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- WhitsettgydF4y2BaJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KorfhagengydF4y2BaTgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 屈膝;蜷伏gydF4y2BaEgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 李gydF4y2BaGgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- HawgoodgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- VigerustgydF4y2BaDJgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 莱文gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- WhitsettgydF4y2Ba晶澳gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 氨水溶液gydF4y2Ba吉隆坡gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 屈膝;蜷伏gydF4y2Ba电子商务gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KorfhagengydF4y2BaTRgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- BarazzonegydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 郭gydF4y2BaJgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- DeterdinggydF4y2BaRRgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 矢野gydF4y2BaTgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- DeterdinggydF4y2BaRRgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 西莫内特gydF4y2BaWSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 香农gydF4y2BaJMgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 梅森gydF4y2BaRJgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 帕诺斯gydF4y2BaRJgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 贝克gydF4y2Ba点gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 西莫内特gydF4y2BaWSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 鲁宾gydF4y2BaJSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 史密斯gydF4y2BaLJgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 吴gydF4y2BaHgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 铃木gydF4y2BaTgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 凯里gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 杰尔gydF4y2Ba公元前gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 麦科马克gydF4y2Ba外汇gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 加德纳gydF4y2BaJCgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- GuagnanogydF4y2BaVgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- WeinheimergydF4y2BaVKgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 范·里尔gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 范·里尔gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 山中gydF4y2BaKgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 库马尔gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 而gydF4y2BaCCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 森林gydF4y2BaPSgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 戴维斯gydF4y2Ba集成电路gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 陶本伯杰gydF4y2BaJKgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- MorensgydF4y2BaDMgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 特里帕西gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 白色gydF4y2Ba先生gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 氨水溶液gydF4y2Ba吉隆坡gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 王gydF4y2BaCHgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 康尼锡gydF4y2BaRgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- EierhoffgydF4y2BaTgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- HrinciusgydF4y2Ba呃gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- reschgydF4y2BaUgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 路德维希gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- EhrhardtgydF4y2BaCgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 黑尔gydF4y2BaBGgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 杰克逊gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 陈gydF4y2Ba本产品gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 羊肉gydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 兰德尔gydF4y2Ba再保险gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- EhrhardtgydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- SawickigydF4y2BalgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 男爵gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 艾萨克斯gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 亚当森gydF4y2BaIYgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 鲍登gydF4y2BaDHgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 埃文斯gydF4y2Ba乔丹gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 哈克尼gydF4y2BaJDgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 考夫曼gydF4y2BaSLgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 卡克gydF4y2BaJDgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- LebiushgydF4y2Ba米gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 卡克gydF4y2BaJDgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- LebiushgydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- RannongydF4y2BalgydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 井gydF4y2BaABgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- LamertongydF4y2Ba低频gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- SpielbergergydF4y2BaRgydF4y2Ba,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- 施罗德gydF4y2BaTgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- ZohrengydF4y2BaFgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- SauregydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- KobbegydF4y2BaGgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
- 哈斯gydF4y2BaRgydF4y2Ba