Microbial-induced meprinβ乳沟MUC2黏液和CFTR功能检测通道需要发布锚定小肠粘液
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编辑安德鲁·j·麦克弗森莫里斯·穆勒实验室和Farncombe家庭消化健康研究所,伯尔尼,瑞士,2014年7月15日,编辑部和接受(待审查2014年4月25日)
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意义
粘液的主要组成部分,gel-forming黏蛋白,对保护宿主上皮免受细菌很重要。在正常情况下,这些粘蛋白网络不断释放到小肠内腔。这个版本需要粘蛋白的蛋白水解乳沟的metalloprotease meprinβ和无菌动物,但没有由细菌引起的。小肠粘液囊肿性纤维化也,不是由于缺乏酶,而是粘蛋白不正常展开在缺乏功能性囊性纤维化跨膜电导调节通道和足够的碳酸氢盐水平。粘液可以因此出现连接和释放作为系统的一部分,控制细菌的去除。这个新概念可能导致囊性纤维化的治疗和治疗新方法。
文摘
的粘液覆盖和保护上皮肠是建立在其主要的结构部件,该gel-forming MUC2粘蛋白。的gel-forming黏蛋白传统上被认为是作为nonattached分泌。结肠有两层粘液系统内粘液是附着于上皮细胞,而小肠正常nonattached粘液。然而,小肠的粘液meprinβ-deficient老鼠现在发现。Meprinβ是一个内生zinc-dependent metalloprotease现在显示裂开的氨基端区域MUC2粘蛋白在两个特定的网站。当重组meprinβ被添加到附加粘液meprinβ-deficient老鼠,粘液上皮脱离。类似于meprinβ-deficient老鼠,无菌鼠上粘液,因为他们没有摆脱membrane-anchored meprinβ细胞腔的粘液。老鼠的回肠粘液囊性纤维化(CF)和非功能性囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)频道最近被证明是附着于上皮。增加重组meprinβCF粘液没有释放粘液,但进一步的碳酸氢盐呈现CF粘液正常,这表明MUC2展开暴露了meprinβ乳沟网站。因此粘液分泌附加到杯状细胞,需要一种酶,meprinβ在小肠,分离,释放到肠道内腔。 This process regulates mucus properties, can be triggered by bacterial contact, and is nonfunctional in CF due to poor mucin unfolding.
T他从self-digestion胃肠道(GI)保护呼吸道和微生物群粘液(1)。这种粘液是不同组织在整个胃肠道:胃和结肠有两层粘液系统附带一个内黏液层上皮,由分层粘蛋白表(2)。这一层是50 - 200µm厚和令人费解的细菌,不断重新由杯状细胞,分泌黏蛋白,进一步向腔proteolytically转换成nonattached和密度较低外黏液层。这外层的栖息地和营养来源是共生的细菌(2)。相比之下,小肠只有一个单一的粘液类型不附着于上皮细胞(3)。
的主要结构部件肠道粘液是高度糖聚合物MUC2黏液密集在杯状细胞,分泌和1000倍扩张形式平坦,呈网状结构堆叠在冒号(分层粘蛋白表4)。同一MUC2不同方式处理粘蛋白在小肠出现绒毛之间较少的组织,但仍然充满了空间(3)。这种粘液是轻松地吸气和穿透细菌珠子的大小(3)。细菌可以穿透,但仍然绒毛之间的空间是保持自由的细菌在小肠由于有效的肠蠕动,快速粘液更新,高浓度的抗菌肽和蛋白质(3,5)。事实上,作为nonattached小肠粘膜的结构和更少的组织层模拟的情况外结肠黏液层已被证明是来自内心的黏液层MUC2蛋白水解处理的粘蛋白(2)。
Meprins是zinc-dependent metalloendopeptidases和虾红素家族属于(6)。他们包括两个同源酶,meprinα和meprinβ,哪里meprinα是分泌和meprinβmembrane-tethered变体。他们可以形成形成(meprinα和β),为(meprinβ),和大寡聚物(meprinα),形成最大的分泌蛋白酶复合体。虽然两个酶共享一个共同的域结构,他们表现出不同的特性在底物特异性识别和乳沟。酶可以水解多种底物,如生长因子、肽激素,或化合物的细胞外基质胶原三世,纤连蛋白和tenascin-C (7⇓- - - - - -9)。的meprinβ酶是高度小肠肠上皮细胞的表达,从而局部接近粘蛋白网络(10)。
囊性纤维化(CF)是一种严重的疾病,影响身体的大部分食用器官(11)。疾病引起的非功能性囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)频道,通常介导被动运输的氯离子和碳酸氢根离子(12,13)。虽然大多数的临床CF症状可以归因于停滞的粘液,更精确的联系缺乏雌性生殖道功能和粘液性质已经很难理解。我们最近表明CF小鼠的小肠粘液,与WT,附着在上皮和无法抽出物(14)。尽管CF老鼠只有轻微的肺部问题,他们肠道表型类似于人类疾病的特点是胎粪性肠梗阻和远端肠阻塞综合症(量)。当CF粘液分泌到∼100毫米碳酸氢盐溶液,粘液被释放的附件。黏蛋白在杯状细胞密集granulae Ca2 +离子和低pH值和碳酸氢盐的作用是去除Ca2 +离子和增加的pH值,使粘蛋白扩张(> 1000倍4)。已形成粘液碳酸氢处理时,粘液规范化,可能吸入,尽管其增加粘蛋白密度仍基本不变的(14)。这表明粘蛋白吸附和扩张可能不同的现象,使我们进一步分析。
我们现在发现meprinβ能够打通MUC2粘蛋白N端,这是参与了超然的粘液小肠在过程控制的细菌和CFTR功能检测通道。我们因此描述基本本构机制涉及一个内源性蛋白酶作用于粘液网络改变它的附加属性。
结果
Meprinβ-Deficient小鼠表现出明显的粘液在小肠表型。
与附加和密集的粘液CF老鼠的小肠(CftrΔF508)、WT老鼠展览组织松散,nonattached层粘液。这可以观察到与一个anti-Muc2抗体(免疫染色图1一个和C)。寻找潜在候选人酶释放CF粘液和预期的组织分布集中我们的注意力在zinc-dependent metalloprotease meprinβ(MEP1B),这个膜结合酶高表达在小肠刷状缘的肠上皮细胞,因此本地化接近MUC2分泌黏蛋白(图1G)(10,15)。老鼠的回肠粘液缺乏metalloprotease meprinβ(Mep1b−−/)部分像CF表型,这些动物表现出密集的粘液(图1B)。这是更明显的阿尔新蓝/周期性acid-Schiff (PAS)染色显示粘液,似乎更多的胶粘剂和附加到杯状细胞,CF老鼠一样(图1E和F)。观察过,WT小鼠的小肠粘膜,但不是CF粘液,可以通过简单地在正常生理条件下吸气吸量粘液形成组织外植体(图1J和l)(14)。的meprinβ-deficient老鼠(图1H)有粘液,像CF老鼠和抽出物是不可能的(图1K),支持组织染色的视觉印象。结肠内的黏液层不穿透细菌或荧光珠大小的小细菌(0.5 - 1µm)与外小肠结肠黏液层和WT (图1米)(3,16)。正如前面观察,CF老鼠的小肠粘膜不穿透这些荧光珠(图1O)。当Mep1b−−/分析了老鼠,珠子能够穿透粘液,但仍有些珠子停留在表面粘液(图1N)。
Muc2黏液组织依赖于metalloprotease meprinβ和Cftr功能检测通道的存在。(得了)Muc2染色(绿色)在小肠(回肠)WT, Mep1b−−/老鼠,CftrΔF508 (CF)。(D- - - - - -F阿尔新blue-PAS-stained。黄色箭头强调高脚杯cell-anchored粘液。(胃肠道)Meprinβ染成红色。DNA是由DAPI可视化。(J-L)粘液形成回肠外植体的厚度测量前(前)和后(post)愿望(* *P< 0.01,n在WT (= 5)。J)粘液可以吸气,但是不在Mep1b−−/(K)和CftrΔF508 (l)(n。,nonsignificant,n= 6)。(M-O)荧光珠(1µm绿色2µm,紫色,红色0.5µm)被应用于粘液在回肠外植体形成,和他们共焦z-stacks渗透进行了分析。绒毛用蓝色染色。粘液表面由黄线标记。Cr,地下室;去,杯状细胞;陆,腔;第六,绒毛。(酒吧、规模50µm。)
缺乏meprinβ不能单独解释为什么CF粘液,作为meprinβ是染色同样在CF和WT老鼠(图1我)。此外,在Mep1b粘液性质不同−−/和CF老鼠CF粘液不透水荧光珠大小的细菌,而Mep1b−−/老鼠更穿透粘液接近WT老鼠(图1N和O)。这使我们认为meprin蛋白水解活性的β可以负责分离和改变小肠粘膜的组织,但meprinβ- Cftr-deficient老鼠不一样的。
Meprinβ劈开MUC2黏液,释放D1-D2域组件。
进一步说明的效果meprinβ,我们应用安装组织外植体的顶端被meprin抑制剂actinonin WT老鼠(17)。粘液形成抑制剂目前不再是可以拆卸的愿望(图2一个),再次表明meprinβ参与分泌粘液的发布网络。增加重组meprinβ从Mep1b外植体组织−−/使粘液(可移动的愿望图2B)。Meprinβ因此恢复正常粘液表型Meprinβ-deficient外植体,证实其重要性的蛋白水解调节器小肠粘液性质。
Meprinβ劈开MUC2黏液在两个不同的网站。(一个)Meprinβ蛋白酶抑制剂actinonin(1µM)添加到WT小肠外植体,和粘液分泌刺激(n= 5)。B重组人类meprinβ(200海里)被添加到回肠Mep1b的粘液−−/外植体导致分离粘液(*P< 0.05,n= 4)。C人类MUC2黏液)域的结构。绿色(PTS)是指分域成为O-glycosylated形成粘蛋白域。(D)Domain-annotated n端MUC2的一部分与解理网站由埃德曼排序显示。(E)重组人类MUC2氨基蛋白(MUC2N Ctrl 20µg)孵化了重组人类meprinβ(+ rhMepβ500海里),分析了SDS凝胶/页面。孵化与actinonin抑制MUC2N的乳沟meprinβ。色箭头指向乐队受到埃德曼测序,和相应的乳沟网站所示D。
MUC2黏液是粘液的主要和加结构分子,因此最有可能的目标,我们问meprinβ裂开MUC2蛋白。本机MUC2不溶性,我们使用重组部分MUC2体外研究黏蛋白(图2C和D)。C末端和CysD2域未受影响,但氨基部分(MUC2N)被重组meprin裂解β,蛋白酶抑制剂的乳沟抑制actinonin (图2D和E)。两个新乐队130和110 kDa的近似质量出现了。这些乐队受到埃德曼测序,确定了n端氨基酸序列686年上海C勒690年和754年LIGQS758年的域MUC2 N末端被分配根据最近的注释的血管性血友病因子(VWF) (图2D和无花果。S1和S2)(18)。的乳沟SHCLE之后发布的预测特异性,而其他没有(19)。之间的乳沟站点位于TIL2和MUC2的E2和直到′域N末端见图2D。根据这个注释,第一次卵裂预计将由二硫键结合在一起,而第二个是(图2D)。这表明包含血管性血友病的氨基端MUC2年底D1和D2议会将分开MUC2的其余部分序列中的粘蛋白的乳沟QIR /闲逛。该裂解位点同样位于furin裂解位点的血管性血友病因子(20.)。在这种情况下,解理发生细胞,和包含D1和D2的氨基端部分组件是分开的血管性血友病因子分泌后聚合物。尽管锚定机制MUC2的杯状细胞,不知道释放MUC2的氨基端部分不会影响聚合物呈网状成熟MUC2的性质。因此可以认为MUC2 N终点站是MUC2的锚点,及其分离与其他附加粘蛋白MUC2的释放。
Meprinβ不脱落的上皮表面在无菌条件下。
无菌的结肠粘液系统(GF)动物类似于WT动物(2)。在小肠,粘液是欠发达和稀疏的,也反映在Muc2 mRNA水平较低(图3一个和B)。令人惊讶的是,女朋友老鼠的粘液是比在殖民老鼠(附无花果。1J和3C)。水平meprinβmRNA在女朋友没有明显低于传统的提高(CONVR)小鼠(图3B)。当女朋友老鼠殖民与CONVR ceacal植物,可以吸入后回肠粘液6周(图3D)。有趣的是,当小肠组织染色为meprinβ,这种酶是在女朋友更丰富的上皮细胞表面,与传统相比提高了小鼠(CONVR,图3E)。当回肠whole-tissue溶解产物收集和分析通过免疫印迹meprinβ,特定的乐队的身份观察也证实了蛋白质组学在140 kDa CONVR和GF组织(图3F)。然而,裂解,从而可溶性meprinβ只是发现CONVR粘液的老鼠。,meprinβ分泌出的黏液是证实了蛋白质组学的研究吸气粘液显示meprinβCONVR老鼠的粘液,但不是女朋友老鼠(图3G)。因此,释放连接GF粘液是依赖meprinβ被肠上皮细胞分泌出粘液。的metalloproteases ADAM10和ADAM17已被证明参与脱落meprinβ细胞表面(21,22)。因此,我们分析了ADAM10和17 mRNA表达水平在整个组织,但这两个显示,GF水平显著降低,因此很可能不足够改变解释缺乏meprin GF粘液β(S3无花果。)。然而,缺乏meprinβ脱落与CONVR老鼠相比,GF表明这种酶的脱落是可能由细菌引发的挑战或微生物信号。因此,粘液由细菌处理可以激活和刺激,引起细菌被冲走的粘液。通过这种方式,蛋白水解作用可能导致快速远端小肠运输粘液和细菌。
无菌鼠上粘液,meprinβ不是从肠上皮细胞脱落。(一个)Muc2组织化学染色,在女朋友老鼠。(B)的mRNA表达meprinβ和Muc2 GF与CONVR相比减少了。(C)是不可能完全消除粘液GF回肠外植体(*P< 0.05,n= 4)。D)女朋友老鼠殖民CONVR ceacal植物呈现粘液正常;因此可以吸入后6周(* *P< 0.01,n= 5)。E)GF回肠组织化学染色显示更强的meprinβ染色在女朋友比CONVR老鼠。(F)免疫印迹的回肠溶解产物meprinβ显示更多长篇membrane-anchored meprinβ比CONVR GF和裂解的外观(溶)分泌meprin CONVR。(G回肠外植体)粘液吸气的蛋白质组分析显示meprin CONVR和CftrΔF508β肽,但不是女朋友粘液(*P= 0.03,n= 4)。(酒吧、规模50µm。)
附加CF粘液只是展开后发布。
小肠的粘液CftrΔF508老鼠是附着于上皮细胞(图1l),但可以几乎完全规范化,允许Muc2粘蛋白分泌到一个腔的NaHCO∼100毫米3缓冲(图4一个)(14)。这种超然可以完全抑制的除了meprin抑制剂actinonin表明CF Mep1b粘液也有类似的释放机制−−/老鼠(图4B)。相比之下,增加重组meprinβ不正常化CF粘液送气音仍是不可能的(图4C)。在吸气CF粘液分泌meprinβ被发现蛋白质组学(图3G)暗示的附加Muc2黏液CftrΔ508老鼠并不是由于低水平的meprinβ分泌酶或失败。
回肠CF粘液的附件是依赖碳酸氢盐和meprinβ。(一个)从CftrΔF508老鼠分泌粘液与115毫米NaHCO缓冲区3给一个超然的粘液(P< 0.008,n= 5)(10)。(B)添加actinonin(1µM)从CftrΔF508老鼠分泌粘液变成一个115毫米NaHCO3缓冲抑制粘液脱离(n= 5)。C)增加重组人类meprinβ(200海里)从CftrΔF508回肠外植体小鼠没有分离粘液(n= 4)。D)Meprinβ活动在不同的缓冲条件下(酸碱5到7.4),有(黑条)和没有CaCl(灰条)50毫米2;n= 4。(E)MUC2N由meprin裂解β在没有CaCl酸碱5和62但不影响和形式大寡聚物(黑色箭头)的影响下CaCl 50毫米2。(F)示意图MUC2粘蛋白N端及其演变成HCO的存在3−在分泌。颜色是一样图2C。
雌性生殖道通道负责Cl−和HCO3−运输和CF粘液分泌到高浓度后被释放从附件碳酸氢盐缓冲(13),这表明碳酸氢盐是必要的激活meprinβ或展开MUC2黏液,允许处理meprinβ。Meprinβ是活跃在酸性pH值,但Ca的额外影响2 +是未知的(23)。检测重组meprinβ活动显示Ca2 +抑制高pH值,但不是在pH值5 (图4D),使其不太可能附加的CF粘蛋白是由活动meprinβ。第二个选择是测试通过孵化重组MUC2N pH值和不使用Ca 5和62 +导致包装和环形结构的形成(4)。MUC2N被裂解为在Ca2 +无缓冲,但MUC2N在Ca的存在影响2 +离子在大MUC2N复合物也观察到(图4E箭头)。虽然我们没有任何结构细节的包装D1-D3 MUC2 N末端的总成,有人建议,基于与血管性血友病因子比较,D1-D2总成折叠回到到D3大会,清晰了图4F(4)。的meprinβ乳沟网站(图2D)很可能无法访问的构象,直到粘蛋白一直是正确的和公开的网站。这或许可以解释为什么meprinβ不释放附加CF粘液(图4C)。
讨论
粘液保护肠一直被忽略,认为是被动的和静态。小肠粘液覆盖所有空间之间的绒毛也大多数绒毛技巧(3)。然而,这种粘液通常是不附,很容易与肠道内容和蠕动波,暴露出绒毛小贴士腔的内容和细菌。发现无菌鼠小肠粘液不动并附着在小肠上皮细胞表明也有一个动态的粘液保护系统。可以想象,移动粘液可以很容易地运输细菌困在粘液远侧地,以这种方式有效地保持上皮自由的细菌。作为CF老鼠从附加的粘液,粘液停滞将很容易引起细菌过度生长(11,24,25)。
Meprinβ不流到无菌鼠的粘液,但剥离后细菌或微生物信号肠上皮细胞接触。背后的机制耦合的细菌和meprinβ脱落是未知的,必须单独处理。因此,粘液由细菌处理可以激活和刺激,因此捕捉病原体内粘液,让他们远离的上皮protease-controlled“冲洗”系统。因此,蛋白水解作用有助于快速远交通和高效传输小肠内的粘液和细菌。
杯状细胞和他们的主要产品,MUC2粘蛋白,最近被证明参与抗原CD103表示+参与耐受性树突状细胞,可能流程(26,27)。MUC2的处理粘蛋白和乳沟meprinβ成nonattached形式对这些过程可能是重要的。
我们确定了两个具体的乳沟的meprin MUC2N重组β,靠近彼此TIL2和MUC2 E2和直到′域之间的N末端见图2D。MUC2的QIR /闲逛裂解位点将单独的血管性血友病D1-D2域MUC2黏液。分子的性质MUC2锚杯状细胞是未知的,很难揭示,随着MUC2粘蛋白是不溶性(28)。虽然MUC2锚是未知的,分离的氨基端MUC2的一部分剩余MUC2不会影响聚合物呈网状成熟MUC2黏液的性质。因此可以认为MUC2 N末端的定位锚点MUC2和它的分离与其他附加粘蛋白MUC2的释放。MUC2分泌大量聚合物,聚合物只有单附件网站是必要的,使问题的揭示这个锚的分子性质更加困难(4)。有人建议D1-D2总成折叠到D3大会,中概述图4F,使meprinβ乳沟网站无法访问,直到粘蛋白已经正确地展开。这或许可以解释为什么meprinβ没有释放连接CF粘液。因此可以预测,纠正附加的CF粘液表型必须解决蛋白水解分裂事件的演变过程,而不是。
Meprinβ因此调节回肠粘膜系统的一个关键球员MUC2蛋白水解分裂的粘蛋白N端,从而帮助重组粘蛋白的结构网络。不仅是附件这是受到影响,而且粘液性质,细菌侵入Mep1b大小的珠子−−/粘液上远远低于在WT。观察到meprinβ必须释放肠上皮细胞表明分歧必须发生在分泌或杯状细胞分泌粘液。我们之前和现在的观察(图1)表明,MUC2粘蛋白附着在杯状细胞(14)。目前的结果确定的必要性meprinβ粘蛋白释放的杯状细胞在小肠。结肠MUC2的黏液也必须释放时,杯状细胞粘液转换从内到外黏液层,但是这个过程在Mep1b不受影响−−/老鼠。因此,它可能表明,MUC2粘蛋白通常仍然附在分泌,需要meprinβ在小肠和结肠的未知的蛋白酶分离。同样的,其他三个人gel-forming黏蛋白(MUC5B、MUC5AC MUC6)也可能保持连接后分泌,与一般的假设相反,需要释放蛋白酶活动。附加的CF粘液不仅会导致肠道阻塞综合症在CF(量),但也改变了微生物群与CF中发现细菌过度繁殖的小鼠和人11,24,25)。这表明一个nonattached小肠粘膜通常是重要的细菌数量相对较低的这部分胃肠道的生理作用,并建议系统粘液释放这里描述。附加的小肠CF粘液不能规范化的特定的蛋白酶也表明CF表型的正常化黏液来拯救展开了碳酸氢的浓度足够高。人类CF肺表型和疾病的解释与停滞不前的粘液也应该寻求使用的原则gel-forming黏蛋白被附加到他们分泌细胞。
材料和方法
动物。
所有动物程序是经当地实验动物伦理委员会批准,哥德堡。CftrΔF508 C57BL / 6,老鼠和Mep1b−−/单独通风不足的老鼠被关在笼子里。无菌动物被保存在灵活的电影孵化器。纯合子CftrΔF508小鼠C57BL / 6背景(back-crossed 13代)作为描述,但鉴于常规水2 - 3 d使用前(29日)。老鼠用于实验12到16周。GF老鼠(8 - 10周)填喂法与ceacal WT 6周后小鼠和研究内容。
组织学,免疫染色,荧光显微镜。
固定和回肠段组织化学染色进行不冲洗腔的内容(2)。染色与执行anti-meprinβ(AF3300、研发系统)。
Meprinβ劈理分析和埃德曼测序。
我们使用的氨基端构造MUC2N (SNMUC2-MG),长度为1699个氨基酸,由一个信号肽序列,第一个三血管性血友病D-assemblies mucin-type脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸的片段(PTS)丰富的重复区域或粘蛋白域,和cysteine-rich (CysD1)域(30.)。重组蛋白CysD2 [SMCysD (2 tr) -IgG2aH], c端(SMG-MUC2C) MUC2也测试(31日,32)。作为一个消极的控制,抑肽酶1µM补充道。劈理分析在不同pH值和钙条件下,各种缓冲区进行测试(Mes pH6 20 mM Mes pH5, 20毫米,20毫米三/ HCl pH7, 20毫米玫瑰pH7.4,和20毫米三/ HCl pH8)。测试如果钙影响MUC2N的乳沟,CaCl 50毫米2被添加到每个缓冲区。重组MUC2N (500 ng)和缓冲preincubated 1 h,并进一步孵化与meprinβ(14海里)在室温下2小时。10%聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹抗体对一个序列在D3域(anti-MUC2N3)揭示了乳沟事件meprinβ。此外,在这些特定条件下酶活性进行了测试与EnzChek蛋白酶试验装备使用Bodipy-labeled酪蛋白作为衬底(技术)。协议修改如下:基质应用于缓冲区直接从股票解决最后一个10µg /毫升的浓度。Meprinβ或胰蛋白酶(作为一个积极的控制)添加了相应的(20海里)。分析了板在维克多二世标使用标准荧光素过滤器(485/530 nm)(优秀)。
埃德曼测序,20µg MUC2N被孵化2µg(500海里)重组meprinβ16 h在37°C,然后分离(wt /卷)10% SDS凝胶和涂抹PVDF膜(1 h, 100毫安)。吸水后,膜被Coomassie彩色R250[0.1%考马斯亮蓝R250在40%乙醇(卷/卷),20%(卷/期)乙酸)1 h,然后在20%(卷/期)乙醇脱色直到乐队都清晰可见。埃德曼测序进行卡罗林斯卡医学院的核心设施,斯德哥尔摩。
比对和序列分析。
序列比对的氨基端部分人类MUC2(加入号码Q02817),小鼠Muc2(加入Q80Z19数量),显示和血管性血友病因子序列(人类VWF;加入数量P04275)(182.1)进行ClustalX进一步手动审查和编辑GeneDoc 2.7软件。
实时定量PCR。
小肠的mRNA溶解产物提取使用试剂盒RNeasy装备根据制造商的指示(试剂盒)。量化后Nanodrop分光光度计,1µg信使rna与高容量reverse-transcribed cDNA逆转录工具包(技术)。定量PCR分析,20 ng cDNA混合添加到PCR (SsoFast EVAgreen supermix 2 x,最后引物的浓度:200海里,反应体积:20µL Bio-Rad)。管家基因,GAPDH和β-Actin用于规范化。PCR进行一个Bio-Rad排名96 (Bio-Rad)。研究中使用的序列是GAPDH:转发:5′TGT TAC CCC CAA TGT三大移行细胞癌,相反:5′ctc AGT GTA GCC CAA手枪GC-3;β-Actin:转发:5′aac GAG CGG TTC CGA TGC-3′,相反:5′gta GT柠檬酸TGG ATG CCA CAG三大′;Meprinβ:转发:5′cag GCA gg AAC ACA行动TC-3′,相反:5′tct GTC 20 TTC TGG AAA三大′;Muc2转发:5′ggc TCG棉酚CTC CAG AAA三大′,相反:5′cca GGG AAT CGG标签ACA TC-3′;ADAM10:转发:5′-GGG gg柠檬酸GTA TGG AAA TC-3′,相反:5′atg TGA广汽TGC TCG TTT三大′; ADAM17: Forward: 5′-AAA CCA GAA CAG ACC CAA CGA-3′, Reverse: 5′-GTA CGT CGA TGC AGA GCA AAA-3′. PCR cycle conditions were denaturation (94 °C for 30 s), annealing (57 °C for 30 s), and extension (72 °C for 45 s); number of cycles: 30.
确认
鲍勃他是CftrΔF508老鼠承认博士和博士乔治Birchenough被公认为帮助文本编辑。这项工作得到了瑞典研究理事会,瑞典癌症协会,克努特和爱丽丝•瓦伦堡基金会因加布丽特和阿恩Lundberg基金会Sahlgren大学医院,威廉和玛蒂娜·朗格的基础,Torsten och Ragnar soderberg Stiftelser,萨尔格学院,国家过敏症和传染病研究所(U01AI095473)和瑞典基金会战略Research-Mucus细菌和结肠炎社保基金中心(MBC)先天免疫程序。这项工作也支持的德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)合作研究中心(CRC877)项目A9。
脚注
- ↵1人信件应该解决。电子邮件:gunnar.hansson在{}medkem.gu.se。
作者的贡献:促销,M.E.V.J.,一个。米。R.-P., and G.C.H. designed research; A.S., A.E., M.E.V.J., and A.M.R.-P. performed research; C.B.-P., F.B., S.M., D.L., and J.S.B. contributed new reagents/analytic tools; A.S., A.E., M.E.V.J., A.M.R.-P., and G.C.H. analyzed data; and A.S., A.E., and G.C.H. wrote the paper.
作者宣称没有利益冲突。
这篇文章是一个PNAS直接提交。A.J.M.由编辑部邀请客座编辑。
这篇文章包含支持信息在网上www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 pnas.1407597111 /——/ DCSupplemental。
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引用
文章分类
- 生物科学
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