TLR2和TLR9协同控制大脑单纯疱疹病毒感染gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

早期宿主对病毒感染的先天反应的特征是产生I型ifn、促炎趋化因子和细胞因子(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)以及直接的抗病毒细胞活性。这是宿主防御的第一道防线，在抵御病毒感染中起着重要作用(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，通过ifn直接抑制病毒复制(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，以及NK细胞的细胞毒活性(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．此外，对于先天抗病毒反应的直接杀病毒功能，IFN-α/β与IL-12等一起刺激后续适应性免疫反应的发展，这对病毒消除和保护性免疫的发展很重要(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．因此，激活一种先天抗病毒反应既提高了对抗感染的早期屏障，又形成了随后的特异性免疫反应。gydF4y2Ba

抗病毒反应是由细胞种系编码模式识别受体(PRRs)启动的。gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba识别病毒病原体相关分子模式(PAMPs)并激活细胞内信号转导，从而刺激抗病毒功能(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．TLRs代表一类膜结合PRRs，它识别细胞外或内体环境中的pamp，而其他PRR系统似乎负责检测细胞质中的病原体(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．鉴于许多prr的存在，病原体经常被多种受体识别也就不足为奇了(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)，因此，了解PRRs如何协调宿主对特定病原体的反应是很重要的。gydF4y2Ba

HSV是一种属于阿尔法疱疹病毒类的包膜DNA病毒，分别由TLR2和TLR9通过识别仍未识别的病毒表面成分和病毒基因组DNA检测到(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)．尽管与野生型(WT)小鼠相比，缺乏TLR2的小鼠对致死性HSV-1脑炎具有相似的病毒载量(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)，它们在感染HSV-1后引发较弱的炎症细胞因子反应。在体外，大多数研究表明，当TLR2失去功能时，hsv诱导的促炎细胞因子表达减少(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．浆细胞样树突状细胞(pDC)通过TLR9识别HSV (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)，而缺乏该受体的小鼠在HSV感染后的早期时间点很少产生I型IFN或IL-12p40 (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)．然而，对于这两种单一敲除(KO)小鼠品系，迄今为止发表的大多数研究表明，在对抗HSV感染的先天防御方面没有很强的表型(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)．之前已经证明MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠极易感染致死性HSV脑炎(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)，最近研究表明TLR2和TLR9在感染HSV期间以合作方式激活传统dc (cDC) (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．因此，有数据表明，这些TLRs共同协调宿主对HSV感染的反应。有趣的是，TLR2和TLR9被特别报道在宿主反应细菌和寄生虫的激活中协同作用(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在这里，我们使用了TLR2和TLR9单KO和双敲除(DKO)小鼠与MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}这两个prr是先天性抗HSV抗病毒反应中myd88依赖部分的主要原因。TLR2和TLR9协同作用，诱导早期细胞因子和细胞反应，从而限制大脑中的病毒载量。gydF4y2Ba

生长培养基为MEM、DMEM、IMDM和RPMI 1640(均来自BioWhittaker)，添加抗生素(青霉素200 IU/ml，链霉素200 μg/ml)和不含脂多糖的FCS (BioWhittaker)。BSA来自Sigma-Aldrich, Depo-Provera来自Pfizer, GM-CSF来自R&D Systems。肝素来自利奥制药，异氟醚来自百特，淋巴液来自Cedarlane实验室。CFSE来自Molecular Probes, NK1.1-FITC、CD3-PE、CD69-PerCyP5.5和7-氨基放线菌素D来自BD Biosciences。使用的TLR配体为PamgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(TLR2)和ODN1826 (TLR9)来自InvivoGen。gydF4y2Ba

本研究使用的无特异性病原体的近交系小鼠为8 - 12周龄、年龄匹配的雌性C57BL/6J、TLR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}, TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}, TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}．所有敲除小鼠菌株均以C57BL/6J为背景。TLR2 C57BL / 6 jgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}, TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}， TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠在Taconic M&B繁殖，MyD88小鼠在哥本哈根大学的动物设施繁殖。TLR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠来源于东方酵母。所描述的所有动物实验都经过丹麦政府当局的审查和批准，因此符合丹麦法律。gydF4y2Ba

骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)是通过以下方法获得的:手术切除股骨和胫骨，释放肌肉和肌腱，并在70%乙醇中短暂悬浮。切断末端，用10% RPMI 1640冲洗骨髓，细胞悬浮液在70 μm细胞过滤器(BD Falcon)上过滤，以1330转/分钟的速度离心5分钟。洗涤2次后，细胞以2 × 10重悬gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在RPMI 1640中加入10% FCS和GM-CSF (40 ng/ml)，并在细菌培养皿中播种，在37°C和5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．第3天添加相同的新鲜培养基，第5天和第7天更换新鲜培养基。培养第10天，取非贴壁细胞，离心，台盼蓝计数，RPMI 1640-10% FCS, GM-CSF (20 ng/ml)重悬，1 × 10接种gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba/ml在细胞培养皿中。第11天采集非贴壁细胞用于实验。流式细胞术检测细胞为髓系树突状细胞(>95%为CD11c)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)(数据未列示)。为了从小鼠脾脏中分离原代细胞，手术切除器官，转移到含有5% FCS的RPMI 1640中。然后将脾脏转移到1mg /ml的胶原酶D悬液中(Roche)。将酶注射到器官中，随后将其切成小块，然后在37°C的胶原酶D悬浊液中孵育30分钟。悬浮液经孔径为70 μm的细胞过滤器过滤，旋压后悬浮于RPMI 1640-5% FCS中，计数细胞数。离心后，细胞重悬于含有2 mM EDTA-0.5% BSA (MACS运行缓冲液)的PBS中，浓度按照制造商说明书(Miltenyi Biotec)。加入抗mpdca -1微珠，在4°C孵育15分钟后，将悬浮液旋转并悬浮在运行缓冲液中。然后在autoMACS分离器中通过阳性选择分离pDCs。阴性选择的细胞片段与抗cd11c孵育，通过阳性选择和阴性选择分离细胞。分离的细胞片段被旋转，在RPMI 1640-5% FCS中悬浮，并计数。 For determination of ex vivo cytokine production, the cells were cultured for 24 h at a concentration of 3.0 × 10^6gydF4y2Ba100 μl RPMI 1640 + 5% FCS，采集上清液测定细胞因子。脾白细胞(SLs)用于流式细胞术和NK检测如下:按上述方法取脾，5% RPMI 1640均质，70 μm细胞滤网过滤。根据制造商的建议，在淋巴液中分离白细胞。用含5% FCS和20iu /ml肝素的PBS收集腹膜细胞。细胞在RPMI 1640-5% FCS中洗涤、计数并重悬。gydF4y2Ba

所用病毒为HSV-2 (MS和333株)。病毒在Vero细胞单层上生长以完成细胞病变效果，冷冻和解冻一个周期，然后在5000 ×下离心30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba用于清除细胞碎片。gydF4y2Ba

阴道感染HSV-2时，8 ~ 9周龄小鼠经皮下注射Depo-Provera 2 mg预处理。5 d后，异氟醚麻醉小鼠，6.7 × 10阴道内接种gydF4y2Ba^4gydF4y2BaHSV-2 333株PFU悬浮于20 μl IMDM中。将小鼠仰卧，在麻醉下维持至少10分钟。每天对生殖器感染的小鼠进行检查，并对生殖器炎症、神经系统疾病和死亡进行评分。疾病严重程度按以下评分进行分级:0分，健康;1、生殖器红斑;2、生殖器炎症中度;3、生殖器病变化脓性和/或一般状况不好;4、后肢瘫痪(小鼠处死)。对于全身感染，8 ~ 12周龄雌性小鼠用1 × 10感染ippgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaHSV-2 (MS株)PFU。在感染后指定的时间点处死动物，并测定感染器官中的病毒载量。gydF4y2Ba

NK细胞的细胞毒性在基于流动的杀伤试验(FloKA)中进行测定，该试验是由Lecoeur及其同事描述的方法(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)．简单地说，在实验前24小时用HSV-2感染小鼠。腹膜细胞(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml)用500 nM CFSE在PBS-0.1% BSA中标记，在37°C下标记10分钟。然后将细胞清洗两次，并立即用于检测。将cfse标记的细胞与YAC-1靶细胞(5万个/孔)以不同比例(E:T比为15:1、5:1和2:1)孵育，并将靶细胞单独孵育于96孔微孔板中，在150 μl RPMI 1640-10% FCS中，5% CO中孵育4小时，测量细胞的自发凋亡gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和37°C。细胞悬液在PBS-0.1% BSA中洗涤后，在4℃黑暗条件下，以20 μg/ml的7-氨基放线菌素D孵育20 min。细胞样本在PBS中洗涤，在PBS-1%多聚甲醛中重悬，并立即在Beckman Coulter FC500上分析(20,000个细胞/样品)。为了分析NK1.1或CD69表达，将细胞与以下Abs: NK1.1- fitc、CD3-PE和CD69- percyp5.5在4℃黑暗环境下孵卵20分钟。细胞样本在PBS中洗涤，在PBS-1%多聚甲醛中重悬，并在Beckman Coulter FC500上分析(20,000个细胞/样品)。gydF4y2Ba

在用于斑块测定之前，将肝脏和大脑样本称重、解冻并在添加5% FCS的MEM培养基中均质3 × 5秒。均质后，以1620 ×离心成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba上清液用于菌斑测定，在添加5% FCS的MEM中以1.2 × 10密度接种Vero细胞gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba放在直径5厘米的盘子里静置一夜。用100 μl连续稀释的器官悬液和400 μl培养基在37℃下孵育1 h，期间每15 min摇一摇组织培养板，以确保病毒均匀分布。随后，取出器官悬液，将8 ml MEM添加到板中。培养基中添加2.5% - 5%的FCS(取决于培养时细胞的融合程度)和0.2%的人Ig。细胞在37℃孵育2天，0.03%亚甲基蓝染色，最后计数斑块。gydF4y2Ba

Luminex使用Bio-Rad试剂盒检测血清和上清液中的细胞因子水平。简单地说，用测定缓冲液清洗滤板，并在每孔中加入50 μl新鲜漩涡ab共轭珠。用测定缓冲液清洗板，加入样品和标准品。在短暂摇晃(1100转/分钟，30秒)后，在室温下，在黑暗中轻轻摇晃(300转/分钟)，孵育2小时。洗涤一步后，每孔加入检测Ab 25 μl，摇板孵育。随后，用50 μl streptavidin-PE溶液清洗并摇晃孵育30分钟(1100 rpm下30秒，300 rpm下10分钟)。最后，清洗培养皿，每孔加入125 μl的检测缓冲液，以1100 rpm的转速震动培养皿10 s，并立即在Bio-Plex机器上读取。gydF4y2Ba

IFN-α/β生物活性用L929细胞生物测定法测定。L929细胞(2 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba在含5% FCS的MEM中，连续2倍稀释样品或以小鼠IFN-α/β为标准，在37℃下孵育过夜。随后，将水泡性口炎病毒(VSV/V10)加入孔中，细胞孵育2-3天。IFN-α/β 1 U/ml为50%保护性稀释剂。gydF4y2Ba

根据制造商的建议，用TRIzol (Invitrogen)提取总RNA。简单地说，在TRIzol中均质器官，加入氯仿，然后离心相分离。RNA用异丙醇沉淀，离心成粒。用80%乙醇清洗球团，并在不含rnase的水中重新溶解。为了生成cDNA，用oligo(dT)作为引物和Expand逆转录酶(均来自Roche)对RNA进行逆转录。在定量RT-PCR之前，RNA用DNase I (Ambion)处理以去除任何污染的DNA，在对照实验中证实了其缺失，其中省略了逆转录酶(数据未显示)。采用PCR扩增cDNA引物:β-actin，正向:5 ' -TAGCACCATGAAGATCAAGAT-3 '，反向:5 ' -CCGATCCACACAGAGTACTT-3 ';CXCL9, forward: 5 ' -GAA CGG AGA TCA AAC CTG CCT-3 ';反向5 ' -TGT AGT CTT CCT TGA ACG ACGA-3 ';TNF-α，正向:5 ' -ATC GGC TGG CAC CAC TAG TT-3 '，反向:5 ' -GTA GCC CAC GTC GTA GCA AAC-3 '。 Products were measured using SYBR Green I (Qiagen).

数据以均值±标准差表示。采用Wilcoxon秩和检验(gydF4y2BapgydF4y2Ba-值<0.05为有统计学意义)。gydF4y2Ba

这项工作中显示的结果来自于对所获得的结果具有代表性的数据。每组实验分别进行2 ~ 5次独立重复。gydF4y2Ba

先前的研究表明，在HSV-2感染后，pDCs是产生I型ifn的主要骨髓来源细胞类型，而且这种诱导几乎完全依赖于TLR9 (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)．Lund和同事们还表明，耗尽pDCs的小鼠容易受到阴道HSV-2感染(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)．为了进一步研究不同的TLRs和DC亚群在宿主对HSV-2感染的反应中的作用，我们在bm -DC(表现为髓系DC样表型)和脾pdc中检测了促炎细胞因子的诱导。最初，我们研究了TLR2激动剂Pam对IL-6的诱导作用gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba和TLR9激动剂ODN1826在BM-DCs中验证我们的tlr缺陷小鼠菌株的基因分型，如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba时，相应tlr缺陷细胞中IL-6的产生完全被取消。gydF4y2Ba

在BM-DCs中，HSV-2菌株333诱导IL-6、IFN-α/β和IL-12p40(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba抵扣gydF4y2Ba)．由于不同HSV株对TLRs的依赖性不同(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)，我们还检查了HSV-2菌株MS，它诱导了所有测量的细胞因子(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba外:我gydF4y2Ba)．我们还注意到，只有当病毒在加入细胞培养之前被紫外线灭活时，MS菌株才会诱导细胞因子(数据未显示)，这表明在这种细胞类型中，一种独立于病毒复制的识别机制是有效的，并且病毒在复制期间抑制了这种细胞反应。hsv诱导的IL-6、RANTES和IL-12p40的表达与TLR2和TLR9以及TLR2/TLR9中的细胞因子反应无关gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}BM-DCs与MyD88的反应相当gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}细胞。对于两种病毒株，TLR9中IFN-α/β的诱导显著降低gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}BM-DCs。当感染剂量增加5倍时也进行了类似的观察(数据未显示)。gydF4y2Ba

此前有报道称，不同的DC种群对hsv诱导的细胞因子表达表现出不同的TLR依赖性(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．因此，我们想要比较BM-DCs与小鼠脾脏采集的cdc的体外细胞因子反应。与BM-DCs一样，脾脏cdc对HSV-2感染的反应是IL-6、RANTES和I型IFN的表达升高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaJ-LgydF4y2Ba)，但不刺激IL-12 p40的表达(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．在cdc中，没有一种细胞因子是以依赖于TLR2或TLR9的方式诱导的。因此，BM-DCs和脾cdc诱导IL-6和RANTES的表达来响应HSV-2感染，而不依赖于TLR2和TLR9，而I型IFN的表达在BM-DCs中部分依赖于TLR9，而在脾cdc中不依赖于该受体。gydF4y2Ba

在pDCs中，IL-6、RANTES、IFN-α/β和IL-12p40在MS活株的反应中产生，而TLR9中这四种细胞因子的产生都强烈减少gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}而不是TLR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}髓(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ban qgydF4y2Ba)．TLR2/TLR9双缺陷pDCs与TLR9单KO pDCs相比，细胞因子水平没有进一步降低。因此，针对HSV-2的抗病毒和炎症细胞因子和趋化因子在脑转移- dc和pDCs中都被诱导产生。在脑转移- dc中，只有IFN-α/β依赖于TLR9，而在pDCs中，我们观察到所有测试的细胞因子都依赖于TLR9。gydF4y2Ba

在急性HSV感染期间，巨噬细胞在先天反应以及激活和塑造适应性免疫反应中发挥着重要作用，至少部分是通过产生趋化因子、ifn和促炎介质，如RANTES、IL-6和IL-12 (gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)．因此，我们还检查了感染HSV-2菌株MS和333时腹腔巨噬细胞产生的细胞因子。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba， HSV-2 333株感染诱导巨噬细胞产生IL-6、RANTES和IFN-α/β。关于对TLRs或MyD88的依赖，在所有TLR-以及MyD88缺陷的巨噬细胞中，IL-6和RANTES水平显著降低。HSV-2菌株MS也诱导IL-6、RANTES和IFN-α/β，但此处对TLRs的依赖性有所不同:IL-6的诱导部分依赖于TLR2, IFN-α/β依赖于TLR9，而RANTES的完全诱导似乎同时依赖于TLR2和TLR9。因此，对于腹膜巨噬细胞，TLR2和TLR9都是对HSV-2的完全细胞因子反应所必需的，但特异性TLRs的作用是细胞因子和病毒株特异性的。gydF4y2Ba

总之，我们观察到在hsv诱导的细胞因子产生过程中，只有pDCs完全依赖TLR9，而其他APCs同时使用TLR2、TLR9和其他识别系统来诱导这种反应。gydF4y2Ba

体内的HSV-2感染通常会导致强烈的细胞因子反应，诱导I型ifn、IL-6、IL-12、RANTES和TNF-α等(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)．数据见图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba证明在体外HSV-2感染过程中，不同类型的细胞在细胞因子诱导中对TLR2和TLR9的需求不同。在体内感染期间，许多类型的细胞可参与细胞因子反应(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)，为了进一步解决这一问题，我们从感染HSV-2 8小时的WT小鼠中分离出脾dcs、cdc和非dcs，以测量体外细胞因子的产生。在体内感染HSV-2后，pDCs产生大量I型IFN和RANTES，并且它们是感染后唯一显示这些细胞因子表达升高的细胞类型(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba-ⅰgydF4y2Ba)．在体内，HSV-2感染后，所有类型的细胞都诱导产生IL-6，在cdc中观察到最强的诱导(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．为了研究TLR2和TLR9在体内诱导细胞因子反应中的作用，我们测量了感染HSV-2的WT和KO小鼠血清中的细胞因子和趋化因子水平。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaJ-UgydF4y2Ba， TLR2/9 DKO小鼠IFN-α/β、IL-6、RANTES、KC水平均显著降低。对于IFN-α/β，这可能是由于缺乏TLR9，因为在TLR9单一KO小鼠中也看到了类似的减少。RANTES的诱导似乎依赖于TLR2和TLR9，在两个单一KO菌株中，RANTES的水平也显著降低。对于IL-6和KC的诱导，TLR2和TLR9的作用是冗余的，因为细胞因子的产生减少仅在DKO小鼠中观察到。总的来说，这些数据表明TLR2和TLR9对于体内对HSV-2感染的完整细胞因子反应是必要的，缺乏这两种PRRs会导致全身细胞因子水平的大幅降低。然而，在TLR2/9 DKO小鼠的血清中，所有测量到的趋化因子和细胞因子仍然被诱导，这表明除了TLR2和TLR9之外，PRRs对HSV-2感染的早期反应很重要。gydF4y2Ba

NK细胞是对抗许多病毒的第一道重要防线，包括HSV (gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)．NK细胞被细胞因子激活包括IFN-α/β和IL-12 (gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)，研究表明，在病毒感染期间，缺乏TLR2或TLR9会降低NK细胞的反应(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)．因此，我们检测了WT和TLR2/9小鼠脾脏的早期NK细胞反应gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠全身HSV-2感染期间。我们首先研究了TLR2和TLR9双缺陷如何影响脾脏的大小，并发现来自C57BL/6和TLR2/9的器官gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠的体重(在第0天和第1天)和恢复的细胞总数(数据未显示)难以区分。有趣的是，感染HSV-2的TLR2/9 DKO小鼠脾脏中NK细胞的含量明显低于WT小鼠(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．然而，当检测NK细胞的激活状态时，我们观察到早期激活标志物CD69的表达在脾脏NK1.1之间是相似的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba来自WT和TLR2/9 DKO的细胞(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．在检测从感染小鼠采集的腹膜细胞中CD69的表达时，也发现了类似的结果(数据未显示)。NK细胞的细胞毒活性是通过流式杀伤试验测定的，我们再次发现WT和TLR2/9双缺陷小鼠之间的NK细胞活性没有显著差异(数据未显示)。因此，虽然感染部位的NK细胞在C57BL/6J和TLR2/9中被激活的程度相同gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}在小鼠中，TLR缺陷导致NK细胞招募到脾脏的数量减少，从而可能导致感染病灶NK细胞反应的整体下降。gydF4y2Ba

上述结果表明，TLR2和TLR9在体外和体内共同形成对HSV-2的早期免疫反应。这让我们想知道TLR2和TLR9的联合功能是否控制了HSV-2在机体中的复制。我们比较了WT和TLR2-、TLR9-以及TLR2/TLR9缺陷小鼠抵抗由i.p.感染引起的全身HSV-2感染的能力。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2BaEgydF4y2Ba， TLR2和TLR9单株KO小鼠肝脏和大脑的病毒载量水平与WT小鼠相似。相比之下，TLR2/TLR9双缺陷小鼠的大脑中病毒含量明显高于WT小鼠，但在肝脏感染方面与WT小鼠没有差异(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

其他人的研究表明，MyD88的缺乏与对包括HSV在内的许多病原体的高度易感性有关，HSV感染导致MyD88的严重脑炎gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)．因此，我们检测了myd88缺陷小鼠对全身HSV-2感染的耐药性，并发现了与TLR2/TLR9双缺陷菌株相当的表型(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．这表明TLR2和TLR9共同介导了大脑中对抗HSV-2感染的myd88依赖部分。gydF4y2Ba

为了研究TLR2和TLR9在不同的HSV-2感染模型中的作用，我们转向了生殖器疱疹模型，其中小鼠在阴道内感染导致局部感染，随后扩散到中枢神经系统。这个型号还有TLR2/TLR9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}在病理体征和存活率方面，与WT小鼠相比，WT小鼠对脑炎表现出更高的易感性(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2BaHgydF4y2Ba和gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．关于病毒载量，WT和TLR2/TLR9的阴道洗液和脊髓中的病毒滴度相当gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2BaJgydF4y2Ba和gydF4y2BaKgydF4y2Ba)．相比之下，我们在TLR2/TLR9的脑干中发现了明显更高水平的病毒gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠感染后第7天与WT小鼠比较(图;gydF4y2Ba5gydF4y2BalgydF4y2Ba)．因此，同时缺乏TLR2和TLR9会降低大脑中对HSV-2感染的体内抗性。gydF4y2Ba

由于TLR2/TLR9缺陷仅影响大脑中的病毒载量，而不影响肝脏或阴道，我们检测了阴道感染后小鼠大脑中的局部细胞因子和趋化因子反应。虽然我们没有在感染小鼠的大脑中检测到IFN-α或IFN-β的显著诱导(数据未显示)，但在感染WT小鼠的大脑中，IFN刺激基因(ISG) CXCL9的mRNA水平在第6天上调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．重要的是，在TLR2的大脑中，第6天没有观察到CXCL9的诱导gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}, TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}，或TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。第9天，TLR2的大脑也诱导CXCL9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}在小鼠中，尽管没有达到与WT小鼠相同的程度，并且在缺乏TLR9的小鼠中没有发现诱导。感染WT小鼠在第9天诱导TNF-α mRNA，在TLR2中诱导程度较低gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaBgydF4y2Ba)，而这种诱导在TLR9的大脑中完全被废除gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。因此，HSV-2感染时，大脑中炎症细胞因子和趋化因子的表达同时依赖于TLR2和TLR9。gydF4y2Ba

多项研究表明TLR2和TLR9被HSV成分激活:TLR2被一种未知的病毒粒子分子激活，TLR9被未甲基化的CpG二核苷酸激活(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)．pDCs在先天性HSV识别中的作用已经得到了特别深入的研究，表明这种细胞类型负责HSV诱导骨髓来源细胞中IFN-α的产生，并且pDCs完全依赖于TLR9的这种活性(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)．我们在此表明，在HSV-2感染后，pDCs以外的细胞类型产生I型IFN，这主要是通过tlr9独立机制发生的。此外，在所有测试的细胞类型中，促炎细胞因子和趋化因子的表达都被强烈诱导，TLR2和TLR9以及其他识别系统的明确细胞类型依赖需求(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．然而，我们没有观察到TLR2和TLR9在诱导特定细胞因子方面有明显的协同作用。对于我们的cDCs体外实验，我们使用了GM-CSF分化的BM-DCs以及原发的脾CD11gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPDCAgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞。请注意，其他人先前的研究表明，不同的主要cDC人群在HSV感染期间对TLR9的需求存在差异(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)，因此我们不能得出结论，我们对疾病控制中心的发现是所有疾病控制中心人群的普遍现象。此外，有趣的是，先前报道的TLR2和TLR9在脑转移- dc识别HSV-1中的作用在我们的HSV-2系统中未被观察到(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．因此，我们的数据以及其他研究表明，在HSV感染后，诱发细胞因子反应的PRR需求高度依赖于细胞类型、HSV类型和品系、小鼠品系以及细胞来源的器官(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．最后，体外细胞因子表达的数据证实，只有pDCs完全依赖TLR9来触发IFN型和炎症细胞因子的产生。gydF4y2Ba

目前在体内关于TLR2和TLR9在HSV感染中的作用的研究主要集中在TLR2和TLR9这两种prr之间潜在的协同作用上。对TLR2 KO小鼠的研究表明，与WT小鼠相比，TLR2 KO小鼠对HSV复制的抵抗力没有改变，甚至有所提高，存活率也相当。此外，TLR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠对感染的反应是炎症反应受损(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)．TLR9已在阴道感染模型中进行了检测，几项研究表明，在HSV感染前，局部施用TLR9配体CpG具有保护作用(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)．对于TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}一项研究发现这些老鼠更容易感染HSV-2 (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)，另一项则没有发现差异(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)．同样，这些不同的观察结果可能是由于不同的HSV和小鼠品系，正如已报道的那样(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)．然而，对于这两种单一KO小鼠品系，迄今为止发表的大多数研究均未显示出强烈的抗HSV感染的先天防御表型，迄今为止还没有关于TLR2和TLR9在体内HSV感染中的联合作用的研究(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)．我们发现TLR2/TLR9 DKO小鼠大脑中病毒载量较高，与脑炎症状加重和生存率降低相一致。此外，我们检查了NK细胞的反应，发现感染后脾脏中的堆积减少。最后，我们测量了血清中的细胞因子和趋化因子水平，以评估整个机体的反应，发现DKO血清中所有测量的细胞因子水平都降低了。一些细胞因子仅依赖于一种TLR(例如，TLR9上的IFN-α/β)，但对于体内的完全反应，TLR2和TLR9都是必要的。然而，在DKO小鼠中仍然可以观察到细胞因子的诱导，这表明除了TLR2和TLR9之外，其他PRRs也是全身HSV-2感染的重要因素。TLR3是一种备选方案，因为最近有研究表明TLR3对人类抗HSV脑炎很重要(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)．这种多重TLR依赖性也已在其他病原体中显示出来(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由于病毒载量仅在大脑中检测到增加，我们检测了局部细胞因子mRNA的表达，并发现在WT小鼠的大脑中TNF-α和CXCL9的诱导。大脑中的许多细胞类型以构成和诱导的方式表达TLR2和TLR9，包括小胶质细胞(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)．Lokensgard及其同事已经证明，小胶质细胞在HSV感染后会产生一系列细胞因子，而TLR2在这种反应中起着重要作用(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)．在本研究中，我们观察到TLR2的大脑中TNF-α和CXCL9的诱导减少gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠TLR9未检测到诱导gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和TLR2/9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。因此，hsv诱导的炎症细胞因子和趋化因子在大脑中的表达完全依赖于TLR9，在ISG CXCL9的情况下，这可能是由于IFN-α/β的减少，因为hsv诱导的I型IFN的产生在许多细胞类型中依赖于TLR9 (gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)．CXCL9等isg和TNF-α等炎症因子水平的降低可能有助于在TLR2/TLR9中观察到的表型gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。缺乏I型IFN受体的小鼠在大脑中显示出更高的病毒载量(数据未显示)，并且在生殖器感染HSV-2后比WT小鼠更快地出现中枢神经系统症状(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)．此外，最近有报道称TNF-αgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}还有IL-1βgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠在鼻内感染后对HSV脑炎的保护功能受损(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)．KO小鼠大脑中的病毒载量升高，脑干、脑桥和髓质的特定区域出现假复制。因此，ISGs和炎症基因表达的降低似乎促进了病毒在大脑内的复制和传播，从而造成中枢神经系统的损伤。gydF4y2Ba

MyD88是大多数TLRs的常见适配器分子，除了TLR3 (gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)．鼻内HSV-1感染模型显示MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠会患上致命的脑炎，而WT和TLR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠有抵抗力(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．阴道感染模型MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠也表现出比WT小鼠更低的抵抗力(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)．我们的数据有力地表明，在体内HSV-2感染期间，TLR2和TLR9负责激活myd88依赖的抗hsv活性。Sato和他的同事认为，TLR2和TLR9的这种需求可能是由于树突状细胞对HSV的顺序识别的需要，因为树突状细胞在体内的重要作用已被证明(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)．或者，更符合我们的数据的是，TLR2和TLR9通过更广泛的细胞类型作用，影响多种先天防御机制，共同建立早期宿主对HSV-2的防御。gydF4y2Ba

我们的结果还表明，单个TLRs在不同器官中的作用不同，TLR2/TLR9的病毒载量仅在大脑中升高，而在肝脏和阴道中没有升高gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。在小鼠巨细胞病毒的研究中进行了平行观察，其中早期免疫反应仅在脾脏中依赖TLR9，而在肝脏中不依赖TLR9 (gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)．其原因可能是TLRs在不同器官之间或不同器官内分布不均(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)，此外，不同器官对特定细胞类型的TLR依赖性可能不同(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．在这项研究中，TLR2/TLR9大脑中的病毒载量增加gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}可能是由于病毒进入中枢神经系统之前系统反应不足，或者大脑中病毒复制的控制受损。我们发现WT和TLR2/TLR9gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}阴道感染后，小鼠在阴道和脊髓中显示出类似的病毒载量，但在脑干中却没有，这强烈支持了TLR2和TLR9控制中枢神经系统内HSV复制的结论。与这一结论一致，Sarangi和同事已经证明，病毒在WT、TLR2的大脑中被发现gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}, TLR9识别gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}在角膜HSV-1感染后第4天，但仅在MyD88gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}第7天的小鼠(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)．这表明，尽管到达中枢神经系统的病毒数量与WT小鼠相当，但TLR2和TLR9的缺乏导致局部复制不受控制和随后的致命脑炎。gydF4y2Ba

非常感谢Kirsten Stadel Petersen和Birthe Søby的技术支持。gydF4y2Ba

作者之间没有经济利益冲突。gydF4y2Ba